Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Verrode fluorescentie-geassocieerde β-galactosidase-sonde voor identificatie en verrijking van senescente tumorcellen door flowcytometrie

5.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64176

⸱

13 september 2022

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

In dit artikel

Samenvatting

Een protocol voor fluorescerende, flowcytometrische kwantificering van senescente kankercellen geïnduceerd door chemotherapiegeneesmiddelen in celkweek of in muizentumormodellen wordt gepresenteerd. Optionele procedures omvatten co-immunostaining, monsterfixatie om grote batch- of tijdpuntanalyse te vergemakkelijken en de verrijking van levensvatbare senescente cellen door flowcytometrische sortering.

Samenvatting

Cellulaire senescentie is een toestand van proliferatieve arrestatie veroorzaakt door biologische schade die normaal gesproken in de loop van de jaren oploopt in ouder wordende cellen, maar ook snel kan ontstaan in tumorcellen als reactie op schade veroorzaakt door verschillende kankerbehandelingen. Tumorcelsenescentie wordt over het algemeen als ongewenst beschouwd, omdat senescente cellen resistent worden tegen de dood en tumorremissie blokkeren terwijl tumormaligniteit en behandelingsresistentie worden verergerd. Daarom is de identificatie van senescente tumorcellen van voortdurend belang voor de kankeronderzoeksgemeenschap. Er bestaan verschillende senescentietests, waarvan vele gebaseerd zijn op de activiteit van de bekende senescentiemarker, senescentie-geassocieerde bèta-galactosidase (SA-β-Gal).

Typisch wordt de SA-β-Gal-test uitgevoerd met behulp van een chromogeen substraat (X-Gal) op vaste cellen, met de langzame en subjectieve opsomming van "blauwe" senescente cellen door lichtmicroscopie. Verbeterde testen met behulp van celpermeant, fluorescerende SA-β-Gal substraten, waaronder C12-FDG (groen) en DDAO-Galactoside (DDAOG; verrood), hebben de analyse van levende cellen mogelijk gemaakt en het gebruik van high-throughput fluorescerende analyseplatforms mogelijk gemaakt, inclusief flowcytometers. C12-FDG is een goed gedocumenteerde sonde voor SA-β-Gal, maar de groene fluorescerende emissie overlapt met intrinsieke cellulaire autofluorescentie (AF) die ontstaat tijdens senescentie als gevolg van de accumulatie van lipofuscineaggregaten. Door gebruik te maken van de verrode SA-β-Gal probe DDAOG, kan groene cellulaire autofluorescentie worden gebruikt als een secundaire parameter om senescentie te bevestigen, waardoor betrouwbaarheid aan de test wordt toegevoegd. De resterende fluorescentiekanalen kunnen worden gebruikt voor kleuring van de levensvatbaarheid van cellen of optionele fluorescerende immunolabeling.

Met behulp van flowcytometrie demonstreren we het gebruik van DDAOG en lipofuscine autofluorescentie als een dual-parameter assay voor de identificatie van senescente tumorcellen. Kwantificering van het percentage levensvatbare senescente cellen wordt uitgevoerd. Indien gewenst kan een optionele immunolabelingstap worden opgenomen om antigenen van het celoppervlak van belang te evalueren. Geïdentificeerde senescente cellen kunnen ook flowcytometrisch worden gesorteerd en verzameld voor downstream-analyse. Verzamelde senescente cellen kunnen onmiddellijk worden gelyseerd (bijvoorbeeld voor immunoassays of 'omics-analyse' ) of verder worden gekweekt.

Inleiding

Senescente cellen hopen zich normaal gesproken op in organismen gedurende de jaren tijdens normale biologische veroudering, maar kunnen zich ook snel ontwikkelen in tumorcellen als reactie op schade veroorzaakt door verschillende kankerbehandelingen, waaronder bestraling en chemotherapie. Hoewel ze niet langer prolifereren, kunnen door therapie geïnduceerde senescente (TIS) tumorcellen bijdragen aan de behandelingsresistentie en recidief veroorzaken 1,2,3. Factoren die door TIS-cellen worden uitgescheiden, kunnen de tumormaligniteit verergeren door immuunontwijking of metastasete bevorderen 4,5. TIS-cellen ontwikkelen complexe, contextspecifieke fenotypen, veranderde metabole profielen en unieke immuunresponsen 6,7,8. Daarom is de identificatie en karakterisering van TIS-tumorcellen geïnduceerd door verschillende kankerbehandelingsbenaderingen een onderwerp van voortdurende interesse voor de kankeronderzoeksgemeenschap.

Om TIS-tumorcellen te detecteren, worden conventionele senescentietests op grote schaal gebruikt, voornamelijk gebaseerd op het detecteren van verhoogde activiteit van het senescentiemarkerenzym, het lysosomale bèta-galactosidase GLB19. Detectie bij een bijna neutrale (in plaats van zure) lysosomale pH maakt specifieke detectie van senescentie-geassocieerde bèta-galactosidase (SA-β-Gal)10 mogelijk. Een standaard SA-β-Gal-test die al tientallen jaren wordt gebruikt, gebruikt X-Gal (5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), een blauw chromogeen bèta-galactosidase-substraat, om SA-β-Gal in vaste cellen te detecteren door lichtmicroscopie11. De X-Gal-test maakt de kwalitatieve visuele bevestiging van TIS mogelijk met behulp van algemeen beschikbare reagentia en laboratoriumapparatuur. Een basistransmissielichtmicroscoop is de enige instrumentatie die nodig is om de aanwezigheid van het blauwe chromogeen te evalueren. De X-Gal-kleuringsprocedure kan echter niet gevoelig zijn en soms meer dan 24 uur nodig hebben om de kleur te ontwikkelen. Kleuring wordt gevolgd door een subjectieve score met lage doorvoer van individuele senescente cellen op basis van het tellen van de cellen die een bepaald intensiteitsniveau van het blauwe chromogeen vertonen onder een lichtmicroscoop. Omdat X-Gal celdoordringbaar is, vereist deze test oplosmiddelvaste cellen, die niet kunnen worden teruggewonnen voor downstream-analyse. Bij het werken met beperkte monsters van dieren of patiënten kan dit een groot nadeel zijn.

Verbeterde SA-β-Gal-assays met behulp van celpermeant, fluorescerend enzymsubstraten, waaronder C12-FDG (5-dodecanoylaminofluoresceïne Di-β-D-Galactopyranoside, groen) en DDAOG (9H-(1,3-dichloor-9,9-dimethylacridin-2-one-7-yl) β-D-Galactopyranoside, verrood) zijn eerder in de literatuur verschenen 12,13,14,15. De chemische sondestructuur en optische eigenschappen van DDAOG zijn weergegeven in aanvullende figuur S1. Deze celpermeant sondes maken de analyse van levende (in plaats van vaste) cellen mogelijk, en fluorescerende in plaats van chromogene sondes vergemakkelijken het gebruik van snelle fluorescentieanalyseplatforms met hoge doorvoer, waaronder screeningsinstrumenten met hoge inhoud en flowcytometers. Sorteerstroomcytometers maken het herstel mogelijk van verrijkte populaties van levende senescente cellen uit celculturen of tumoren voor downstream-analyse (bijv. Western blotting, ELISA of 'omics'). Fluorescentieanalyse biedt ook een kwantitatief signaal, waardoor het percentage senescente cellen in een bepaald monster nauwkeuriger kan worden bepaald. Extra fluorescerende sondes, waaronder levensvatbaarheidsondes en fluorofoor-gelabelde antilichamen, kunnen gemakkelijk worden toegevoegd voor multiplexanalyse van doelen buiten SA-β-Gal.

Net als DDAOG is C12-FDG een fluorescerende sonde voor SA-β-Gal, maar de groene fluorescerende emissie overlapt met intrinsieke cellulaire AF, die ontstaat tijdens senescentie als gevolg van de accumulatie van lipofuscine-aggregaten in cellen16. Door gebruik te maken van de verrode DDAOG-sonde kan groene cellulaire AF worden gebruikt als secundaire parameter om senescentie te bevestigen17. Dit verbetert de betrouwbaarheid van de test door een tweede marker te gebruiken naast SA-β-Gal, die vaak onbetrouwbaar kan zijn als een enkele marker voor senescentie18. Omdat de detectie van endogene AF in senescente cellen een labelvrije benadering is, is het een snelle en eenvoudige manier om de specificiteit van onze op DDAOG gebaseerde test uit te breiden.

In dit protocol demonstreren we het gebruik van DDAOG en AF als een snelle, dual-parameter flowcytometrietest voor de identificatie van levensvatbare TIS-tumorcellen uit in vitro culturen of geïsoleerd uit met geneesmiddelen behandelde tumoren die bij muizen zijn vastgesteld (figuur 1). Het protocol maakt gebruik van fluoroforen die compatibel zijn met een breed scala aan standaard commerciële flowcytometrie-analysers en sorteerders (tabel 1). Kwantificering van het percentage levensvatbare senescente cellen met behulp van standaard flowcytometrieanalyse is mogelijk. Indien gewenst kan een optionele immunolabelingstap worden uitgevoerd om antigenen van het celoppervlak gelijktijdig met senescentie te evalueren. Geïdentificeerde senescente cellen kunnen ook worden verrijkt met behulp van de standaard fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) methodologie.

figure-introduction-1
Figuur 1: Experimentele workflow. Een schematische samenvatting van de belangrijkste punten van de DDAOG-test. (A) Een TIS-inducerend geneesmiddel wordt toegevoegd aan gekweekte cellen van zoogdieren of toegediend aan tumordragende muizen. Er wordt dan tijd toegestaan voor het begin van TIS: voor cellen, 4 dagen na de behandeling; voor muizen, 22 dagen in totaal, met drie behandelingen om de 5 dagen plus 7 dagen herstel. Cellen worden geoogst of tumoren worden gedissocieerd in suspensie. (B) Monsters worden behandeld met Baf om de lysosomale pH aan te passen voor detectie van SA-β-Gal gedurende 30 minuten; vervolgens wordt de DDAOG-sonde gedurende 60 minuten toegevoegd om SA-β-Gal te detecteren. Monsters worden 2x gewassen in PBS en een levensvatbaarheidsvlek wordt kort toegevoegd (15 min). Optioneel kunnen monsters worden gekleurd met fluorescerende antilichamen in open fluorescentiekanalen en / of worden gefixeerd voor latere analyse. (C) Monsters worden geanalyseerd met behulp van een standaard flowcytometer. Levensvatbare cellen worden gevisualiseerd in dot plots met rode DDAOG (wat wijst op SA-β-Gal) versus groene autofluorescentie (lipofuscine). Een poort om het percentage TIS-cellen te bepalen wordt vastgesteld op basis van onbehandelde controlemonsters (niet weergegeven). Als een sorteercytometer (FACS) wordt gebruikt, kunnen TIS-cellen worden verzameld en teruggeplaatst in cultuur voor verdere in vitro assays of worden gelyseerd en verwerkt voor moleculaire biologie-assays. Afkortingen: DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; TIS = therapie-geïnduceerde senescentie; FL-Ab = fluorofoor-geconjugeerd antilichaam; Baf = Bafilomycine A1; SA-β-Gal = senescentie-geassocieerde bèta-galactosidase; PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing; FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

FluorofoorDetecteertEx /Em (nm)Cytometerlaser (nm)Cytometer detector / bandpass filter (nm)
DDAOGSA-β-Gal645/6601640670 / 30
AfLipofuscine< 600488525 / 50
Cv450Levensvatbaarheid408/450405450 / 50
PEAntilichaam/oppervlaktemarker565/578561582 / 15

Tabel 1: Fluoroforen en cytometer optische specificaties. Cytometerspecificaties die in dit protocol worden gebruikt, worden vermeld voor een instrument met in totaal 4 lasers en 15 emissiedetectoren. DDAOG gedetecteerd bij 645/660 nm is de vorm van de sonde gesplitst door SA-β-Gal1. Uncleaved DDAOG kan een lage fluorescentie vertonen bij 460/610 nm, maar wordt verwijderd door wasstappen in het protocol. Afkortingen: DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; AF = autofluorescentie; PE = phycoerythrin; SA-β-Gal = senescentie-geassocieerde bèta-galactosidase.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Al het beschreven dierwerk werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Universiteit van Chicago.

1. Bereiding en opslag van voorraadoplossingen

OPMERKING: Als cellen stroomsorteerd worden, moeten alle oplossingen worden bereid met behulp van steriele technieken en gefilterd door een filterapparaat van 0,22 μm.

  1. Bereid een stamoplossing van DDAO-Galactoside op 5 mg/ml dmso. Aliquot bij 50 μL per buis (of gewenst volume). Bewaren bij −20 °C in het donker gedurende maximaal 1 jaar.
  2. Bereid een stamoplossing van Bafilomycine A1 op 1 mM in DMSO. Aliquot bij 50 μL per buis (of gewenst volume). Bewaren bij −20 °C gedurende maximaal 6 maanden.
  3. Bereid een stamoplossing van Calcein Violet 450 AM op 1 mM in DMSO. Aliquot bij 50 μL per buis (of gewenst volume). Bewaren bij −20 °C in het donker gedurende maximaal 1 jaar.
  4. Bereid voor de behandeling van gekweekte cellen in vitro 10 mM geconcentreerde stamoplossingen van senescentie-inducerende stof(fen) in het juiste oplosmiddel en steriliseer met spuitfilters van 0,2 μm. Bewaren bij −20 °C of zoals voorgeschreven door de fabrikant.
    OPMERKING: Voor toediening van senescentie-inducerende chemotherapiemiddelen in vivo (aan muizen met gevestigde tumoren), moeten de middelen USP-kwaliteit zijn en worden verdund tot zoutoplossing uit geconcentreerde bouillon vlak voor injectie.
  5. Bereid een volledig kweekmedium voor op de cellijn(en) die worden gebruikt.
    OPMERKING: Bereid bijvoorbeeld medium voor B16-F10- of A549-cellen met DMEM 1x + 10% FBS + 1x glutaminevervanger + 1x penicilline / streptomycine. Media moeten steriel worden gehouden. Andere cellijnspecifieke mediaformuleringen kunnen worden gebruikt. Bepaalde componenten zoals glutathion kunnen in sommige gevallen interfereren met het begin van senescentie. Empirische tests van verschillende mediaformuleringen moeten worden uitgevoerd als het begin van senescentie lager is dan verwacht of niet wordt waargenomen met controlechemotherapiemiddelen.
  6. Maak vlekken en wasbuffers.
    1. Bereid 1% runderserumalbumine (BSA) in 1x PBS voor gebruik bij kleuringsprocedures. Los 2 g BSA op in 200 ml PBS en roer gedurende 10 minuten, of totdat het volledig is opgelost, bij kamertemperatuur.
    2. Bereid 0,5% BSA in 1x PBS als wasbuffer. Verdun 100 ml van de 1% BSA bereid in stap 1.6.1 in 100 ml 1x PBS voor 0,5% BSA.
    3. Bewaar buffers bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.
  7. Bereid 4% paraformaldehyde in 1x PBS. Gebruik in de handel verkrijgbare, verzegelde paraformaldehyde ampullen (bijv. 16% v/v) voor gemak en stabiliteit: 2,5 ml van 16% PFA + 7,5 ml van 1x PBS (= 10 ml van 4% PFA). Pas het voorbereide volume aan, afhankelijk van het totale volume dat per experiment nodig is.
    OPMERKING: Bereid indien nodig alleen voor celfixatie voor; bereid elke keer vers.
  8. Bereid FACS-sorteerbuffer voor: 1x PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% BSA (pH 7,2). Steriel filter door een filtratieapparaat van 0,22 μm en bewaar het bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.
    OPMERKING: Bereid indien nodig alleen voor FACS-sortering voor. Stromsorteerbufferformuleringen kunnen variëren tussen FACS-instrumenten. De bovenstaande formulering is compatibel met het instrument dat in deze studie wordt gebruikt (zie materiaaltabel). Raadpleeg de richtlijnen van de fabrikant.
  9. Bereid tumordissociatieoplossing: 20 μg/ml Liberase TL + 100 μg/ml DNAse I in RPMI-1640 media (zonder FBS of andere supplementen). Voorraadoplossingen zijn nuttig om Liberase TL (bereid en opgeslagen volgens de aanwijzingen van de fabrikant) en DNAse I (100 mg/ml in dubbel gedestilleerd water [ddH2O], bewaard bij −20 °C) bij de hand te houden.
    OPMERKING: Bereid u voor als u alleen tumoren gebruikt; bereid elke keer vers.

2. Inductie van senescentie door chemotherapiegeneesmiddelen in gekweekte kankercellen

OPMERKING: Alle celmanipulatiestappen in deze sectie moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast met behulp van steriele praktijken. Deze sectie is geschreven voor adherente celtypen. Suspensiecellen kunnen worden gebruikt met de nodige wijzigingen zoals aangegeven.

  1. Kweek kankercellijn(en) volgens het standaardprotocol van de leverancier of het laboratorium dat de specifieke cellijn(en) heeft geleverd.
    OPMERKING: Cellen met een lage doorgang (p < 10) hebben over het algemeen de voorkeur omdat er lagere niveaus van replicatieve senescentie zijn, d.w.z. een lagere achtergrond, in onbehandelde celmonsters.
  2. Een dag voorafgaand aan senescentie-inductie door geneesmiddelen, oogst cellen met trypsine-EDTA 0,25% (of zoals aanbevolen). Neutraliseer trypsine door een gelijk volume compleet kweekmedium toe te voegen en breng de celsuspensie over naar een steriele conische buis.
    OPMERKING: Deze stap is niet nodig voor suspensiecellen.
  3. Tel de cellen met behulp van de standaard hemacytometermethode en registreer cellen / ml. Plaatcellen op 1 × 10 3-10 × 103 cellen/cm2 in standaard 6-well plastic kweekschalen.
    OPMERKING: Optimale platingdichtheid is afhankelijk van de proliferatiesnelheid van cellen en moet door de gebruiker worden bepaald. Cellen moeten zich in logfasegroei bevinden met ongeveer 10% -20% confluency op het moment van de behandeling (d.w.z. na 18-24 uur incubatie na plating). De startdichtheid (cellen/ml) van suspensiecellen moet door de gebruiker worden bepaald. Zesputtenplaten leveren doorgaans voldoende senescente cellen per put op voor één standaard flowcytometrie-analysemonster. Bij stroomsortering moet een veel groter oppervlak (bv. meerdere P150-platen) worden gebruikt om het herstel van voldoende aantallen senescente cellen voor downstream-assays mogelijk te maken (≥1 × 106).
  4. Incubeer vergulde cellen 's nachts (18-24 uur) in een incubator van 37 °C met 5% CO2 en een vochtigheidspan.
  5. Behandel de vergulde cellen met senescentie-inducerende chemotherapiegeneesmiddel(en). Neem ten minste één positieve controle op, bijvoorbeeld etoposide (ETO) of bleomycine (BLM). Bereid dubbele putten per medicijn voor. Voeg één set toe die is behandeld met alleen het voertuig als besturing.
    OPMERKING: Een dosiscurve voor elk experimenteel middel moet door de gebruiker worden getest om de optimale concentratie voor senescentie-inductie in de gebruikte cellijn(en) te bepalen.
  6. Incubeer cellen gedurende 4 dagen in een incubator van 37 °C met 5% CO2 en een vochtigheidspan om het begin van senescentie mogelijk te maken. Onderzoek dagelijks op verwachte morfologische veranderingen met behulp van een lichtmicroscoop.
    OPMERKING: Incubatietijden van 3-5 dagen kunnen acceptabel zijn, afhankelijk van de snelheid waarmee senescentie begint. Media kunnen worden veranderd en het middel kan opnieuw worden aangebracht (of niet), naar wens, om gezonde groeiomstandigheden te bevorderen en tegelijkertijd een aanvaardbaar percentage senescente cellen te bereiken.
  7. Na het begin van de senescentie, oogst de cellen door trypsine-EDTA 0,25% toe te voegen gedurende 5 minuten bij 37 °C. Wanneer cellen worden gedissocieerd in suspensie, neutraliseer trypsine met een gelijk volume van het volledige medium.
    OPMERKING: Deze stap is niet nodig voor cellen die in suspensie groeien. Als oppervlaktemarkerkleuring wordt uitgevoerd, vermijd dan het gebruik van trypsine-EDTA, omdat dit tijdelijk oppervlakteantigenen op cellen kan vernietigen. Dissociëer in plaats daarvan de monolaag voorzichtig met behulp van een steriele plastic celschraper (of een alternatief dissociatiereagens dat is ontworpen om oppervlakteantigenen te behouden).
  8. Tel de cellen in elk monster met behulp van een hemacytometer. Bereken de cellen/ml voor elk monster.
    OPMERKING: Trypan blue kan worden toegevoegd om het percentage dode cellen op dit punt te evalueren (d.w.z. als gevolg van medicamenteuze behandeling), maar celdood zal ook worden bepaald met een fluorescerende levensvatbaarheidskleurstof tijdens DDAOG-kleuringsworkflow.
  9. Aliquot ≥0,5 × 106 cellen per monster in microcentrifugebuizen van 1,7 ml.
    OPMERKING: Het aantal cellen per monster moet worden gestandaardiseerd voor alle monsters.
  10. Centrifugeer de buizen gedurende 5 minuten bij 1.000 × g in een microcentrifuge bij 4 °C. Verwijder het supernatant.
    OPMERKING: Als een gekoelde microcentrifuge niet beschikbaar is, kan het acceptabel zijn om centrifugeeringen uit te voeren bij omgevingstemperatuur voor bepaalde veerkrachtige celtypen.
  11. Ga verder met DDAOG-kleuring in sectie 4.

3. Inductie van senescentie door chemotherapiegeneesmiddelen bij tumoren bij muizen

OPMERKING: Als tumorcellen FACS-gesorteerd zullen zijn, zorg dan voor steriliteit bij elke stap door in een bioveiligheidskast te werken en te werken met steriele instrumenten, procedures en reagentia.

  1. Maak muistumormodellen door kankercellen subcutaan te injecteren, volgens standaardmethoden (bijv. Appelbe et al.19).
    OPMERKING: Het aantal kankercellen dat moet worden geïnjecteerd, de injectieplaats en de juiste muizenstam moeten voor elk protocol worden geoptimaliseerd. Hier werden B16-F10-cellen subcutaan geïnjecteerd op 1 × 106 cellen in 0,1 ml zoutoplossing (1 × 107 cellen / ml).
    1. Controleer of de levensvatbaarheid van cellen die trypan blue gebruiken >90% is voordat injecties worden uitgevoerd. Verdoof de muizen met isofluraan.
    2. Verdoof 6-7 weken oude vrouwelijke C57/BL6 muizen met een mix van 3% isofluraan en lucht en onderhoud onder deze omstandigheden in een inductiekamer in een steriele bioveiligheidskast. Bevestig de anesthesie door zachtjes in de voet van de muis te knijpen. Breng steriele veterinaire zalf aan op beide ogen om uitdroging van het hoornvlies tijdens de procedure te voorkomen. Houd tijdens de procedure de lichaamstemperatuur van de muis op peil met behulp van een verwarmingslamp.
    3. Werk in een steriele bioveiligheidskast en verwijder de muis uit de inductiekamer en plaats hem in contact met een neuskegel die een isofluraantoevoer van 3% biedt. Scheer het flankgebied op de injectieplaats met een schoon elektrisch scheermes. Meng de bereide celsuspensie kort door de buis vlak voor de injectie handmatig om te keren en injecteer de celsuspensie subcutaan in de geschoren flank(en) met behulp van een steriele spuit van 0,5 ml met een steriele naald van 27 G. Haal de muis van de kap en breng deze over naar de herstelkooi.
    4. Controleer in de herstelkooi continu de vitale functies van de muizen totdat ze voldoende bewustzijn hebben herwonnen om sternale lighouding te behouden, de rechtzettingsreflex te demonstreren en veilig in de kooi te kunnen bewegen. Laat muizen niet onbeheerd achter en breng geen dieren terug die tumorcelinenting hebben ondergaan naar het gezelschap van andere dieren totdat ze volledig zijn hersteld. Controleer alle geënte muizen dagelijks op gewichtsverlies, verminderde activiteit / mobiliteit en neurologische symptomen; euthanaseer muizen die ernstige symptomen vertonen in elke categorie. Voor muizen die pijnsymptomen vertonen na inenting, dient u buprenorfine (0,1-0,2 mg /kg) eenmaal subcutaan toe.
      OPMERKING: Muizen die aanhoudende pijn vertonen na buprenorfine moeten worden geëuthanaseerd.
  2. Begin 5-7 dagen na de inenting van kankercellen en meet de tumorgroei met remklauwen om de 2-3 dagen. Start een prosenescente behandeling wanneer de tumor 50 mm3 ± 10 mm3 in volume heeft bereikt.
    OPMERKING: In dit werk werden doses USP-kwaliteit doxorubicinehydrochloride (DOX) of PEGylated liposomale doxorubicine (PLD) van 10 mg / kg toegediend in 0,9% natriumchloride-injectie (USP). Geneesmiddelen werden intraperitoneaal 3x geïnjecteerd, eenmaal per 5 dagen, beginnend wanneer tumoren 50 mm3 ± 10 mm3 bereikten. Muizen herstelden gedurende 7 dagen na de laatste behandeling om het begin van TIS in tumoren mogelijk te maken. Senescentie-inductiedoseringen en voorwaarden voor andere behandelingen en / of tumormodellen moeten worden geoptimaliseerd.
  3. Na 7 dagen na de laatste medicamenteuze behandeling offeren de muizen op door een overdosis CO2 en cervicale dislocatie of andere goedgekeurde methoden in overeenstemming met de richtlijnen voor het werk van proefdieren. Snijd de tumoren weg en verzamel ze in steriele buizen of 6-well platen gevuld met steriel RPMI-groeimedium (om de levensvatbaarheid tijdens de verwerking te behouden).
    OPMERKING: Bij het uitvoeren van een histologisch onderzoek (bijv. X-Gal of immunohistochemie), kunnen tumoren hier worden doorsneden, waarbij een halve snap-frozen in O.C.T. insluitmedium en gecryopiceerd met behulp van standaardprocedures voor bevroren weefselhistologie. De resterende tumorhelft moet overvloedig materiaal opleveren voor dissociatie en DDAOG-kleuring.
  4. Breng één tumor over naar een P100 plastic schaal met 5 ml RPMI-medium. Gehakt de tumor in stukjes met behulp van een scalpel.
  5. Breng 5 ml van de suspensie van tumorstukken met gesuspendeerde cellen en puin over in een conische buis van 15 ml. Gebruik de bredere punt van een serologische pipet van 25 ml voor het overbrengen van deze suspensie als er veel vuil aanwezig is. Spoel de schaal af met een extra volume steriel RPMI om materialen te verzamelen. Sluit af en plaats de conische buis op ijs.
  6. Herhaal stap 3.45-3.5 voor de resterende tumoren. Gebruik een aparte plaat en scalpel voor elke tumor om kruisbesmetting te voorkomen, of spoel goed met PBS tussen tumoren. Gebruik 5 ml vers medium voor het fijnhakken van elke tumor.
  7. Bereid de tumordissociatieoplossing: 20 μg/ml Liberase TL + 100 μg/ml DNAse I in RPMI-1640 media (zonder FBS).
    OPMERKING: Er bestaan veel effectieve formuleringen voor tumordissociatieoplossingen en kunnen een verscheidenheid aan enzymen en andere componenten van verschillende fabrikanten bevatten. Optimale concentraties van componenten kunnen sterk variëren tussen tumortypen. Als rode bloedcellen sterk aanwezig zijn in de tumor, kan rode bloedcellysis aanvullend worden uitgevoerd; als dode cellen een probleem zijn, kan een dode celverwijderingskit worden gebruikt. Het wordt ten zeerste aanbevolen voor de gebruiker om onafhankelijk optimale tumordissociatiecondities te bepalen die een hoge levensvatbaarheid en lage aanwezigheid van verontreinigende cellen, bindmateriaal en puin bieden.
  8. Centrifugeer alle tumormonsters in conische buizen gedurende 5 minuten bij 1.000 × g (4 °C). Verwijder het supernatant.
  9. Voeg 1-5 ml tumordissociatieoplossing toe aan elk tumormonster, afhankelijk van het volume tumormateriaal. Zorg ervoor dat er 1-2 ml meer is dan de tumormateriaalkorrel in de buis. Vortex met een gematigde snelheid om te mengen.
  10. Plaats de monsters in een incubator van 37 °C met snelle rotatie gedurende 45 minuten. Vortex kort om de 15 min.
  11. Filtreer elk monster door een celzeef van 100 μm in een conische buis van 50 ml. Als de monsters te stroperig zijn om door het filter te gaan, voeg dan 10 ml RPMI-1640 medium toe om te verdunnen. Spoel de filters af met RPMI-medium om de restcellen op te vangen.
  12. Gebruik een hemacytometer om de cellen/ml voor elk monster te tellen.
  13. Aliquot twee of meer replicaties van 5 × 106 cellen per tumormonster.
  14. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1.000 × g (4 °C). Verwijder het supernatant.
  15. (Optioneel) Cryopreserveer de tumormonsters voor latere DDAOG-kleuring indien gewenst.
    1. Resuspensie van de gedissocieerde tumorcelpellet in cryopreservatiemedium: 50% FBS, 40% RPMI-1640, 10% DMSO, bereid onder steriele omstandigheden bij 5 × 106 cellen / ml.
    2. Aliquot 1 ml celsuspensie in elk cryoviaal.
    3. Vries de cryovialen gedurende 24 uur in een isopropanolcelbevriezingscontainer bij −80 °C; breng vervolgens over naar cryoopslag van vloeibare stikstof voor opslag op langere termijn (>1 week).
    4. Wanneer kleuring gewenst is, ontdooit u de cryovialen op ijs en gaat u over tot DDAOG-kleuring in sectie 4.
      OPMERKING: Sommige tumoren blijven mogelijk niet levensvatbaar door cryopreservatie en de veerkracht tegen dit proces moet door de gebruiker worden geëvalueerd voor het tumormodel van belang.
  16. Ga verder met sectie 4 voor DDAOG-kleuring.

4. DDAOG-kleuring van SA-β-Gal in cel- of tumormonsters

  1. Verdun 1 mM Bafilomycine A1-bouillon op 1:1.000x in DMEM-medium (zonder FBS) voor een eindconcentratie van 1 μM.
  2. Voeg bereide Baf-DMEM-oplossing toe aan de celpelletmonsters (uit stap 2.11 of stap 3.16) voor een concentratie van 1 × 106 cellen/ml.
    OPMERKING: Als u bijvoorbeeld 0,5 × 106 cellen per monster gebruikt, voegt u 0,5 ml Baf-DMEM toe. Voor tumoren kunnen 5 × 106 cellen worden gekleurd in 5 ml Baf-DMEM.
  3. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C (zonder CO2) op een rotator/shaker die met een lage snelheid is ingesteld.
    OPMERKING: Vermijd CO2-incubatoren voor het kleuringsproces, die oplossingen kunnen verzuren en daardoor Baf- en DDAOG-kleuring kunnen verstoren.
  4. Voeg zonder wassen de DDAOG-stamoplossing (5 mg/ml) van 1:500x (10 μg/ml final) toe aan elk monster. Pipet om te mengen. Vervang op een rotator/shaker bij 37 °C (zonder CO2) gedurende 60 min. Bescherm tegen direct licht.
  5. Centrifugeer de buizen gedurende 5 minuten bij 1.000 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant.
  6. Was met 1 ml ijskoude 0,5% BSA per tube en pipet om te mengen. Centrifugeer de buizen gedurende 5 minuten bij 1.000 x g bij 4 °C en verwijder het supernatant. Herhaal deze stap 2x om de cellen grondig te wassen. Verwijder het supernatant en ga verder.
    OPMERKING: Het is belangrijk om de wasstappen in stap 4.6 uit te voeren om ongespoelde DDAOG te verwijderen, die ongewenste fluorescentie-emissie (460/610 nm) kan vertonen.
    OPMERKING: Als immunostaining voor celoppervlakmarkers is, ga dan verder met rubriek 5 hieronder.
  7. (Optioneel) Fixatie en opslag van DDAOG-gekleurde cellen voor latere analyse
    1. Voeg 0,5 ml ijskoude 4% paraformaldehyde druppelsgewijs toe aan elk gewassen monster. Pipet om te mengen.
    2. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Was de cellen 2x met 1 ml PBS.
    4. Bewaar de monsters gedurende maximaal 1 week bij 4 °C voorafgaand aan de flowcytometrieanalyse.
      OPMERKING: Voor vaste monsters slaat u stap 4.8 over.
  8. Verdun Calcein Violet 450 AM stock (1 mM) op 1:1.000x tot 1% BSA-PBS (1 μM final). Voeg 300 μL (voor gekweekte celmonsters) of 1.000 μL (voor tumormonsters) toe aan de gewassen celpellets uit stap 4.6. Incubeer gedurende 15 minuten op ijs in het donker.
  9. Ga verder met het instellen van flowcytometrie (sectie 6).

5. (Optioneel) Immunostaining voor celoppervlakmarkers in combinatie met DDAOG

OPMERKING: Zoals bij elk flowcytometrie-experiment, moeten enkelgekleurde controlemonsters met alleen DDAOG en alleen fluorescerend antilichaam worden voorbereid om kruisverwijzing (indien aanwezig) over fluorescentiekanalen te bepalen. Als overspraak wordt waargenomen, moet standaard flowcytometriecompensatie worden uitgevoerd20.

  1. Resuspendatie van de celpellets verkregen in stap 4.6 in 100 μL kleuringsbuffer (1% BSA in 1x PBS).
  2. Voeg het fc-receptorblokkerende reagens toe dat geschikt is voor de celsoort (muis of mens) bij de door de fabrikant aanbevolen titratie. Incubeer gedurende 10 min bij 24 °C.
  3. Voeg fluorofoor-geconjugeerde antilichamen toe bij de titratie die door de fabrikant wordt aanbevolen (of door de gebruiker wordt bepaald). Incubeer gedurende 20 minuten op ijs, beschermd tegen licht.
  4. Centrifugeer de buizen gedurende 5 minuten bij 1.000 × g bij 4 °C. Verwijder het supernatant.
  5. Was met 1 ml ijskoude wasbuffer (0,5% BSA-PBS) per tube en pipet om te mengen. Centrifugeer de buizen gedurende 5 minuten bij 1.000 × g bij 4 °C en verwijder het supernatant. Herhaal deze stap 2x om de cellen grondig te wassen.
  6. Verdun 1 mM Calcein Violet 450 AM op 1:1.000x in 1% BSA-PBS. Voeg 300 μL toe aan de gewassen celpellets uit stap 5.5. Incubeer gedurende 15 minuten op ijs in het donker.
  7. Ga verder met de flowcytometrieanalyse (rubrieken 6-7).

6. Flowcytometer instellen en data-acquisitie

  1. Breng de celmonsters over naar buizen die compatibel zijn met het flowcytometrie-instrument. Plaats de buizen op ijs en houd ze beschermd tegen licht.
    OPMERKING: Als aggregaten worden waargenomen in de celsuspensies, passeer de suspensie dan door 70-100 μm celstammen voorafgaand aan de analyse. Gebruik geen 40 μm strainers omdat deze enkele van de grotere senescente cellen kunnen uitsluiten.
  2. Open in de software waarnaar verwezen wordt (zie de tabel met materialen) de volgende plots: 1) FSC-A vs SSC-A dot plot, 2) violet kanaal histogram, 3) verrood kanaal (bijv. APC-A) versus groen kanaal (bijv. FITC-A) dot plot.
    OPMERKING: Doublet-uitsluitingsplots en enkelkanaals histogrammen kunnen ook worden gebruikt, maar zijn niet strikt vereist.
  3. Start cytometer data acquisitie.
    1. Plaats het met DDAOG gekleurde controlemonster voor alleen het voertuig op de inlaatpoort. Begin bij een lage innamesnelheid met het verkrijgen van monstergegevens.
    2. Pas FSC- en SSC-spanningen aan zodat >90% van de gebeurtenissen zich in het perceel bevinden. Als cellen niet goed op de plot passen, verlaagt u de instelling voor het schalen van het gebied naar 0,33-0,5 eenheden.
    3. Verwijder het monster dat alleen voor voertuigen beschikbaar is zonder gegevens op te nemen.
    4. (Optioneel) Voeg een druppel regenboogkalibratiemicrosferen toe aan een cytometerbuis met 1 ml PBS. Plaats de buis op de inlaatpoort van de cytometer. Begin met het verzamelen van voorbeeldgegevens.
    5. Pas violette, groene en verrode kanaalspanningen aan zodat de bovenste piek van de regenboogmicrosfeer in het bereik van 10 4-10 5 eenheden relatieve fluorescentie in elk kanaal ligt en alle pieken in elk kanaal goed gescheiden zijn. Record 10.000 evenementen. Verwijder de buis.
  4. Plaats het positieve controlemonster (bijv. BLM, ETO) gekleurd met DDAOG op de inlaatpoort. Verzamel met een lage snelheid voorbeeldgegevens. Observeer de gebeurtenissen in FSC-, SSC-, violette, groene en verrode kanalen om ervoor te zorgen dat meer dan 90% van de gebeurtenissen zich in alle percelen bevindt. Zoek naar een toename van AF- en DDAOG-signaal versus alleen-voertuigbesturing.
  5. Als u een sorteercytometer gebruikt, begint u met sorteren bij deze stap.
    1. Registreer voor archiveringsdoeleinden 10.000 cellen voor het controlemonster en elk gesorteerd monster.
    2. Sorteer de gewenste hoeveelheid cellen (≥1 × 106 is meestal geschikt) in een instrument-geschikte verzamelbuis met 3-5 ml kweekmedium.
    3. Ga na het sorteren verder met downstream cultuur of analyse.
    4. Ga naar sectie 7 voor de routineanalyse van gesorteerde monsters.
  6. Als u fluorescerende antilichamen gebruikt, optimaliseer dan hier de kanaalspanningen met behulp van de niet-gekleurde, enkelgekleurde en dubbelgekleurde monsters die in rubriek 5 zijn voorbereid.
    OPMERKING: Voor de gekalibreerde flowcytometer die hierin wordt gebruikt, daalden de optimale kanaalspanningen meestal tussen 250 en 600 (middenbereik), maar de optimale spanningen en kanaalspanningsbereiken zullen variëren tussen instrumenten. Vermijd het gebruik van spanningen op zeer lage of hoge bereiken, die het signaal kunnen onderdrukken of ruis kunnen versterken.
  7. Nadat u stap 6.1-6.5 hebt voltooid en indien nodig de cytometerinstellingen hebt aangepast, registreert u gegevens voor alle monsters. Zorg ervoor dat de instellingen uniform blijven voor alle voorbeeldopnamen. Registreer ≥10.000 gebeurtenissen per gekweekt celmonster of ≥100.000 gebeurtenissen per tumorcelmonster.
    OPMERKING: Hoewel gating en analyse kunnen worden uitgevoerd met behulp van data-acquisitiesoftware (bijv. FACSDiva), wordt een volledige gating- en analyseworkflow die na acquisitie moet worden uitgevoerd met behulp van afzonderlijke analysesoftware (FlowJo) beschreven in sectie 7 hieronder. Post-acquisitie analyse heeft de voorkeur om de tijd op het cytometerwerkstation te verkorten en te profiteren van extra tools die zijn opgenomen in de speciale analysesoftware.
  8. Sla voorbeeldgegevens op in FCS-bestandsindeling. Exporteer de bestanden naar een werkstationcomputer die is uitgerust met flowcytometrie-analysesoftware (bijv. FlowJo). Ga verder met sectie 7.

7. Flowcytometrie data-analyse

OPMERKING: De gepresenteerde workflow maakt gebruik van FlowJo-software. Alternatieve flowcytometriegegevensanalysesoftware kan worden gebruikt als de belangrijkste stappen die in deze sectie worden beschreven, op dezelfde manier worden gevolgd.

  1. Gebruik de FlowJo-software om .fcs-gegevensbestanden te openen vanaf stap 6.7.
  2. Open het lay-outvenster.
  3. Sleep alle voorbeelden naar het lay-outvenster.
  4. Poort levensvatbare cellen.
    1. Dubbelklik eerst op de voorbeeldgegevens voor het besturingselement alleen voor voertuigen om het gegevensvenster te openen.
    2. Visualiseer de gegevens als een violet kanaal histogram. Identificeer de levensvatbare cellen gekleurd door CV450 op basis van hun helderdere fluorescentie dan de dode cellen.
    3. Teken een poort met het histogramgereedschap met één poort om alleen levensvatbare cellen op te nemen. Noem de poort levensvatbaar.
    4. Sleep vervolgens vanuit het voorbeeldindelingsvenster de levensvatbare poort naar de andere celmonsters om de poort uniform toe te passen.
    5. Visualiseer in het lay-outvenster alle voorbeelden als violette kanaal (levensvatbaarheid) histogrammen. Controleer of levensvatbare celgatering geschikt is voor monsters voordat u verdergaat; zo niet, breng dan indien nodig aanpassingen aan.
      OPMERKING: Levensvatbaarheidskleuring kan variaties vertonen tussen behandelingen of tumoren.
  5. Poort senescente cellen.
    1. Dubbelklik op de gated viable cell data voor de vehicle-only control om het datavenster te openen.
    2. Visualiseer de gegevens als een dot plot voor far-red channel (DDAOG) versus green channel (AF).
    3. Teken een poort met het gereedschap rechthoekige gating om <5% cellen op te nemen die DDAOG+ en AF+ (kwadrant rechtsboven) zijn. Noem de poort senescent.
    4. Sleep vervolgens vanuit het voorbeeldindelingsvenster de senescente poort naar de levensvatbare subsets van de andere celmonsters om de poort uniform toe te passen.
    5. Sleep in het lay-outvenster alle levensvatbare celsubsets die zijn afgeschermd in sectie 7.4. Visualiseer alle levensvatbare monsters als ver-rood (bijv. APC-A) versus groene kanaal (bijv. FITC-A) dot plots.
    6. Zorg ervoor dat de in stap 7.5.3 getekende senescente poort zichtbaar is op alle percelen en dat de poort voor de besturing alleen voor voertuigen ≤5% -10% senescente cellen vertoont.
  6. Zodra het percentage senescente cellen is bepaald met behulp van de bovenstaande stappen, presenteert u de resulterende gegevens met behulp van de FlowJo-plots, samengevat in een gegevenstabel en / of statistisch geanalyseerd met behulp van standaardsoftware.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Verschillende experimenten werden uitgevoerd om de vergelijkbaarheid van DDAOG met X-Gal en C12-FDG aan te tonen voor de detectie van senescentie door SA-β-Gal. Eerst werd X-Gal gebruikt om senescente B16-F10 melanoomcellen geïnduceerd door ETO te kleuren (figuur 2A). Een intense blauwe kleur ontwikkelde zich in een subset van met ETO behandelde cellen, terwijl andere cellen minder intense blauwe kleuring vertoonden. Morfologie werd vergroot in de meeste met ETO behandelde cellen....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In de afgelopen tien jaar is flowcytometrie een gebruikelijker testplatform geworden in kankeronderzoek vanwege de opkomende populariteit van tumorimmunologie, de ontwikkeling van goedkopere flowcytometers en de verbetering van gedeelde instrumentatiefaciliteiten bij academische instellingen. Multicolor assays zijn nu standaard, omdat de meeste nieuwere instrumenten zijn uitgerust met violette, blauwgroene en rode tot verrode optische arrays. Dit DDAOG-protocol is dus waarschijnlijk compatibel met een breed scala aan flo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden voor deze studie.

Dankbetuigingen

We bedanken de Cytometry and Antibody Core Facility van de Universiteit van Chicago voor de ondersteuning bij flowcytometrie-instrumentatie. Het Animal Research Center van de Universiteit van Chicago zorgde voor dierenhuisvesting.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bafilomycin A1Research Products InternationalB40500
Bleomycin sulfaat Cayman13877
Bovine serum albumine (BSA)US BiologicalA1380
Calcein Violet 450 AM levensvatbaarheidskleurstofThermoFisher Scientific65-0854-39eBioscience
DPP4-antilichaam, PE-conjugaatBiolegend137803Clone H194-112
Cellijn: A549 menselijke longadenocarcinoomAmerican Type Culture CollectionCCL-185
Cellijn: B16-F10 muismelanoomAmerican Type Culture CollectionCRL-6475
CelschraperCorning3008
Celzeefjes, 100 µmFalcon352360
DDAO-GalactosideLife TechnologiesD6488
DMEM-medium 1xLife Technologies11960-069
DMSOSigmaD2438
DNAse ISigmaDN25
Doxorubicine, hydrochloride-injectie (USP)PfizerNDC 0069-3032-20
Doxorubicine, PEG-gelipide (USP)Sun PharmaceuticalNDC 47335-049-40
EDTA 0,5 MLife Technologies15575-038
Etoposide Cayman12092
FBSOmega FB-11
Fc-receptorblokkeringsreagensBiolegend101320Anti-muis CD16/32
Flowcytometer (celanalyser)Becton Dickinson (BD)VerschillendeLSRFortessa
Flowcytometer (celsorteerder)Becton Dickinson (BD)VerschillendeFACSAria
GlutaMax 100xLife Technologies35050061
HEPES 1 MLonzaBW17737
Liberase TLSigma5401020001Roche
Paraformaldehyde 16%Electron Microscopy Sciences15710
Penicilline/Streptomycine 100xLife Technologies15140122
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 1xCorningMT21031CVDulbecco's PBS (zonder calcium en magnesium)
Rainbow kalibratiedeeltjes, ultrakitSpheroTechUCRP-38-2K3,5-3,9 µm, 2E6/mL
RPMI-1640 medium 1xLife Technologies11875-119
Natriumchloride 0,9% (USP)Baxter Healthcare Corporation2B1324
Software voor cytometergegevensverwerving, "FACSDiva"Becton Dickinson (BD)n/aContact BD voor licentie
Software voor cytometergegevensanalyse, "FlowJo"TreeStarn/aContact TreeStar voor licentie
Trypsine-EDTA 0,25%Life Technologies25200-114

Referenties

  1. Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy. Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).
  2. Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent cells in cancer therapy: friends or foes. Trends in Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).
  3. Prasanna, P. G., et al. Therapy-induced senescence: Opportunities to improve anticancer therapy. Journal of the National Cancer Institute. 113 (10), 1285-1298 (2021).
  4. Velarde, M. C., Demaria, M., Campisi, J. Senescent cells and their secretory phenotype as targets for cancer therapy. Interdisciplinary Topics in Gerontology and Geriatrics. 38, 17-27 (2013).
  5. Ou, H. L., et al. Cellular senescence in cancer: from mechanisms to detection. Molecular Oncology. 15 (10), 2634-2671 (2021).
  6. Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. Hallmarks of cellular senescence. Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).
  7. Bojko, A., Czarnecka-Herok, J., Charzynska, A., Dabrowski, M., Sikora, E. Diversity of the senescence phenotype of cancer cells treated with chemotherapeutic agents. Cells. 8 (12), 1501(2019).
  8. Mikuła-Pietrasik, J., Niklas, A., Uruski, P., Tykarski, A., Książek, K. Mechanisms and significance of therapy-induced and spontaneous senescence of cancer cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (2), 213-229 (2020).
  9. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  10. Itahana, K., Itahana, Y., Dimri, G. P. Colorimetric detection of senescence-associated β galactosidase. Methods in Molecular Biology. 965, 143-156 (2013).
  11. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  12. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  13. Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
  14. Tung, C. -H., et al. In vivo imaging of β-galactosidase activity using far red fluorescent switch. Cancer Research. 64 (5), 1579-1583 (2004).
  15. Gong, H., et al. beta-Galactosidase activity assay using far-red-shifted fluorescent substrate DDAOG. Analytical Biochemistry. 386 (1), 59-64 (2009).
  16. Terman, A., Brunk, U. T. Lipofuscin: Mechanisms of formation and increase with age. APMIS. 106 (2), 265-276 (1998).
  17. Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging. 5 (1), 37-50 (2013).
  18. Wang, B., Demaria, M. The quest to define and target cellular senescence in cancer. Cancer Research. 81 (24), 6087-6089 (2021).
  19. Appelbe, O. K., Zhang, Q., Pelizzari, C. A., Weichselbaum, R. R., Kron, S. J. Image-guided radiotherapy targets macromolecules through altering the tumor microenvironment. Molecular Pharmaceutics. 13 (10), 3457-3467 (2016).
  20. Maciorowski, Z., Chattopadhyay, P. K., Jain, P. Basic multicolor flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 117, 1-38 (2017).
  21. Fan, Y., Cheng, J., Zeng, H., Shao, L. Senescent cell depletion through targeting BCL-family proteins and mitochondria. Frontiers in Physiology. 11, 593630(2020).
  22. Kim, K. M., et al. Identification of senescent cell surface targetable protein DPP4. Genes and Development. 31 (15), 1529-1534 (2017).
  23. Flor, A. C., Kron, S. J. Lipid-derived reactive aldehydes link oxidative stress to cell senescence. Cell Death Discovery. 7 (9), 2366(2016).
  24. Jochems, F., et al. The Cancer SENESCopedia: A delineation of cancer cell senescence. Cell reports. 36 (4), 109441(2021).
  25. Fallah, M., et al. Doxorubicin and liposomal doxorubicin induce senescence by enhancing nuclear factor kappa B and mitochondrial membrane potential. Life Sciences. 232, 116677(2019).
  26. Kasper, M., Barth, K. Bleomycin and its role in inducing apoptosis and senescence in lung cells - modulating effects of caveolin-1. Current Cancer Drug Targets. 9 (3), 341-353 (2009).
  27. Muthuramalingam, K., Cho, M., Kim, Y. Cellular senescence and EMT crosstalk in bleomycin-induced pathogenesis of pulmonary fibrosis-an in vitro analysis. Cell Biology International. 44 (2), 477-487 (2020).
  28. Flor, A. C., Wolfgeher, D., Wu, D., Kron, S. J. A signature of enhanced lipid metabolism, lipid peroxidation and aldehyde stress in therapy-induced senescence. Cell Death Discovery. 3, 17075(2017).
  29. Burd, C. E., et al. Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model. Cell. 152 (1-2), 340-351 (2013).
  30. Liu, J. Y., et al. Cells exhibiting strong p16 (INK4a) promoter activation in vivo display features of senescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2603-2611 (2019).
  31. Wang, L., Lankhorst, L., Bernards, R. Exploiting senescence for the treatment of cancer. Nature Reviews Cancer. 22 (6), 340-355 (2022).
  32. Baek, K. -H., Ryeom, S. Detection of oncogene-induced senescence in vivo. Methods in Molecular Biology. 1534, 185-198 (2017).
  33. González-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Muñoz-Espín, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

B tagalactosidase assayver rood fluorescentieDDAOG probecellulaire senescentietherapie ge nduceerde senescentiecel sorterendetectie van autofluorescentiekankercellijnen
Verrode fluorescentie-geassocieerde β-galactosidase-sonde voor identificatie en verrijking van senescente tumorcellen door flowcytometrie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.