Een protocol voor fluorescerende, flowcytometrische kwantificering van senescente kankercellen geïnduceerd door chemotherapiegeneesmiddelen in celkweek of in muizentumormodellen wordt gepresenteerd. Optionele procedures omvatten co-immunostaining, monsterfixatie om grote batch- of tijdpuntanalyse te vergemakkelijken en de verrijking van levensvatbare senescente cellen door flowcytometrische sortering.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Verrode fluorescentie-geassocieerde β-galactosidase-sonde voor identificatie en verrijking van senescente tumorcellen door flowcytometrie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cellulaire senescentie is een toestand van proliferatieve arrestatie veroorzaakt door biologische schade die normaal gesproken in de loop van de jaren oploopt in ouder wordende cellen, maar ook snel kan ontstaan in tumorcellen als reactie op schade veroorzaakt door verschillende kankerbehandelingen. Tumorcelsenescentie wordt over het algemeen als ongewenst beschouwd, omdat senescente cellen resistent worden tegen de dood en tumorremissie blokkeren terwijl tumormaligniteit en behandelingsresistentie worden verergerd. Daarom is de identificatie van senescente tumorcellen van voortdurend belang voor de kankeronderzoeksgemeenschap. Er bestaan verschillende senescentietests, waarvan vele gebaseerd zijn op de activiteit van de bekende senescentiemarker, senescentie-geassocieerde bèta-galactosidase (SA-β-Gal).
Typisch wordt de SA-β-Gal-test uitgevoerd met behulp van een chromogeen substraat (X-Gal) op vaste cellen, met de langzame en subjectieve opsomming van "blauwe" senescente cellen door lichtmicroscopie. Verbeterde testen met behulp van celpermeant, fluorescerende SA-β-Gal substraten, waaronder C12-FDG (groen) en DDAO-Galactoside (DDAOG; verrood), hebben de analyse van levende cellen mogelijk gemaakt en het gebruik van high-throughput fluorescerende analyseplatforms mogelijk gemaakt, inclusief flowcytometers. C12-FDG is een goed gedocumenteerde sonde voor SA-β-Gal, maar de groene fluorescerende emissie overlapt met intrinsieke cellulaire autofluorescentie (AF) die ontstaat tijdens senescentie als gevolg van de accumulatie van lipofuscineaggregaten. Door gebruik te maken van de verrode SA-β-Gal probe DDAOG, kan groene cellulaire autofluorescentie worden gebruikt als een secundaire parameter om senescentie te bevestigen, waardoor betrouwbaarheid aan de test wordt toegevoegd. De resterende fluorescentiekanalen kunnen worden gebruikt voor kleuring van de levensvatbaarheid van cellen of optionele fluorescerende immunolabeling.
Met behulp van flowcytometrie demonstreren we het gebruik van DDAOG en lipofuscine autofluorescentie als een dual-parameter assay voor de identificatie van senescente tumorcellen. Kwantificering van het percentage levensvatbare senescente cellen wordt uitgevoerd. Indien gewenst kan een optionele immunolabelingstap worden opgenomen om antigenen van het celoppervlak van belang te evalueren. Geïdentificeerde senescente cellen kunnen ook flowcytometrisch worden gesorteerd en verzameld voor downstream-analyse. Verzamelde senescente cellen kunnen onmiddellijk worden gelyseerd (bijvoorbeeld voor immunoassays of 'omics-analyse' ) of verder worden gekweekt.
Inleiding
Senescente cellen hopen zich normaal gesproken op in organismen gedurende de jaren tijdens normale biologische veroudering, maar kunnen zich ook snel ontwikkelen in tumorcellen als reactie op schade veroorzaakt door verschillende kankerbehandelingen, waaronder bestraling en chemotherapie. Hoewel ze niet langer prolifereren, kunnen door therapie geïnduceerde senescente (TIS) tumorcellen bijdragen aan de behandelingsresistentie en recidief veroorzaken 1,2,3. Factoren die door TIS-cellen worden uitgescheiden, kunnen de tumormaligniteit verergeren door immuunontwijking of metasta....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Al het beschreven dierwerk werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Universiteit van Chicago.
1. Bereiding en opslag van voorraadoplossingen
OPMERKING: Als cellen stroomsorteerd worden, moeten alle oplossingen worden bereid met behulp van steriele technieken en gefilterd door een filterapparaat van 0,22 μm.
- Bereid een stamoplossing van DDAO-Galactoside op 5 mg/ml dmso. Aliquot bij 50 μL per buis (of gewenst volume). Bewaren bij −20 °C in het donker gedurende maximaal 1 jaar.
- Bereid een stamoplossing van Bafilomycine A1 op 1 mM in DMSO. Aliquo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Verschillende experimenten werden uitgevoerd om de vergelijkbaarheid van DDAOG met X-Gal en C12-FDG aan te tonen voor de detectie van senescentie door SA-β-Gal. Eerst werd X-Gal gebruikt om senescente B16-F10 melanoomcellen geïnduceerd door ETO te kleuren (figuur 2A). Een intense blauwe kleur ontwikkelde zich in een subset van met ETO behandelde cellen, terwijl andere cellen minder intense blauwe kleuring vertoonden. Morfologie werd vergroot in de meeste met ETO behandelde cellen........
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In de afgelopen tien jaar is flowcytometrie een gebruikelijker testplatform geworden in kankeronderzoek vanwege de opkomende populariteit van tumorimmunologie, de ontwikkeling van goedkopere flowcytometers en de verbetering van gedeelde instrumentatiefaciliteiten bij academische instellingen. Multicolor assays zijn nu standaard, omdat de meeste nieuwere instrumenten zijn uitgerust met violette, blauwgroene en rode tot verrode optische arrays. Dit DDAOG-protocol is dus waarschijnlijk compatibel met een breed scala aan flo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden voor deze studie.
Dankbetuigingen
We bedanken de Cytometry and Antibody Core Facility van de Universiteit van Chicago voor de ondersteuning bij flowcytometrie-instrumentatie. Het Animal Research Center van de Universiteit van Chicago zorgde voor dierenhuisvesting.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Bafilomycin A1 | Research Products International | B40500 | |
| Bleomycin sulfaat | Cayman | 13877 | |
| Bovine serum albumine (BSA) | US Biological | A1380 | |
| Calcein Violet 450 AM levensvatbaarheidskleurstof | ThermoFisher Scientific | 65-0854-39 | eBioscience |
| DPP4-antilichaam, PE-conjugaat | Biolegend | 137803 | Clone H194-112 |
| Cellijn: A549 menselijke longadenocarcinoom | American Type Culture Collection | CCL-185 | |
| Cellijn: B16-F10 muismelanoom | American Type Culture Collection | CRL-6475 | |
| Celschraper | Corning | 3008 | |
| Celzeefjes, 100 µm | Falcon | 352360 | |
| DDAO-Galactoside | Life Technologies | D6488 | |
| DMEM-medium 1x | Life Technologies | 11960-069 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| DNAse I | Sigma | DN25 | |
| Doxorubicine, hydrochloride-injectie (USP) | Pfizer | NDC 0069-3032-20 | |
| Doxorubicine, PEG-gelipide (USP) | Sun Pharmaceutical | NDC 47335-049-40 | |
| EDTA 0,5 M | Life Technologies | 15575-038 | |
| Etoposide | Cayman | 12092 | |
| FBS | Omega | FB-11 | |
| Fc-receptorblokkeringsreagens | Biolegend | 101320 | Anti-muis CD16/32 |
| Flowcytometer (celanalyser) | Becton Dickinson (BD) | Verschillende | LSRFortessa |
| Flowcytometer (celsorteerder) | Becton Dickinson (BD) | Verschillende | FACSAria |
| GlutaMax 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES 1 M | Lonza | BW17737 | |
| Liberase TL | Sigma | 5401020001 | Roche |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicilline/Streptomycine 100x | Life Technologies | 15140122 | |
| Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 1x | Corning | MT21031CV | Dulbecco's PBS (zonder calcium en magnesium) |
| Rainbow kalibratiedeeltjes, ultrakit | SpheroTech | UCRP-38-2K | 3,5-3,9 µm, 2E6/mL |
| RPMI-1640 medium 1x | Life Technologies | 11875-119 | |
| Natriumchloride 0,9% (USP) | Baxter Healthcare Corporation | 2B1324 | |
| Software voor cytometergegevensverwerving, "FACSDiva" | Becton Dickinson (BD) | n/a | Contact BD voor licentie |
| Software voor cytometergegevensanalyse, "FlowJo" | TreeStar | n/a | Contact TreeStar voor licentie |
| Trypsine-EDTA 0,25% | Life Technologies | 25200-114 |
Referenties
- Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy. Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).
- Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent cells in cancer therapy: fri....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
