Methodenartikel

Studie van de functies en activiteiten van Neuronale K-Cl Co-Transporter KCC2 met behulp van Western Blotting

DOI:

10.3791/64179

⸱

9 december 2022

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, Hatherly Laboratories

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol benadrukt de toepassing van western blotting-techniek om de functies en activiteiten van neuronale K-Cl co-transporter KCC2 te bestuderen. Het protocol beschrijft het onderzoek naar KCC2-fosforylering op kinaseregelplaatsen Thr906/1007 via western blotting. Ook aanvullende methoden om KCC2-activiteit te bevestigen worden kort gemarkeerd in deze tekst.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaliumchloride cotransporters 2 (KCC2) is een lid van de opgeloste dragerfamilie 12 (SLC12) van kation-chloride-cotransporters (CCC's), uitsluitend aangetroffen in het neuron en is essentieel voor de goede werking van Cl-homeostase en bijgevolg functionele GABAerge remming. Falen in de juiste regulatie van KCC2 is schadelijk en is in verband gebracht met de prevalentie van verschillende neurologische ziekten, waaronder epilepsie. Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt met betrekking tot het begrijpen van de mechanismen die betrokken zijn bij de regulering van KCC2, geaccrediteerd voor de ontwikkeling van technieken die onderzoekers in staat stellen de functies en activiteiten ervan te bestuderen; hetzij via direct (beoordelen van kinase regulerende sites fosforylering) of indirecte (observeren en monitoren van GABA-activiteit) onderzoeken. Hier benadrukt het protocol hoe KCC2-fosforylering op kinase-regulerende locaties - Thr906 en Thr1007 - kan worden onderzocht met behulp van western blotting-techniek. Er zijn andere klassieke methoden die worden gebruikt om KCC2-activiteit direct te meten, zoals rubidiumion en thalliumion opname assay. Verdere technieken zoals patch-clamp-elektrofysiologie worden gebruikt om GABA-activiteit te meten; dus indirect reflecterend op geactiveerd en/of geïnactiveerd KCC2 zoals gebaseerd op de beoordeling van intracellulaire chloride-ionhomeostase. Een paar van deze aanvullende technieken zullen in dit manuscript kort worden besproken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaliumchloride cotransporters 2 (KCC2) is een lid van de opgeloste dragerfamilie 12 (SLC12) van kationchloride-cotransporters (CCC's), uitsluitend aangetroffen in het neuron en is essentieel voor de goede werking van Cl-homeostase en bijgevolg functionele GABAerge remming 1,2,3,4. Het behoud van een lage intraneuronale Cl-concentratie ([Cl-]i) bij 4-6 mM door KCC2 vergemakkelijkt γ-aminoboterzuur (GABA)/glycine hyperpolarisatie en synaptische remming in de hersenen en het ruggenmerg5. Falen in de juiste regulatie van KCC2 is in verband gebracht met de prevalentie van verschillende neurologische ziekten, waaronder epilepsie4. Bovendien zijn verminderde KCC2-gemedieerde Cl− extrusie en verminderde hyperpolariserende GABAA en/of glycine receptor-gemedieerde stromen betrokken bij epilepsie, neuropathische pijn en spasticiteit 6,7. Neuronale KCC2 wordt negatief gemoduleerd via fosforylering van belangrijke regulerende residuen binnen zijn C-terminale intracellulaire domein door het met-geen-lysine (WNK)-STE20/SPS1-gerelateerde proline/alanine-rijke (SPAK)/oxidatieve stress-responsieve (OSR) kinase signaleringscomplex1, wat het behoud van gedepolariseerde GABA-activiteit in onrijpe neuronenvergemakkelijkt 2,8,9 . De WNK-SPAK/OSR1 fosforyleert threonineresiduen 906 en 1007 (Thr906/Thr1007) en downreguleert vervolgens de mRNA-genexpressie van KCC2, wat leidt tot een daaruit voortvloeiende verslechtering van de fysiologische functie 8,10. Belangrijker is echter dat het al een feit is dat van het WNK-SPAK/OSR1-kinasecomplex bekend is dat het KCC2-expressie 1,2,4,11,12 fosforylaat en remt, en dat de remming van de kinasecomplexsignaleringsroutes naar fosforylaat Thr906/Thr1007 in verband is gebracht met de verhoogde expressie van het KCC2 mRNA-gen 13,14,15 . Het is belangrijk op te merken dat de regulatie van neuronale KCC2 en Na+-K+-2Cl- cotransporters 1 (NKCC1) expressie via eiwitfosforylering gelijktijdig en in omgekeerde patronen werkt 1,4,16.

Er is consistente en aanzienlijke vooruitgang geboekt met betrekking tot het begrip van mechanismen die betrokken zijn bij de regulering van KCC2, geaccrediteerd voor de ontwikkeling van technieken die onderzoekers in staat stellen de functies en activiteiten ervan te bestuderen; hetzij via direct (beoordelen van kinase regulerende sites fosforylering) of indirecte (observeren en monitoren van GABA-activiteit) onderzoeken. Het hier gepresenteerde protocol benadrukt de toepassing van western blotting-technieken om de functies en activiteiten van neuronale K +-Cl- co-transporter KCC2 te bestuderen door de fosforylering van de cotransporter op kinase-regelgevende locaties Thr906/1007 te onderzoeken.

Western blot is een methode die wordt gebruikt om specifieke eiwitten van belang te detecteren uit een monster van weefsel of cel. Deze methode scheidt de eiwitten eerst op grootte door middel van elektroforese. De eiwitten worden vervolgens elektroforetisch overgebracht naar een vaste ondersteuning (meestal een membraan) voordat het doeleiwit wordt gemarkeerd met behulp van een specifiek antilichaam. De antilichamen worden geconjugeerd aan verschillende tags of fluorofoor-geconjugeerde antilichamen die worden gedetecteerd met behulp van colorimetrische, chemiluminescentie of fluorescentiemethoden. Hierdoor kan een specifiek doeleiwit worden gedetecteerd uit een mengsel van eiwitten. Deze techniek is gebruikt om fosfospecifieke locaties van KCCCs1 te karakteriseren en is gebruikt om kinaseremmers te identificeren die KCC3 Thr991/Thr1048 fosforyleringremmen 17. Door dit protocol te volgen, kan men specifiek totaal en gefosforyleerd KCC2 detecteren uit cel/weefsellysaten. In principe is de detectie van eiwit-geconjugeerde antilichamen door deze techniek zeer instrumenteel omdat het helpt om het begrip van samenwerkingsactiviteiten op de fosfo-locaties van KCC2 te verbeteren, wat licht werpt op de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij hun fysiologische regulaties. De kwantitatieve analyse van de totale eiwitexpressie is representatief voor de functie en activiteit van KCC2. Er zijn andere klassieke methoden die worden gebruikt om KCC2-activiteit direct te meten, zoals rubidiumion en thalliumion opname assay. Verdere technieken zoals patch-clamp-elektrofysiologie worden gebruikt om GABA-activiteit te meten; dus indirect reflecterend op geactiveerd en/of geïnactiveerd KCC2 zoals gebaseerd op de beoordeling van intracellulaire chloride-ionhomeostase.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Het protocol beschrijft de western blotting-methode om specifieke eiwitten van belang te detecteren.

1. Celkweek en transfectie

  1. Verwarm alle reagentia in het kralenbad (37 °C) vóór de celkweekprocedure. Bereid kweekmedium, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), aangevuld met 10% foetaal runderserum, 1% elk van 2mM L-glutamine, 100x niet-essentieel aminozuur, 100 mM natriumpyruvaat en 100 eenheden / ml penicilline-streptomycine.
  2. Ontdooi stabiel getransfecteerde rat KCC2b menselijke embryonale nier 293 cellen (HEK293rnKCC2b)18 volledig in het kralenbad (37 °C). Breng de cellen van de cryoviale buis over in een centrifugebuis met 5 ml verse media. Draai de cel op 1200 ×g gedurende 3-5 min.
  3. Gebruik een aspiratorpipet (bevestigd aan een vacuümpomp) om het supernatant te aspirateren en voeg 10 ml verse media toe om de cellen opnieuw op te hangen. Breng de celsuspensie over op een schotelplaat van 10 cm.
  4. Plaats het gerecht in de broedmachine en laat het 48 uur groeien bij 37 °С in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer. Controleer de incubatietijd om een gezonde celgroei te garanderen. Splits de cellen verder wanneer ze na de incubatietijd meer dan 90% samenvloeiing hebben bereikt.
  5. Zuig de oude media uit de cellenschaal en spoel de cellen voorzichtig af met 2 ml fosfaatbufferzoutoplossing (PBS). Voeg 2 ml trypsine toe en incubeer gedurende ongeveer 1-2 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Gebruik 2 ml volledige media om de trypsinized cellen in de schaal voorzichtig te wassen. Voeg 9 ml verse media toe aan nieuwe gerechten en voeg 1 ml oplossing van het oude gerecht toe aan elk van de nieuwe gerechten. Breng de gesplitste celschalen gedurende 48 uur terug naar de incubator om ≥ 90% samenvloeiing te bereiken.
  7. Behandel de cellen met dimethylsulfoxide (DMSO) als controle, 8 μM staurosporine of 0,5 mM N-ethylmaleimide (NEM) gedurende 15 minuten voordat de cellen in lysisbuffer worden geoogst.

2. Bereiding van cellysaten en laden van monsters

  1. Aspirateer de media op de kweekschaal (van transfectieprocedures). Plaats de celcultuur op ijs en was de cellen met ijskoude PBS.
  2. Aspirateer de PBS, voeg vervolgens 1,0 ml ijskoude lysisbuffer toe met 50 mM tris-HCl (pH 7,5), 1 mM ethyleenglycol-bis (β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraazijnzuur (EGTA), 1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 50 mM natriumfluoride, 5 mM natriumpyrofosfaat, 10 mM natrium-β-glycerofosfaat, 1 mM natriumorthopvanadaat, 1% (w/v) Triton X-100, 0,27 M sucrose, 1 mM benzamine, 0,1% (v/v) 2-mercaptoethanol en 2 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) in het gerecht.
    OPMERKING: Het volume van de lysisbuffer tijdens de celoogst varieert met de grootte van de schotel, bijvoorbeeld 1 ml lysisbuffer is geschikt per 1 x 107 cellen / 100 mm schaal / 150 cm2 kolf, terwijl 0,5 ml geschikt is per 5 x 106 cellen / 60 mm schotel / 75 cm2 kolf.
  3. Gebruik een koude plastic celschraper om de cellen van de bodem van de schaal te schrapen en gebruik vervolgens voorzichtig een pipet om de celsuspensie over te brengen in een microcentrifugebuis die al op ijs staat. Roer de buis constant gedurende 30 minuten bij 4 °C.
  4. Draai de cellates in een koude centrifuge (4 °C) bij 16.000 x g gedurende 20 minuten, verwijder de buis voorzichtig uit de centrifuge en plaats deze op ijs. Verzamel het supernatant in een voorgekoelde verse buis en gooi de pellet weg.
    OPMERKING: Het kan nodig zijn om de centrifugatiekracht en -tijd te variëren, afhankelijk van het celtype. Algemene richtlijnen moedigen echter centrifugatie aan bij 16.000 x g gedurende 20 minuten. Dit moet echter voor elk experiment worden bepaald. Delicate cellen zoals leukocyten hebben bijvoorbeeld een zeer lichte centrifugatiesnelheid nodig.

3. Bereiding van immunoprecipitanten uit cellysaten

  1. Pipetteer 300 μL eiwit-G-sepharose in een microcentrifugebuis. Draai de oplossing gedurende 2 minuten op 500 x g en gooi het supernatant weg.
  2. Voeg 500 μL PBS toe en vortex de oplossing goed. Draai de oplossing gedurende 2 minuten op 500 x g en gooi het supernatant weg. Herhaal deze stap.
  3. Meng 1 mg anti-KCC2 Thr906 en anti-KCC2 Thr1007 antilichamen met 200 μL eiwit G-sepharose kralen en vul het volume aan tot 500 μL met PBS. Schud op een trilplatform of draaiwiel gedurende 2 uur bij 4 °C. Was 2x met PBS.
  4. Voer eiwitkwantificering uit op de hele cellysaten en voeg 1 mg van het cellysaat toe aan de gewassen kralen. Incubeer voorzichtig in een end-to-end rotator gedurende 2 uur bij 4 °C. Draai de kralen naar beneden en was ze 3x met PBS dat 150 mM natriumchloride (NaCl) bevat.
  5. Was immunoprecipitanten (kralen) 3x met 200 μL PBS. Resuspendeer de laatste pellet in 100 μL lithium dodecylsulfaat (LDS) monsterbuffer.
  6. Schud de buizen in een rotorschudder bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en incubeer ze gedurende 10 minuten in een verwarmingsblok bij 75 °C. Centrifugeer het laadmonster bij 11.000 x g gedurende 2 minuten en gebruik het supernatant voor het laden van gel.

4. Het uitvoeren van de western blot

  1. Monteer het gietapparaat en giet vers bereide 8% scheidingsgel (zie tabel 1 voor recept/bereiding) om de gel te gieten met ongeveer 2 cm ruimte vanaf de bovenkant van het gietglas. Voeg 200 μL absolute isopropanol toe aan de opstelling en laat het 60 minuten op kamertemperatuur staan.
    OPMERKING: Het polyacrylamide gel recept voor natrium dodecylsulfaat-polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) is afhankelijk van de grootte van het eiwit van belang (tabel 2). Noteer daarom de eiwitgrootte voordat u het gewenste gelpercentage bepaalt.
  2. Gebruik een pipet om de isopropanol te verwijderen en spoel de gel voorzichtig af met ongeveer 200 μL gedestilleerd water. Voeg vers bereide 6% stapelgel toe (zie tabel 1 voor recept/bereiding) om de ongeveer 2 cm ruimte op de gietopstelling te vullen. Plaats voorzichtig in de putkam en laat 30 minuten op kamertemperatuur staan.
  3. Bevestig de gegoten gel in de elektroforesetank.
  4. Los 30,3 g Tris-base, 144,1 g g glycine en 10 g SDS op in 1000 ml gedestilleerd water om 10x overdrachtsbuffer te bereiden. Bereid 1x lopende buffer voor door 10 ml 10% SDS en 100 ml 10x overdrachtsbuffer toe te voegen aan 890 ml gedestilleerd water.
  5. Giet 1x lopende buffer in de tank. Laad 5 μL moleculaire gewichtsmarker in de eerste put en een gelijke hoeveelheid eiwit in elke put van de SDS-PAGE-gel (tussen 18-30 μL, afhankelijk van de gebruikte kamgrootte). Vul lege putten met 1x LDS en laat de gel ongeveer 90-120 min op 120 V lopen.
  6. Los 58,2 g Tris-base en 29,3 g glycine op in 1000 ml gedestilleerd water om 10x transferbuffer te bereiden. Activeer nitrocellulosemembraan met 1x overdrachtsbuffer met 20% methanol. Spoel de gel en het membraan af met de transferbuffer en spreid ze voorzichtig uit op de bereidingsstapel.
    OPMERKING: Het is niet nodig om de pH van de loop- en overdrachtsbuffers aan te passen, omdat deze op de optimale pH moeten zijn die vereist is. Ook is het raadzaam om deze buffers voor te bereiden en op kamertemperatuur te bewaren vóór het experiment om tijd te besparen.
  7. Rangschik de over te brengen sandwich in deze volgorde: negatieve elektrode (zwart frame/uiteinde) - sandwichschuim - filterpapier - gespoelde SDS-PAGE-gel - gespoeld nitrocellulosemembraan - filterpapier - sandwichschuim - positieve elektrode (rood frame). Stapel de gemonteerde sandwich in de transfertank en laat 90 V draaien gedurende 90 minuten of 30 V gedurende 360 minuten.

5. Antilichaamkleuring en beeldontwikkeling

  1. Verwijder het membraan en laat het drogen. Blokkeer het membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met behulp van een blokkerende buffer gemaakt van 5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
  2. Incubeer de membranen met geschikte verdunningen van primair antilichaam 8,15,19 en bèta-actine (belastingscontrole) in blokkerende buffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4 °C. Was het membraan in drie wasbeurten van 1x TBS-T gedurende elk 5 minuten.
    OPMERKING: De incubatie van het afzonderlijke membraan met belastingscontroles zoals bèta-actine, alfa-tubuline of glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase-antilichamen is om de andere western blotting-resultaten te normaliseren tijdens de daaropvolgende kwantificering. De aanbevolen verdunning voor elk primair antilichaam is beschikbaar in de handleiding van de fabrikant.
  3. Incubeer het gewassen membraan met secundair antilichaam verdund 5000-voudig in blokkerende buffer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Nogmaals, was het membraan 3x in 1x TBS-T gedurende 5 minuten elk.
    OPMERKING: Het wordt ten zeerste aanbevolen dat het secundaire antilichaam moet worden verhoogd tegen de soort waarin het primaire antilichaam is verhoogd. Als het primaire antilichaam van totaal KCC2 bijvoorbeeld muis anti-KCC2 is, moet het secundaire antilichaam voor antimuis worden gebruikt.
  4. Plaats het gewassen membraan op de beeldplaat. Meng gelijke volumes van elk verbeterd chemiluminescentie (ECL) reagens en verspreid de gemengde oplossing voorzichtig op het membraan om signalen te ontwikkelen.

6. Beeldacquisitie met behulp van een beeldvormingssysteem en gegevenskwantificering

  1. Breng de imaging board over naar het juiste compartiment op het imaging systeem voor imaging. Open de beeldbewerkingssoftware op de computer voor beeldverwerking.
  2. Klik op de werkbalk op Nieuw protocol en kies Eén kanaal. Klik op Selecteren onder het dialoogvenster Gel Imaging/Application, scrol naar Blot en selecteer Chemi Hi Sensitivity of Chemi Hi Resolution. Klik vervolgens op Signal Accumulation Setup om de duur en het aantal te verkrijgen afbeeldingen in te stellen.
  3. Klik op Gel positioneren onder protocolinstellingen en pas de gel indien nodig aan in het beeldvormingssysteem. Klik op Protocol uitvoeren om de afbeeldingen te verkrijgen.
  4. Klik met de rechtermuisknop op een van de verkregen afbeeldingen onder het vak imaging-catalogus om de afbeeldingen op de computer op te slaan. Navigeer naar de gewenste afbeelding en klik op Afbeelding selecteren en doorgaan onder het dialoogvenster Uitvoeren.
  5. Klik op het pictogram Afbeelding transformeren om het contrast en de pixelverzadiging van de afbeelding aan te passen. Klik op het screenshot-pictogram op de algemene werkbalk om de afbeelding op de computer op te slaan, afhankelijk van het gewenste afbeeldingsformaat.
  6. Meet de banddichtheden met behulp van ImageJ-software en analyseer met behulp van geschikte statistische hulpmiddelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier onderzocht het representatieve resultaat in figuur 1 de impact van staurosporine en NEM op WNK-SPAK/OSR1 gemedieerde fosforylering van KCC2 en NKCC1 in HEK293-cellijnen die KCC2b (HEKrnKCC2b)18 stabiel tot expressie brengen met behulp van de western blotting-techniek. Uitgebreide details over de representatieve resultaten worden besproken in Zhang et al.15. Net als NEM is staurosporine een brede kinaseremmer die de KCC2...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veel methoden zijn gebruikt om de activiteiten van SLC12 van CCC's te meten die tot expressie komen in de neuronen, waaronder KCC2. Veel van deze technieken hebben bewezen de wetenschappelijke kennis te vergroten over de analyse van de functionele relevantie van deze transporters en hun structuur-functiepatronen in verschillende ziektegerelateerde mutaties. Kritisch zijn er voordelen en kanttekeningen bij de verschillende methoden21. Het hierboven uitgelegde protocol schetste echter hoe KCC2-fosfo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door The Royal Society UK (Grant no. IEC\NSFC\201094) en een Commonwealth Ph.D. Scholarship.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
40% acrylamideSigma-AldrichA2917Gebaten voor het maken van separaat en stapelingsgel voor SDS-PAGE
Ammonium Per SulfateSigma-Aldrich248614Gebaten voor het maken van separaat en stapelingsgel voor SDS-PAGE
anti pSPAKDundee UniversityS670BGebaten als primaire antilichaam voor western blotting
anti-KCC2Dundee UniversityS700CGebaten als primaire antilichaam voor western blotting
anti-KCC2 pSer940Thermo Fisher ScientificPA5-95678Gebaten als primaire antilichaam voor western blotting
anti-KCC2 pThr1007Dundee UniversityS961CGebaten als primaire antilichaam voor western blotting
anti-KCC2 pThr906Dundee UniversityS959CGebaten als primaire antilichaam voor western blotting
anti-mouseCell Signalling technology66002Gebaten als secundair antilichaam voor western blotting
anti-NKCC1Dundee UniversityS841BGebaten als primaire antilichaam voor western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212Dundee UniversityS763BGebaten als primaire antilichaam voor western blotting
anti-rabbitCell Signalling technologyC29F4Gebaten als secundair antilichaam voor western blotting
anti-sheepabcamab6900Gebaten als secundair antilichaam voor western blotting
anti-SPAKDundee UniversityS669DGebaten als primaire antilichaam voor western blotting
anti-β-Tubulin IIISigma-AldrichT8578Gebaten als primaire antilichaam voor western blotting
BenzamineMerck UK135828Gebaten als onderdeel van lysisbuffer
Beta-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148Gebaten als onderdeel van laadbuffer en lysisbuffer
Bradford CoomasieThermo Scientific1856209Gebaten voor de kwantificering van lysate-eiwitten
Casting apparatusAttoWSE-1165WGebaten om SDS-pagina-elektroforese uit te voeren
CentrifugeEppendorf5804Gebaten bij de bereiding van lysate
CentrifugeVWRMicroStar 17RGebaten voor het centrifugeren van monsters
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650-100MLGebaten voor celcultuurexperiment
Dried Skimmed MilkMarvelN/AGebaten om blokkeringsbuffer te maken
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucoseSigma-AldrichD6429Gebaten voor celcultuur
ECL reagentPerkin ElmerORTT755/2655Gebaten om beelden te ontwikkelen voor western blotting
EDTAFisher ScientificD/0700/53Gebaten als onderdeel van lysisbuffer
EGTASigma-Aldriche4378Gebaten als onderdeel van lysisbuffer
Electrophoresis Power SupplyBioRadPowerPAC HCOm stroom te leveren om SDS-pagina-elektroforese uit te voeren
EthanolThermoFisherE/0650DF/17Gebaten voor het voorbereiden van gesteriliseerde apparatuur en omgeving
Fetal Bovine Serum - heat inactivatedMerck Life Sciences UKF9665Gebaten voor celcultuur
FumehoodWalkerA7277Gebaten voor celcultuur
Gel Blotting - WhatmanGE Healthcare10426981Gebaten bij western blotting om een overdrachtssandwich te maken
GlycineSigma-Aldrich15527Gebaten om buffers te maken
GraphPad Prism SoftwareGraphPad Software, Inc., USAVersie 6.0Gebaten voor het plotten van grafieken en het analyseren van gegevens voor western blotting
HClAcros Organics10647282Gebaten voor het maken van separaat en stapelingsgel voor SDS-PAGE
Heating blockGrantQBT1Gebaten om WB-laadmonsters te verwarmen
HEK293 cellsMerck UK12022001-1VLCellijn voor cultuurexperiment
ImageJ SoftwareWayne Rasband en bijdragers; NIH, USAImageJ 1.53eGebaten om bandintensiteiten van western blotting-afbeeldingen te meten
Imaging systemBioRadChemiDoc MPGebaten om western blotting-afbeeldingen te maken
IncubatorLEECLEEC precision 190DGebaten voor celcultuur
IsopropanolHoneywell24137Gebaten bij het gieten van gel voor elektroforese
L-glutamine solutionSigma-AldrichG7513Gebaten voor celcultuur
Lithium dodecyl sulfate (LDS)NovexNP0008Gebaten als laadbuffer voor western blotting
MEM Non-essential amino acidMerck Life Sciences UKM7145Gebaten voor celcultuur
MicrocentrifugeEppendorf5418Gebaten voor het bereiden van lysaten voor WB
Microplate readerBioRadiMarkGebaten voor leeswaarde van lysate-eiwitconcentratie
Microsoft PowerpointMicrosoft, USAPowerPoint2016Gebaten om western blotting-afbeeldingen te bewerken
Molecular Weight MarkerBioRad1610373Gebaten voor western blotting
N-ethylmaleimideThermo Fisher Scientific23030Gebaten voor celcultuurexperiment
Nitrocellulose membraneFisher Scientific45004091Gebaten voor western blotting
Penicillin-StreptomycinGibco15140122Gebaten voor celcultuur
pH MeterMettler ToledoSeven compact s210Gebaten om de pH van bufferoplossingen te controleren
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)Sigma-AldrichP7626Gebaten als onderdeel van lysisbuffer
Phosphate Buffer SalineSigma-AldrichD8537Gebaten voor celcultuur
PKCδ pThr505Cell Signalling technology9374Gebaten als primaire antilichaam voor western blotting
Sepharose Protein GGeneronPG50-0

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. de Los Heros, P., et al. The WNK-regulated SPAK/OSR1 kinases directly phosphorylate and inhibit the K+-Cl- co-transporters. Biochemical Journal. 458 (3), 559-573 (2014).
  2. Heubl, M., et al. GABAA receptor dependent synaptic inhibition rapidly tunes KCC2 activity via the Cl(-)-sensitive WNK1 kinase. Nature Communications. 8 (-), 1776(2017).
  3. Schulte, J. T., Wierenga, C. J., Bruining, H. Chloride transporters and GABA polarity in developmental, neurological and psychiatric conditions. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 90, 260-271 (2018).
  4. Shekarabi, M., et al. WNK Kinase Signaling in Ion Homeostasis and Human Disease. Cell Metabolism. 25 (2), 285-299 (2017).
  5. Rivera, C., et al. The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarizing during neuronal maturation. Nature. 397 (6716), 251-255 (1999).
  6. Kahle, K. T., et al. Modulation of neuronal activity by phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC2. Trends in Neuroscience. 36 (12), 726-737 (2013).
  7. Andrews, K., Josiah, S. S., Zhang, J. The Therapeutic Potential of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 in Huntington's Disease and Its Comorbidities. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 9142(2020).
  8. Friedel, P., et al. WNK1-regulated inhibitory phosphorylation of the KCC2 cotransporter maintains the depolarizing action of GABA in immature neurons. Science Signaling. 8 (383), 65(2015).
  9. Watanabe, M., et al. Developmentally regulated KCC2 phosphorylation is essential for dynamic GABA-mediated inhibition and survival. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  10. Rinehart, J., et al. Sites of regulated phosphorylation that control K-Cl cotransporter activity. Cell. 138 (3), 525-536 (2009).
  11. Lu, D. C. -Y., et al. The role of WNK in modulation of KCl cotransport activity in red cells from normal individuals and patients with sickle cell anaemia. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 471 (11-12), 1539-1549 (2019).
  12. Huang, H., et al. The WNK-SPAK/OSR1 Kinases and the Cation-Chloride Cotransporters as Therapeutic Targets for Neurological Diseases. Aging and Disease. 10 (3), 626-636 (2019).
  13. AlAmri, M. A., Kadri, H., Alderwick, L. J., Jeeves, M., Mehellou, Y. The Photosensitising Clinical Agent Verteporfin Is an Inhibitor of SPAK and OSR1 Kinases. Chembiochem. 19 (19), 2072-2080 (2018).
  14. Zhang, J., et al. Modulation of brain cation-Cl(-) cotransport via the SPAK kinase inhibitor ZT-1a. Nature Communications. 11 (1), 78(2020).
  15. Zhang, J., et al. Staurosporine and NEM mainly impair WNK-SPAK/OSR1 mediated phosphorylation of KCC2 and NKCC1. PLoS One. 15 (5), 0232967(2020).
  16. Alessi, D. R., et al. The WNK-SPAK/OSR1 pathway: master regulator of cation-chloride cotransporters. Science Signaling. 7 (334), 3(2014).
  17. Zhang, J., et al. Functional kinomics establishes a critical node of volume-sensitive cation-Cl(-) cotransporter regulation in the mammalian brain. Scientific Reports. 6, 35986(2016).
  18. Hartmann, A. M., et al. Opposite effect of membrane raft perturbation on transport activity of KCC2 and NKCC1. Journal of Neurochemistry. 111 (2), 321-331 (2009).
  19. Pisella, L. I., et al. Impaired regulation of KCC2 phosphorylation leads to neuronal network dysfunction and neurodevelopmental pathology. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  20. Blaesse, P., et al. Oligomerization of KCC2 correlates with development of inhibitory neurotransmission. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10407-10419 (2006).
  21. Medina, I., Pisella, L. I. Neuronal Chloride Transporters in Health and Disease. , Elsevier. 21-41 (2020).
  22. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  23. Friedel, P., et al. A Novel View on the Role of Intracellular Tails in Surface Delivery of the Potassium-Chloride Cotransporter KCC2. eNeuro. 4 (4), (2017).
  24. Lee, Y. -C., et al. Impact of detergents on membrane protein complex isolation. Journal of Proteome Research. 17 (1), 348-358 (2018).
  25. Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (148), e59820(2019).
  26. Johansen, K., Svensson, L. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , Springer. 15-28 (1998).
  27. Mahmood, T., Yang, P. -C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429(2012).
  28. Klein, J. D., O'Neill, W. C. Volume-sensitive myosin phosphorylation in vascular endothelial cells: correlation with Na-K-2Cl cotransport. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 269 (6), 1524-1531 (1995).
  29. Hannemann, A., Flatman, P. W. Phosphorylation and transport in the Na-K-2Cl cotransporters, NKCC1 and NKCC2A, compared in HEK-293 cells. PLoS One. 6 (3), 17992(2011).
  30. Liu, J., Ma, X., Cooper, G. F., Lu, X. Explicit representation of protein activity states significantly improves causal discovery of protein phosphorylation networks. BMC Bioinformatics. 21 (13), 1-17 (2020).
  31. Terstappen, G. C. Nonradioactive rubidium ion efflux assay and its applications in drug discovery and development. Assay and Drug Development Technologies. 2 (5), 553-559 (2004).
  32. Carmosino, M., Rizzo, F., Torretta, S., Procino, G., Svelto, M. High-throughput fluorescent-based NKCC functional assay in adherent epithelial cells. BMC Cell Biology. 14 (1), 1-9 (2013).
  33. Adragna, N. C., et al. Regulated phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC3 is a molecular switch of intracellular potassium content and cell volume homeostasis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 255(2015).
  34. Zhang, D., Gopalakrishnan, S. M., Freiberg, G., Surowy, C. S. A thallium transport FLIPR-based assay for the identification of KCC2-positive modulators. Journal of Biomolecular Screening. 15 (2), 177-184 (2010).
  35. Yu, H. B., Li, M., Wang, W. P., Wang, X. L. High throughput screening technologies for ion channels. Acta Pharmacologica Sinica. 37 (1), 34-43 (2016).
  36. Hill, C. L., Stephens, G. J. An Introduction to Patch Clamp Recording. Patch Clamp Electrophysiology. , 1-19 (2021).
  37. Conway, L. C., et al. N-Ethylmaleimide increases KCC2 cotransporter activity by modulating transporter phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 292 (52), 21253-21263 (2017).
  38. Heigele, S., Sultan, S., Toni, N., Bischofberger, J. Bidirectional GABAergic control of action potential firing in newborn hippocampal granule cells. Nature Neuroscience. 19 (2), 263-270 (2016).
  39. Moore, Y. E., Deeb, T. Z., Chadchankar, H., Brandon, N. J., Moss, S. J. Potentiating KCC2 activity is sufficient to limit the onset and severity of seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10166-10171 (2018).
  40. Kim, H. R., Rajagopal, L., Meltzer, H. Y., Martina, M. Depolarizing GABAA current in the prefrontal cortex is linked with cognitive impairment in a mouse model relevant for schizophrenia. Science Advances. 7 (14), 5032(2021).
  41. Yelhekar, T. D., Druzin, M., Karlsson, U., Blomqvist, E., Johansson, S. How to properly measure a current-voltage relation?-interpolation vs. ramp methods applied to studies of GABAA receptors. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 10(2016).
  42. Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user's guide. Patch Clamp Techniques. , 71-83 (2012).
  43. Ebihara, S., Shirato, K., Harata, N., Akaike, N. Gramicidin-perforated patch recording: GABA response in mammalian neurones with intact intracellular chloride. The Journal of Physiology. 484 (1), 77-86 (1995).
  44. Kyrozis, A., Reichling, D. B. Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration. Journal of Neuroscience Methods. 57 (1), 27-35 (1995).
  45. Lamsa, K., Palva, J. M., Ruusuvuori, E., Kaila, K., Taira, T. Synaptic GABAA activation inhibits AMPA-kainate receptor-mediated bursting in the newborn (P0-P2) rat hippocampus. Journal of Neurophysiology. 83 (1), 359-366 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

KCC2 FunctionNeuronal KCC2KCC2 PhosphorylationChloride HomeostasisGABAergic InhibitionProtein QuantificationHEK293 CellsKinase Regulatory SitesProtein Kinase C

Gerelateerde artikelen