Methodenartikel

Protocollen voor CRISPR/Cas9 Mutagenese van de Oosterse Fruitvlieg Bactrocera dorsalis

2.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64195

⸱

28 september 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Sustainable Forest Ecosystem Management - Ministry of Education, Northeast Forestry University, 2Shenzhen Branch, Guangdong Laboratory of Lingnan Modern Agriculture, Genome Analysis Laboratory of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Agricultural Genomics Institute at Shenzhen, Chinese Academy of Agricultural Sciences

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel presenteert de stapsgewijze protocollen voor CRISPR/Cas9-mutagenese van de Oosterse fruitvlieg Bactrocera dorsalis. Gedetailleerde stappen in dit gestandaardiseerde protocol zullen dienen als een nuttige gids voor het genereren van gemuteerde vliegen voor functionele genstudies in B. dorsalis.

Samenvatting

De Oosterse fruitvlieg, Bactrocera dorsalis, is een zeer invasieve en adaptieve plaagsoort die wereldwijd schade toebrengt aan citrusvruchten en meer dan 150 andere fruitgewassen. Omdat volwassen fruitvliegen een grote vliegcapaciteit hebben en vrouwtjes hun eieren onder de schil van fruit leggen, presteren insecticiden die direct contact met de plaag vereisen meestal slecht in het veld. Met de ontwikkeling van moleculair biologische hulpmiddelen en high-throughput sequencing-technologie proberen veel wetenschappers milieuvriendelijke plaagbestrijdingsstrategieën te ontwikkelen. Deze omvatten RNAi of op genbewerking gebaseerde pesticiden die genen (moleculaire doelen) downreguleren of tot zwijgen brengen, zoals olfactorische genen die betrokken zijn bij zoekgedrag, in verschillende insectenplagen. Om deze strategieën voor oosterse fruitvliegbestrijding aan te passen, zijn effectieve methoden voor functioneel genonderzoek nodig. Genen met kritische functies in de overleving en reproductie van B. dorsalis dienen als goede moleculaire doelwitten voor gen knockdown en/of silencing. Het CRISPR/Cas9-systeem is een betrouwbare techniek die wordt gebruikt voor genbewerking, vooral bij insecten. Dit artikel presenteert een systematische methode voor CRISPR/Cas9-mutagenese van B. dorsalis, inclusief het ontwerp en de synthese van gids-RNA's, het verzamelen van embryo's, embryo-injectie, insectenopfok en mutantscreening. Deze protocollen zullen dienen als een nuttige gids voor het genereren van gemuteerde vliegen voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in functionele genstudies in B. dorsalis.

Inleiding

De Oosterse fruitvlieg, Bactrocera dorsalis, is een kosmopolitische insectenplaagsoort die schade toebrengt aan meer dan 150 soorten fruitgewassen, waaronder guave, mango, Eugenia spp., Surinaamse kers, citrus, loquat en papaja1. De schade die alleen al in de provincie Guangdong (China) is aangericht, wordt geschat op meer dan 200 miljoen yuan. Volwassen vrouwtjes brengen hun eieren onder de schil van rijpend of gerijpt fruit, waardoor bederf en abscissie van het fruit ontstaat, wat de vruchtkwaliteit en de algehele opbrengst van het gewas vermindert2. Omdat volwassen fruitvliegen een grote vliegcapaciteit hebben en hun larven zich in de vruchthuid boren, presteren insecticiden die direct contact met de plaag vereisen slecht in het veld. Bovendien heeft het uitgebreide gebruik van insecticiden de resistentie van B. dorsalis tegen verschillende landbouwchemicaliën verhoogd, waardoor de bestrijding van deze schadelijke plagen nog moeilijkerwordt 3. Daarom is de ontwikkeling van effectieve en milieuvriendelijke strategieën voor ongediertebestrijding hard nodig.

Onlangs, met de ontwikkeling van moleculair biologische hulpmiddelen en high-throughput sequencing-technologieën, proberen wetenschappers milieuvriendelijke plaagbestrijdingsstrategieën te ontwikkelen, zoals RNAi, die zich richten op de functionaliteit van belangrijke genen (moleculaire doelen) van verschillende insectenplagen. Genen die van cruciaal belang zijn voor de overleving en reproductie van het plaagorganisme kunnen worden geïdentificeerd door middel van functionele genstudies en dienen verder als potentiële moleculaire doelen voor de verbetering van specifiek gerichte en milieuvriendelijke plaagbestrijdingsinstrumenten4. Om dergelijke strategieën aan te passen aan oosterse fruitvliegbestrijding, zijn effectieve methoden voor functioneel genonderzoek nodig.

Het CRISPR/Cas (clustered regular interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) endonucleasesysteem werd aanvankelijk ontdekt in bacteriën en archaea en bleek een adaptief mechanisme te zijn dat betrokken is bij de herkenning en afbraak van vreemd intracellulair DNA, zoals dat werd geïntroduceerd door bacteriofagen te infecteren5. In het type II CRISPR-systeem wordt Cas9-endonuclease geleid door kleine geassocieerde RNA's (crRNA en tracrRNA) om 6,7,8 te breken en is het een van de meest gebruikte hulpmiddelen voor genbewerking tot nu toe geworden 9,10,11,12. Omdat het CRISPR/Cas9-systeem verschillende voordelen heeft, zoals een hoge efficiëntie van gen-uitschakeling en lage kosten, is het al toegepast voor genbewerking bij verschillende insectensoorten, waaronder Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 en Bombyx mori16. In B. dorsalis zijn genen die verband houden met lichaamskleur, vleugeldimorfisme en geslachtsbepaling met succes uitgeschakeld met CRISPR / Cas9 17,18,19. Gedetailleerde procedures voor CRISPR/Cas9-toepassing in dit insect blijven echter onvolledig. Bovendien zijn sommige stappen die onderzoekers bieden voor B. dorsalis-genbewerking ook gevarieerd en hebben ze behoefte aan standaardisatie. De vormen van Cas9 waren bijvoorbeeld verschillend in gepubliceerde referenties 17,18,19.

Dit artikel biedt een systematische methode voor mutagenese van B. dorsalis met behulp van het CRISPR / Cas9-systeem, inclusief het ontwerp en de synthese van gids-RNA's, het verzamelen van embryo's, embryo-injectie, insectenopfok en mutantscreening. Dit protocol zal dienen als een nuttige gids voor het genereren van gemuteerde vliegen voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de functionele genstudies in B. dorsalis.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Doelontwerp en in vitro synthese van sgRNA

  1. Voorspel de structuur van doelgenen van belang en bepaal de grenzen tussen exonen en introns via bioinformatische analyse van het B. dorsalis-genoom (softwaretoepassingen die hier worden gebruikt, worden vermeld in de tabel met materialen).
    OPMERKING: BLAT20 werd gebruikt om potentiële gen loci in het genoom te zoeken. De hoogwaardige RNA-seq reads (transcriptoom) werden uitgelijnd op het verworven gen loci met behulp van Hisat221. Samtools22 werd gebruikt om de gesorteerde bam-bestanden te genereren. De gesorteerde bam-bestanden werden ingevoerd in Stringtie223 om de transcripties te leveren. De samengestelde transcripten en gen loci-informatie werden gecombineerd door Transdecoder24. De resultaten van Transdecoder werden gevisualiseerd in IGV-tools25 en de grenzen tussen exonen en introns konden worden bepaald.
  2. Identificeer de geschikte doelgebieden binnen de kandidaat-doelgensite. De totale lengte moet minder dan 750 bp zijn voor een gemakkelijkere volgorde (figuur 1B). Ontwerp specifieke primers om het doelgebied uit wild-type genomisch DNA te versterken door PCR (Figuur 1B) (Primers: F-primer: AACATTGAATATCTGGAATCAGGTAAACT, R-primer: CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC). Kloon de PCR-producten tot een stompe eindvector26 en selecteer 20 individuele bacteriekolonies voor sequencing om te bepalen hoe geconserveerd het doelgebied is in de laboratoriuminsectenpopulaties.
  3. Een typische doellocatie bevat een drie-nucleotide sequentiemotief (NGG of CCN) en een 20 bp-sequentie naast de NGG- of CCN-motieven (20 bp-NGG of CCN-20 bp). Straal de kandidaat-doellocaties tegen het B. dorsalis-genoom en zorg ervoor dat de voorspelde efficiëntie hoog genoeg is en de off-targeting rate laag; verschillende open-source softwareprogramma's kunnen dit automatisch voorspellen. In dit protocol wordt sgRNAcas9 -AI27 gebruikt om de optimale doelen te selecteren en te evalueren. Details over het gebruik zijn te vinden in de handleiding voor deze software.
    OPMERKING: Mogelijke doellocaties die gesloten zijn voor de 5 'UTR van het doelgen en 1-2 Gs aan het begin van de 20 bp-sequentie hebben de voorkeur. Om een grote deletie te bereiken die zal worden geïdentificeerd door PCR gevolgd door agarose gel elektroforese, wordt het ontwerpen van twee doelen28 gescheiden door meer dan 100 bp aanbevolen (figuur 1C).
  4. Gebruik de in de handel verkrijgbare gRNA-synthesekit om het ontworpen sgRNA te genereren. Voer elke stap uit volgens de gebruikershandleiding. Resuspendeer het gRNA-product in nucleasevrij water, kwantificeer de concentratie met behulp van een UV-Vis-spectrofotometer en bewaar het bij -80 °C voor gebruik (de concentratie van succesvol gesynthetiseerd enkelvoudig gRNA [10 μL] met de hier gebruikte kit is ongeveer 4000-6000 ng / μL, of zelfs hoger).
    OPMERKING: Hoewel het genereren van de mutante vliegen de eerste stap is voor elke onderzoeker, is de juiste negatieve controle voor downstream experiment / analyse van cruciaal belang. Het genereren van deze controles naast de mutanten bespaart onderzoekers tijd en moeite. Stel bijvoorbeeld scrambled sgRNA in als een negatieve controle.

2. Embryoverzameling en -voorbereiding

  1. Plaats B. dorsalis poppen in plastic kooien. Zorg voor een mengsel van suiker en gist (1:1) als voedsel samen met een waterbron nadat de volwassenen eclose (figuur 2A, B). De opfokomstandigheden zijn 55% relatieve vochtigheid (RV), 26,5 ° C en een 14:10 L / D-cyclus (lichten aan om zes uur 's ochtends, lichten uit om acht uur 's avonds).
  2. De meeste volwassenen bereiken 10 dagen na opkomst geslachtsrijpheid. Zorg voor een geschikte omgeving om volwassen vliegen zoveel mogelijk te helpen paren. Gebruik idealiter een lichtstandaard met een licht van 30-50 lux. Dit kan de vruchtbaarheid van vrouwtjes verbeteren, waardoor de efficiëntie van het verzamelen van embryo's wordt verbeterd.
    OPMERKING: Het plaatsen van de volwassenen (5-6 dagen na opkomst) in een slecht verlichte (<100 lux) omgeving kan de paring bevorderen. Over het algemeen vindt de piek van ovipositie plaats om 15:00 uur (14:10 / L: D, lichten aan 06:00 uur, lichten uit om 20:00 uur); om voldoende embryo's te verkrijgen, wordt aanbevolen om ovipositiekamers 30 minuten voor 15:00 uur in de kooien te plaatsen.
  3. Plaats een gaas van 200 mazen in de ovipositiekamer, op 1-2 mm afstand van het deksel van de kamer. Dit zal helpen bij het verkrijgen van zoveel mogelijk embryo's.
    OPMERKING: Vermijd het laten weken van de embryo's in sinaasappelsap of ingewreven met gaas, omdat dit de overlevingskans van de embryo's aanzienlijk kan verminderen.
  4. Plaats een nieuwe ovipositiekamer in de kooi wanneer de micro-injectie-opstelling klaar is. Verzamel de embryo's elke 10 minuten met een fijne natte borstel en lijn ze vervolgens uit op een zelfgemaakte injectieplaat (plexiglas met een lengte van 55 mm, een breedte van 13,75 mm en een hoogte van 5 mm, A 45 mm x 5 mm x 0,3 mm ondiepe groef wordt in het midden geopend om de plaatsing van eieren te vergemakkelijken). Als de embryo's een hoge inwendige druk hebben, is lichte uitdroging bij <10% RV gedurende 10 minuten optioneel. Dompel de embryo's tijdens de injectie in halocarbonolie om verdere uitdroging te voorkomen (figuur 2C).

3. Micro-injectie van het embryo

  1. Bereid de glazen injectienaald voor met een micropipettetrekker.
    OPMERKING: Het instellen van de parameters volgens de gebruikershandleiding is belangrijk. In deze protocollen kunnen verschillende naaldvormen worden gemaakt met behulp van de parameters die worden voorgesteld door de handleiding van de micropipettetrekker. Het glazen capillair moet zo schoon mogelijk zijn om te voorkomen dat stof de naald verstopt.
  2. Bereid de werkoplossing voor. Meng het Cas9-eiwit en het bijbehorende sgRNA tot de volgende werkconcentraties: sgRNA, 300 ng/μL; Cas9-eiwit, 150 ng/μL. Voeg 1 μL fenolrood toe aan het mengsel om te dienen als een handige manier om geïnjecteerde embryo's te markeren. Plaats het bereide mengsel op ijs om afbraak van het sgRNA te voorkomen.
    OPMERKING: Gebruik nucleasevrije pipetpunten en PCR-buizen. De concentratie Cas9-eiwit moet lager zijn dan of gelijk zijn aan 150 ng/μL; hogere concentraties zijn giftig en verminderen de overlevingskans van het embryo aanzienlijk. Cas9 kan ook in DNA- of mRNA-formaat worden geleverd om succesvolle genbewerking te bereiken17,19. In dit protocol wordt Cas9-eiwit aanbevolen omdat mRNA's gevoelig zijn voor afbraak en de expressie van Cas9-eiwit uit plasmide-DNA tijd nodig heeft voor transcriptie en translatie.
  3. Stel de parameters voor de injector in. Het initiële programma is Pi-500 hPa, Ti-0.5 s en PC-200 hPa. Pas deze parameters indien nodig verder aan tijdens micro-injectie.
  4. Voeg 3 μL van het mengsel toe aan de injectienaald. Vermijd het introduceren van luchtbellen die mogelijk de naald kunnen verstoppen. Open de naald met een Microgrinder.
  5. Sluit de naald aan op de micromanipulator volgens de gebruikershandleiding (figuur 2E).
  6. Leg het bord met opgestelde embryo's op de objectieve tafel. Pas de positie van de micropipette aan onder een fijne optische microscoop en zet de micropipette en het embryo op hetzelfde vlak. Pas het druppelvolume aan door op het pedaal te drukken; 1/10 het volume embryo's wordt aanbevolen.
  7. Steek de naaldpunt in de achterste (plantaardige pool) van het embryo. Breng de mengsels in het embryo door het pedaal van de injector in te drukken. Als fenolrood wordt toegevoegd, wordt onmiddellijk een enigszins roodachtige kleur waargenomen.
    OPMERKING: Een klein volume cytoplasmatische terugstroom uit het gaatje zal de overlevingskans van het embryo niet verminderen. Injectie van 200 embryo's is voldoende voor een succesvolle mutagenese van één gen. Het toevoegen van meer halocarbonolie om de embryo's onder te dompelen, kan verdere uitdroging voorkomen. De injectie moet worden uitgevoerd vóór de vorming van poolcellen, wat ervoor zorgt dat elke mutatie efficiënt kan worden geërfd.

4. Insectenopfok na injectie

  1. Plaats de injectieplaat met de geïnjecteerde embryo's in een kunstmatige klimaatkamer die op 55% RV, 26,5 ° C en een 14: 10 L / D-cyclus wordt gehouden (lichten aan om zes uur 's ochtends, lichten uit om acht uur 's avonds).
  2. Na injectie duurt de embryovorming meestal 24 uur om te voltooien en 36 uur om uit te komen. Gebruik een fijnborstel om de larven over te brengen op een voorbereid larvaal dieet. Verzamel larven drie of vier keer per dag totdat er geen larven meer uitkomen. Over het algemeen hebben larven 2-3 dagen nodig om het uitkomen te voltooien en binnen 7 dagen te verpoppen.
    OPMERKING: Een op maïs gebaseerd dieet werd gebruikt om de larven te voeden. Het recept bevat 150 g maïsmeel, 150 g banaan, 0,6 g natriumbenzoaat, 30 g gist, 30 g sucrose, 30 g keukenpapier, 1,2 ml zoutzuur en 300 ml water29. Minimaliseer de tijd dat larven in olie achterblijven (<2 uur). Verplaats de larven onmiddellijk na het uitkomen zo ver mogelijk naar het dieet. Dit kan de overlevings- en verpoppingspercentages aanzienlijk verhogen. Geef niet te veel dieet (een dieet met 2/3 van een petrischaaltje van 90 mm is genoeg voor 30 larven); anders zal het beschimmelend worden en de overlevingskans van de larven verminderen.
  3. Leg de volwassen larven in het natte zand om te verpoppen. De verpoppingsfase duurt ongeveer 10 dagen. Verplaats de poppen naar plastic kooien voordat de eclosie begint.

5. Screening van mutanten

  1. Een stroomschema van de mutantenscreening is geïllustreerd in figuur 3A. Kruis G0-volwassenen verkregen door micro-injectie met wild-type volwassenen om heterozygote lijnen te verkrijgen. Controleer het type mutaties dat de nakomelingen (G1) dragen door genotypering.
  2. Kruis G1 met hetzelfde mutante genotype om homozygote lijnen in G2 te verkrijgen. Als genotypen van de mutanten in G1 totaal verschillend zijn, kruis dan de heterozygoten met wild-type vliegen. Homozygote lijnen worden meestal verkregen in G3. Onderhoud twee of drie homozygote lijnen voor volgende fenotyperingsexperimenten.
  3. Gebruik het genomische DNA van een vers poparium of een enkel middenbeen van individuele volwassenen om genotypering uit te voeren. Ontwerp specifieke primers om het doelgebied te versterken; de primers moeten ten minste 50 bps stroomopwaarts en stroomafwaarts van de doellocatie zetten. Raadpleeg stap 1.2 voor de details van de primer.
    OPMERKING: Aangezien de hoeveelheid DNA in een poparium extreem laag is, worden commercieel verkrijgbare DNA-extractiekits aanbevolen.
  4. Voer PCR uit met de volgende fietsomstandigheden: 98 °C gedurende 3 minuten, gevolgd door 35 cycli van 98 °C gedurende 10 s, 15 s bij een gloeitemperatuur die geschikt is voor de ontworpen primers, 72 °C gedurende 35 s, gevolgd door een laatste verlenging van 72 °C gedurende 10 minuten.
  5. Volg de gezuiverde PCR-producten op een rij. Wanneer meerdere overlappende pieken naast de doellocatie worden gedetecteerd (figuur 3B), is succesvolle mutagenese opgetreden. Sub-kloon de gezuiverde PCR-producten in een stompe eindvector en selecteer 10 individuele bacteriekolonies voor sequencing om het genotype van de mutanten te verifiëren. Behoud de lijnen met frameshiftmutaties en voortijdige translatie-beëindigingen (figuur 3C).
    OPMERKING: Het is niet nodig om single clone sequencing uit te voeren om het genotype van G0-individuen te verifiëren. Volg gewoon de PCR-producten en onderhoud de individuen met duidelijke meerdere overlappieken naast de doellocatie. Na de eerste injectie wordt aanbevolen om 10 embryo's te selecteren om genomisch DNA te extraheren en de PCR-producten te sequencen op basis van de normen in stap 5.3. Dit kan helpen om de mutatiesnelheden van tevoren te voorspellen. In deze studie werd sanger sequencing om het genotype te bepalen gedaan door een sequencing bedrijf.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol presenteert gedetailleerde stappen voor de ontwikkeling van B. dorsalis-mutanten met behulp van CRISPR / Cas9-technologie, inclusief representatieve resultaten van gDNA-selectie, het verzamelen van embryo's en micro-injectie, insectenonderhoud en mutantenscreening.

Het voorbeeld van de doellocatie van het geselecteerde gen bevindt zich in het derde exon (figuur 1C). Deze site is zeer geconserveerd en een enkele band werd gedetecteerd door gel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het CRISPR/Cas9-systeem is de meest gebruikte genbewerkingstool en heeft verschillende toepassingen, zoals gene threpy30, crop breeding31 en basisstudies van genfuctions32. Dit systeem is al toegepast voor genbewerking bij verschillende insectensoorten en heeft gediend als een effectief hulpmiddel voor functionele genstudies bij plagen. De protocollen die we hier presenteren, standaardiseren de procedure voor het ontwerp en de synthese van gids-RNA's...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272) en speciale fondsen voor innovatie op het gebied van wetenschapstechnologie en industriële ontwikkeling van Shenzhen Dapeng New District (Grant No. PT202101-02).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
6x DNA Loading BufferTransGen BiotechGH101-01
Kunstmatige klimaatkamerShangHai BluePardMGC-350P
AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction KitAxygenAP-MN-MS-GDNA-250G
BLATNANAVoor het zoeken naar potentiële genloci in het genoom
Capillair glasWPI 1B100F-4
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulatorEppendorfInjectMan 4
GeneArt Precision gRNA Synthese KitThermo Fisher ScientificA29377
Hisat2NANAVoor het uitlijnen van het transcriptoom met de verworven genloci
IGVNANAVoor het visualiseren van de resultaten van Transdecoder
MicrogrinderNARISHIGEEG-401
Olympus MicroscoopOlympus CorporationSZ2-ILST
pEASY-Blunt Cloning KitTransGen BiotechCB101-02https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf
Fenol rood oplossingSigma-AldrichP0290-100ML
Pipet kookboek 2018 P-97 & P-1000 Micropipet PullersInstrument Company https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf
PrimeSTAR HS (Premix)Takara Biomedical TechnologyR040A
SAMtoolsNANAVoor het genereren van de gesorteerd bam bestanden
sgRNAcas9-AINANAsgRNA ontwerp
http://123.57.239.141:8080/home
Sutter Micropipet Puller Sutter Instrument Company P-97
Trans2K DNA MarkerTransGen BiotechBM101-02
TransdecoderNANAVoor het combineren van de resultaten van geassembleerde transcripten en genloci informatie
https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0
TrueCut Cas9 Eiwit v2Thermo Fisher ScientificA36498
Ultra-trace biologische detectorThermo Fisher ScientificNanodrop 2000C

Referenties

  1. Christenson, L. D., Foote, R. H. Biology of fruit flies. Annual Review of Entomology. 5 (1), 171-192 (1960).
  2. Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. Plant Quarantine. 27 (3), 50-56 (2013).
  3. Jin, M., et al. Chemical control measures and drug resistance management of Bactrocera dorsalis. Agrochemicals. 60 (1), 1-5 (2021).
  4. Yang, B., Liu, Y., Wang, B., Wang, G. Olfaction-based behaviorally manipulated technology of pest insects: research progress, opportunities and challenges. Bulletin of National Natural Science Foundation of China. 34 (4), 441-446 (2020).
  5. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  6. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  7. Pyzocha, N. K., et al. RNA-guided genome editing of mammalian cells. Gene Correction. , Humana Press. Totowa, NJ. 269-277 (2014).
  8. Weiss, D., et al. CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 37(2014).
  9. Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
  10. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  11. Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (8), 681-683 (2013).
  12. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  13. Li, H., et al. Generating mutant Aedes aegypti mosquitoes using the CRISPR/Cas9 system. STAR protocols. 2 (2), 100432(2021).
  14. Zhu, G. -H., et al. Expanding the toolkit for genome editing in a disease vector, Aedes aegypti: transgenic lines expressing Cas9 and single guide RNA induce efficient mutagenesis. The CRISPR Journal. 4 (6), 846-853 (2021).
  15. Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
  16. Liu, Q., et al. Deletion of the Bombyx mori odorant receptor co-receptor (BmOrco) impairs olfactory sensitivity in silkworms. Insect Biochemistry & Molecular Biology. 86, 58-67 (2017).
  17. Zhao, S., et al. Efficient somatic and germline genome engineering of Bactrocera dorsalis by the CRISPR/Cas9 system. Pest Management Science. 75 (7), 1921-1932 (2019).
  18. Bai, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of the eye pigmentation gene white leads to alterations in colour of head spots in the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis. Insect Molecular Biology. 28 (6), 837-849 (2019).
  19. Zheng, W., et al. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae). Insect Molecular Biology. 28 (2), 222-234 (2019).
  20. Kent, W. J. BLAT-the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12 (4), 656-664 (2002).
  21. Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
  22. Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), (2021).
  23. Kovaka, S., et al. Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2. Genome Biology. 20 (1), 278(2019).
  24. TransDecoder. , Available from: https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 (2018).
  25. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
  26. Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
  27. Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448(2014).
  28. Zheng, Q. P., et al. Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. Biotechniques. 57 (3), 115-124 (2014).
  29. Ren, L., et al. Rectal bacteria produce sex pheromones in the male oriental fruit fly. Current Biology. 31 (10), 2220-2226 (2021).
  30. Xiao, Q., et al. Application of CRISPR/Cas9-based gene editing in HIV-1/AIDS therapy. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 69(2019).
  31. El-Mounadi, K., et al. Principles, applications, and biosafety of plant genome editing using CRISPR-Cas9. Frontiers in Plant Science. 11, 56(2020).
  32. Hsu, P. D., et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  33. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  34. Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa armigera (Hübner). Journal of Visualized Experiments. (173), e62068(2021).
  35. Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448(2014).
  36. Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
  37. Zhu, G. H., et al. Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).
  38. Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  39. Gabrieli, P., et al. Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Genbewerkingembryo microinjectiesynthese van gids RNAscreening van mutantenfunctioneel genonderzoekbestrijding van insectenplagenpolymerasekettingreactiegelelektroforese

Gerelateerde artikelen