Bereiding van cytoplasmatische en nucleaire lange RNA's uit primaire en gekweekte cellen

Samenvatting

Het huidige protocol biedt een efficiënte en flexibele methode om RNA te isoleren uit nucleaire en cytoplasmatische fracties met behulp van gekweekte cellen en vervolgens te valideren met behulp van qPCR. Dit dient effectief als vervanging voor andere RNA-voorbereidingskits.

Samenvatting

De scheiding van intracellulaire componenten is al vele jaren een belangrijk hulpmiddel in de cellulaire biologie en heeft nuttig inzicht kunnen geven in hoe hun locatie hun functie kan beïnvloeden. In het bijzonder is de scheiding van nucleair en cytoplasmatisch RNA belangrijk geworden in de context van kankercellen en de zoektocht naar nieuwe doelen voor geneesmiddelen. Het kopen van kits voor nucleair-cytoplasmatische RNA-extractie kan duur zijn wanneer veel van de vereiste materialen te vinden zijn in een typische laboratoriumomgeving. Met behulp van de huidige methode, die duurdere kits of andere tijdrovende processen kan vervangen, zijn alleen een zelfgemaakte lysisbuffer, een benchtopcentrifuge en RNA-isolatiezuiveringskolommen nodig om nucleair en cytoplasmatisch RNA te isoleren. Lysisbuffer wordt gebruikt om het buitenmembraan van de cel zachtjes te lyseren zonder de integriteit van de nucleaire envelop aan te tasten, waardoor de intracellulaire componenten kunnen worden vrijgegeven. Vervolgens kunnen de kernen worden geïsoleerd door een eenvoudige centrifugatiestap, omdat ze een hogere dichtheid hebben dan de lysisoplossing. Centrifugatie wordt gebruikt om deze gebieden te scheiden op basis van hun dichtheidsverschillen om subcellulaire elementen in de kern te isoleren van die in het cytoplasma. Zodra de centrifugatie de verschillende componenten heeft geïsoleerd, wordt een RNA-opruimkit gebruikt om het RNA-gehalte te zuiveren en wordt qPCR uitgevoerd om de scheidingskwaliteit te valideren, gekwantificeerd door de hoeveelheid nucleair en cytoplasmatisch RNA in de verschillende fracties. Statistisch significante niveaus van scheiding werden bereikt, wat de effectiviteit van het protocol illustreert. Bovendien kan dit systeem worden aangepast voor de isolatie van verschillende soorten RNA (totaal, klein RNA, enz.), Wat gerichte bestudering van cytoplasma-nucleusinteracties mogelijk maakt en helpt bij het begrijpen van de verschillen in de functie van RNA die zich in de kern en het cytoplasma bevinden.

Inleiding

Cellulaire fractionering in subcellulaire componenten maakt de isolatie en studie van gedefinieerde biochemische domeinen mogelijk en helpt bij het bepalen van de lokalisatie van specifieke cellulaire processen en hoe dit hun functie kan beïnvloeden¹. Isolatie van RNA van verschillende intracellulaire locaties kan zorgen voor een verbeterde nauwkeurigheid van genetische en biochemische analyse van transcriptieniveaugebeurtenissen en andere interacties tussen de kern en het cytoplasma, wat dient als het primaire doel van het huidige protocol². Dit protocol is ontwikkeld om de isolatie van cytoplasmatische en nucleaire RNA....

Protocol

K562-cellen worden gebruikt voor deze studie. Dit protocol is geoptimaliseerd om te werken voor 1 x 10^6-5 x 10⁶ miljoen cellen. De procedure kan echter worden opgeschaald voor grotere celhoeveelheden door de volumes op de juiste manier te verhogen.

1. Voorbereiding van de 0,25x lysisbuffer

1. Bereid 0,25x lysisbuffer voor door de volgende componenten in tabel 1A te mengen.
   OPMERKING: Monsters vereisen ongeveer 300 μL van 0,25x lysisbuffer. Aanbevolen volume = aantal monsters x 300 μL.

2. Scheiding van nucleaire en cytoplasmatische fract....

Resultaten

Om er zeker van te zijn dat nucleaire en cytoplasmatische isolatie was bereikt, werd een qPCR uitgevoerd om de resultaten te valideren. Daarbij werden primers gebruikt die specifiek zijn voor het gebied van belang om de nucleaire en cytoplasmatische fractioneringsniveaus aan te tonen. In deze studie werden MALAT1 en TUG1 gebruikt als respectievelijk nucleaire en cytoplasmatische primers. Samen maken ze het mogelijk om hoge niveaus van nucleaire fractionering aan te tonen met MALAT1 als een positieve controle voor nucleai.......

Discussie

Gedurende het protocol werden enkele stappen ondernomen om de elementen te optimaliseren om het meest effectief te zijn voor de cellijn van belang. Hoewel de stappen binnen het protocol relatief eenvoudig zijn, kunnen analyse en kleine aanpassingen tijdens kritieke aspecten van het protocol nodig zijn. De meest kritische stap in het protocol is het wijzigen van de concentratie van de lysisbuffer tot een juiste concentratie op basis van de cellijn van belang en het cellulaire doelwit. Aangezien het gebruik van lysisbuffer.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	Het Agilent TapeStation-systeem is een geautomatiseerde elektroforese-oplossing voor de monsterkwaliteitscontrole van DNA- en RNA-monsters.
0.5% Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Gebruikt bij het maken van lysisbuffer
50 mM Tris-Cl pH 8.0	Thermo-Fischer	15568025	Gebruikt bij het maken van lysisbuffer
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Gebruikt voor bevestiging van Nucleaire fractie.
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode	Thermo-Fischer	4326659	De Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate met barcode is geoptimaliseerd om ongeëvenaarde temperatuurnauwkeurigheid en uniformiteit te bieden voor snelle, efficiënte PCR-amplificatie. Deze plaat, geconstrueerd uit een enkel stuk van rigide polypropyleen in een 96-well formaat, is compatibel met Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR-systemen en thermische cyclers.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo-Fischer	4311971	De Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film vermindert de kans op vervuiling tussen de wells en verdamping van monsters wanneer het wordt toegepast op een microplaat tijdens qPCR
PBS	Gibco	20012-023	Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) is een gebalanceerde zout oplossing die wordt gebruikt voor verschillende celkweek toepassingen, zoals het wassen van cellen voorafgaand aan dissociatie, het transporteren van cellen of weefselmonsters, het verdunnen van cellen voor het tellen en het bereiden van reagentia.
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA cleanup kits maken efficiënte RNA cleanup van enzymatische reacties en opruiming van RNA mogelijk dat gezuiverd is door verschillende methoden. Bevat RW1, RLT, RW1 buffers vermeld in het protocol.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR software gebruikt tijdens het protocol. Bevat Design en Analysis Software voor het analyseren van fractionering monsters
RLT Buffer	Qiagen	79216	Lysis buffer van RNA clean-up kit
RPE Buffer	Qiagen	1018013	Wasbuffer van RNA clean-up kit
RW1 Buffer	Qiagen	1053394	Wasbuffer van RNA clean-up kit
Taqman Gene Expression Assays	Thermo-Fischer	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays vertegenwoordigen de grootste verzameling vooraf ontworpen assays in de industrie met meer dan 2,8 miljoen assays voor 32 eukaryote soorten en talrijke microben. TaqMan Gene Expression assays stellen u in staat om snel resultaten te krijgen zonder tijd te verspillen aan het optimaliseren van SYBR Green primers en zonder extra tijd te besteden aan het uitvoeren en analyseren van smeltcurven.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix is de ideale reagensoplossing wanneer u een master mix nodig hebt voor meerdere 5' nuclease DNA-toepassingen. Applied Biosystems reagentia zijn gevalideerd met TaqMan assays en Applied Biosystems real-time systemen om gevoelige, nauwkeurige en betrouwbare prestaties te garanderen, elke keer.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	Gebruikt voor bevestiging van Cytoplasmatische fractie.
UltraPure DEPC-Treated Water	Thermo-Fischer	750024	UltraPure DEPC-behandeld water is geschikt voor gebruik met RNA. Het wordt bereid door incubatie met 0,1% diethylpyrocarbonaat (DEPC), en wordt vervolgens geautoclaveerd om het DEPC te verwijderen. Sterile gefilterd.