Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Onderzoek naar microbiële samenwerking via beeldvorming massaspectrometrie analyse van bacteriekolonies gekweekt op agar en in weefsel tijdens infectie

2.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64200

⸱

18 november 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Florida, 2Division of Protective Immunity, Children’s Hospital of Philadelphia, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

In dit artikel

Samenvatting

Een nieuwe monstervoorbereidingsmethode wordt gedemonstreerd voor de analyse van op agar gebaseerde, bacteriële macrokolonies via matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatiebeeldvorming massaspectrometrie.

Samenvatting

Het begrijpen van de metabole gevolgen van microbiële interacties die optreden tijdens infectie vormt een unieke uitdaging op het gebied van biomedische beeldvorming. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) imaging massaspectrometrie vertegenwoordigt een labelvrije, in situ beeldvormingsmodaliteit die in staat is om ruimtelijke kaarten te genereren voor een breed scala aan metabolieten. Hoewel dun gesneden weefselmonsters nu routinematig worden geanalyseerd via deze technologie, blijven beeldvormende massaspectrometrie-analyses van niet-traditionele substraten, zoals bacteriekolonies die vaak op agar worden gekweekt in microbiologisch onderzoek, een uitdaging vanwege het hoge watergehalte en de ongelijke topografie van deze monsters. Dit artikel demonstreert een monstervoorbereidingsworkflow om massaspectrometrieanalyses van deze monstertypen mogelijk te maken. Dit proces wordt geïllustreerd met behulp van bacteriële co-cultuur macrokolonies van twee gastro-intestinale pathogenen: Clostridioides difficile en Enterococcus faecalis. Het bestuderen van microbiële interacties in deze goed gedefinieerde agar-omgeving blijkt ook een aanvulling te zijn op weefselstudies die gericht zijn op het begrijpen van microbiële metabole samenwerking tussen deze twee pathogene organismen in muismodellen van infectie. Imaging massaspectrometrie analyses van de aminozuur metabolieten arginine en ornithine worden gepresenteerd als representatieve gegevens. Deze methode is breed toepasbaar op andere analyten, microbiële pathogenen of ziekten, en weefseltypen waarbij een ruimtelijke maat van cellulaire of weefselbiochemie gewenst is.

Inleiding

Het menselijk microbioom is een zeer dynamisch ecosysteem met moleculaire interacties van bacteriën, virussen, archaea en andere microbiële eukaryoten. Hoewel microbiële relaties de afgelopen jaren intensief zijn bestudeerd, moet er nog veel worden begrepen over microbiële processen op chemisch niveau 1,2. Dit is deels te wijten aan de onbeschikbaarheid van tools die in staat zijn om complexe microbiële omgevingen nauwkeurig te meten. Vooruitgang op het gebied van imaging massaspectrometrie (IMS) in het afgelopen decennium heeft in situ en labelvrije ruimtelijke mapping van vele metabolieten, lipiden en eiwitten in biologische substraten mogelijk gemaakt 3,4. Matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) is naar voren gekomen als de meest voorkomende ionisatietechniek die wordt gebruikt bij het afbeelden van massaspectrometrie, waarbij een UV-laser wordt gebruikt om materiaal van het oppervlak van een dunne weefselsectie af te breken voor meting door massaspectrometrie4. Dit proces wordt vergemakkelijkt door de toepassing van een chemische matrix die homogeen op het oppervlak van het monster wordt aangebracht, waardoor opeenvolgende metingen in een rasterpatroon over het monsteroppervlak kunnen worden uitgevoerd. Heatmaps van analytionintensiteiten worden vervolgens gegenereerd na gegevensverzameling. Recente ontwikkelingen in ionisatiebronnen en bemonsteringstechnieken hebben de analyse mogelijk gemaakt van niet-traditionele substraten zoals bacteriële5 en zoogdier 6,7,8 cellulaire monsters gekweekt op voedingsagar. De moleculaire ruimtelijke informatie van IMS kan een uniek inzicht geven in de biochemische communicatie van microbe-microbe en gastheer-microbe interacties tijdens infectie 9,10,11,12,13,14.

Bij Clostridioides difficile-infectie (CDI) wordt C. difficile blootgesteld aan een snel veranderende microbiële omgeving in het maagdarmkanaal, waar polymicrobiële interacties waarschijnlijk van invloed zijn op de infectieresultaten15,16. Verrassend genoeg is er weinig bekend over de moleculaire mechanismen van interacties tussen C. difficile en residente microbiota tijdens infectie. Enterokokken zijn bijvoorbeeld een klasse van opportunistische commensale pathogenen in het darmmicrobioom en zijn geassocieerd met een verhoogde gevoeligheid voor en ernst van CDI17,18,19,20. Er is echter weinig bekend over de moleculaire mechanismen van de interacties tussen deze pathogenen. Om de communicatie van kleine moleculen tussen deze leden van het darmmicrobioom te visualiseren, werden bacteriële macrokolonies hierin op agar gekweekt om microbe-microbe-interacties en bacteriële biofilmvorming in een gecontroleerde omgeving te simuleren. Het verkrijgen van representatieve metabole verdelingen bij MALDI-beeldvormingsmassaspectrometrie-analyse van bacteriële cultuurmonsters is echter een uitdaging vanwege het hoge watergehalte en de ongelijke oppervlaktetopografie van deze monsters. Dit wordt grotendeels veroorzaakt door de zeer hydrofiele aard van agar en de niet-uniforme agar-oppervlakterespons tijdens vochtverwijdering.

Het hoge watergehalte van agar kan het ook een uitdaging maken om een homogene MALDI-matrixcoating te bereiken en kan de daaropvolgende MALDI-analyse in vacuo21 verstoren. Veel MALDI-bronnen werken bijvoorbeeld bij een druk van 0,1-10 Torr, wat een voldoende vacuüm is om vocht uit de agar te verwijderen en vervorming van het monster kan veroorzaken. Deze morfologische veranderingen in de agar veroorzaakt door de vacuümomgeving veroorzaken borrelen en scheuren in het gedroogde agarmateriaal. Deze artefacten verminderen de hechting van de agar aan de schuif en kunnen demontage of schilfering van het monster in het instrumentvacuümsysteem veroorzaken. De dikte van de agarmonsters kan tot 5 mm van de schuif zijn, wat onvoldoende speling van ionoptiek in het instrument kan veroorzaken, waardoor verontreiniging en / of schade aan de ionoptiek van het instrument kan ontstaan. Deze cumulatieve effecten kunnen resulteren in vermindering van het ionensignaal dat de oppervlaktetopografie reflecteert, in plaats van de onderliggende microbiële biochemische interacties. Agarmonsters moeten homogeen worden gedroogd en sterk aan een microscoopglaasje worden gehecht voordat ze in vacuo worden geanalyseerd.

Dit artikel demonstreert een monstervoorbereidingsworkflow voor het gecontroleerd drogen van bacteriecultuur macrokolonies gekweekt op agar media. Dit meerstaps, langzamere droogproces (ten opzichte van de eerder gemelde) zorgt ervoor dat de agar gelijkmatig zal uitdrogen, terwijl de effecten van borrelen of kraken van agarmonsters die op microscoopglaasjes zijn gemonteerd, worden geminimaliseerd. Door deze geleidelijke droogmethode worden monsters sterk aan de microscoopplaat gehecht en zijn ze geschikt voor latere matrixtoepassing en MALDI-analyse. Dit wordt geïllustreerd met behulp van model bacteriële kolonies van C. difficile gekweekt op agar en murine weefselmodellen met CDI met en zonder de aanwezigheid van commensale en opportunistische pathogenen, Enterococcus faecalis. MALDI imaging massaspectrometrie-analyses van zowel bacteriële als weefselmodellen maken het mogelijk om aminozuurmetabolietprofielen ruimtelijk in kaart te brengen, wat nieuw inzicht biedt in bio-energetisch microbieel metabolisme en communicatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Dierproeven werden goedgekeurd door de Animal Care and Use Committees van het Children's Hospital of Philadelphia en de University of Pennsylvania Perelman School of Medicine (protocollen IAC 18-001316 en 806279).

LET OP: Clostridium difficile (C. difficile) en Enterococcus faecalis (E. faecalis) zijn BSLII-pathogenen en moeten met uiterste voorzichtigheid worden behandeld. Gebruik indien nodig de juiste ontsmettingsprotocollen.

1. Groei van bacteriecultuur macrokolonies en voorbereiding voor nachtelijke verzending

  1. Bereid C. difficile en E. faecalis nachtculturen en kweek ze afzonderlijk bij 37 °C in een anaerobe kamer (85% stikstof, 10% waterstof, 5% koolstofdioxide) in hersen-hart-infusiebouillon aangevuld met 0,5% gistextract en 0,1% l-cysteïne (BHIS). Gebruik 1,5% agar voor alle vergulde monsters.
  2. Normaliseer de bacteriekweekmedia tot optische dichtheid bij 600 nm (OD600). Plaat 5 μL van elke macrokolonie op BHIS + l-cysteïne agarplaten en groei anaeroob gedurende 7 dagen bij 37 °C. Voor macrokolonies van gemengde soorten mengt u de bacteriële kweekmedia in een verhouding van 1:1 voordat u ze platlegt.
  3. Bereid indiumtinoxide (ITO)-gecoate microscoopglaasjes voor met behulp van een ohmmeter om de zijkant van de dia met de geleidende coating te identificeren. Gebruik een scribent met diamantpunt om de met ITO gecoate zijde van de microscoopglaasje te etsen en te labelen.
  4. Snijd de hele cultuur uit de agar-groeischijf en monteer deze vervolgens op een met ITO gecoate microscoopglaasje terwijl u ervoor zorgt dat luchtbellen niet tussen de agar en de dia worden gevangen.
    OPMERKING: Het watergehalte in de agarmedia moet ervoor zorgen dat de cultuur zich op natuurlijke wijze aan het oppervlak van de microscoopglaasje kan hechten. Een video die dit proces illustreert, is te vinden in de aanvullende documentatie van Yang et al.22.
  5. Plaats de kolonies in microscoopglaasjes ter bescherming. Bewaar de schuifdozen in 8 in x 8 in transportzakken met biohazard monsters met een handvol droogmiddelkorrels en verzegel ze voor verzending 's nachts voor verdere verwerking en analyse.
    OPMERKING: Het is belangrijk om een droge omgeving voor de bacterieculturen te handhaven wanneer ze onder omgevingsomstandigheden worden verzonden om de bacteriegroei en het metabolisme te vertragen en de fixatie van de bacteriële monsters tot de analyse te behouden. Deze verzendmethode is geoptimaliseerd door uitgebreide experimenten en heeft de voorkeur boven het verzenden van de kolonies bevroren in droogijs. Grote temperatuurveranderingen voorafgaand aan het drogen hebben de neiging om demontage en borrelen onder het gemonteerde agarmonster te veroorzaken.

2. Omgevingsdroging van C. difficile + E. faecalis bacteriële macrokolonies

  1. Verwijder de agarose bacteriekolonies gemonteerd op ITO-gecoate microscoopglaasjes uit het verpakkingsmateriaal. Plaats de monsters in een droge doos met droogmiddel gedurende 48-72 uur bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Dit is een mild en langzaam droogproces dat borrelen, barsten of loslaten van de agarmedia van het oppervlak van de microscoopglaasje minimaliseert.
  2. Gooi al het verontreinigde verpakkingsmateriaal op de juiste manier weg en ontsmet de werkruimte met een geschikt bacteriedodend/sporicide desinfectiemiddel.
  3. Inspecteer de kolonies visueel op vervormingen in het agaroppervlak (bijv. Borrelen, barsten, demonteren).
    OPMERKING: De hoogte van het agarose-oppervlak moet zichtbaar afnemen en plat over de glijbaan liggen.

3. Vacuüm en warmtegemedieerd drogen van C. difficile + E. faecalis bacteriële macrokolonies

OPMERKING: Een op maat gemaakt vacuümdroogapparaat (figuur 1) is gebouwd om het verwijderen van overtollig vocht uit de agarmonsters te vergemakkelijken. Dit apparaat maakt gebruik van een draaischuifvacuümpomp die in lijn is aangesloten op een HEPA-biofilter, een koudeval en een roestvrijstalen kamer, waar de bacteriële monsters worden geplaatst. Een variabele spanningstransformator is aangesloten op een geïsoleerde draaddraad, waardoor de gebruiker de kamer kan verwarmen om het droogproces te versnellen.

  1. Sluit de vacuümleiding naar de monsterkamer en schakel de aan/uit-schakelaar naar de draaischuifpomp in om de vacuümpomp te laten opwarmen en de juiste vacuümdruk te bereiken.
  2. Schakel de variabele spanningstransformator in om de draaddraaddraad die rond de kamer is gewikkeld op te warmen. Pas de variabele voeding aan totdat de interne temperatuur van de vacuümkamer ~ 50 °C bereikt. Terwijl de pomp opwarmt, plaatst u een slurry van droogijs en 100% ethanol in de condensor van de koudeval.
    OPMERKING: De koudevanger condenseert dampen of sporen uit het monster en voorkomt verontreiniging van het draaischuifpompsysteem en de vacuümpompolie.
  3. Open de vacuümkamer door met een moersleutel de 16 mm dubbele klauwflensklemmen los te maken. Steek de agarosemonsters in de kamer en sluit de kamer goed af met de 16 mm dubbele klauwflensklemmen.
  4. Open de pompklep om de kamer te evacueren. Laat de monsters 60-120 minuten drogen (bijvoorbeeld bij ~150 mTorr).
    OPMERKING: Deze droogtijd is voldoende om het meeste vocht in kleine agarsecties te verwijderen. Empirische bepaling van de optimale droogtijd voor vochtverwijdering en het verlagen van de agarhoogte kan nodig zijn, afhankelijk van de individuele opstelling en monsters. Aanzienlijk langere droogtijden kunnen ervoor zorgen dat de gedroogde agar broos wordt en vatbaar is voor barsten.
  5. Wanneer u klaar bent, ontlucht u de vacuümkamer langzaam tot omgevingsdruk door de klep op de draaischuifpomp te sluiten en de externe klep te openen voor omgevingslucht. Open de kamer met behulp van het eerder genoemde protocol en verwijder het gedroogde agarosemonster uit de kamer.
  6. Bewaar het monster in een droge doos met droogmiddel totdat het matrix is aangebracht.
    OPMERKING: Figuur 2 toont afbeeldingen van het agaroppervlak voor en na het drogen.

4. MALDI matrix applicatie via robotspuiten

OPMERKING: Nadat de agarosemonsters grondig zijn gedroogd en de hoogte van de kweeksecties merkbaar is afgenomen, gebruikt u een robotmatrixspuit om homogeen een dunne coating van een chemische MALDI-matrixverbinding aan te brengen. Deze procedure moet worden uitgevoerd in een chemische zuurkast en met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen, laboratoriumbrillen en een laboratoriumjas.

  1. Selecteer de juiste MALDI-matrix. Om dit protocol te volgen, gebruikt u de 1,5-diaminonaftaleen (DAN) MALDI-matrix voor zijn gunstige desorptie en ionisatie van aminozuren in negatieve ionenmodus.
  2. Bereid 10 ml van een 10 mg/ml DAN MALDI matrixoplossing in 90/10 (v/v) acetonitril/water. Gebruik oplosmiddelen van HPLC-kwaliteit, soniceer gedurende 30 minuten en filter de oplossing door 0,2 μm nylon spuitfilters voordat u de robotspuitpomp introduceert. Bereid bovendien wasoplossingen voor om ervoor te zorgen dat de spuitlijn schoon is tussen elk gebruik.
    OPMERKING: Wasoplossingen worden gekozen om de oplosbaarheid van de matrix en andere verontreinigingen in de spuitlijn te vergroten en hun verwijdering uit het systeem te vergemakkelijken. De wasoplossingen die hierin worden gebruikt zijn 90/10 (v/v) acetonitril/water, 50/50 (v/v) water/methanol, 99/1 (v/v) acetonitril/azijnzuur en 95/5 (v/v) water/ammoniumhydroxide.
  3. Bevestig het monster aan de spuitbak en laad de bereide oplossingen in de spuitlijn (figuur 3). Specificeer met behulp van de computersoftware de noodzakelijke parameters om een uniforme coating van de matrixverbinding mogelijk te maken: 30 °C nozzletemperatuur, acht gangen, 0,1 ml / min-debiet, CC-patroon, 0 s droogtijd, 10 psi.
    OPMERKING: Het is algemeen aanvaard dat de meeste pathogenen worden geïnactiveerd door toepassing van de MALDI-matrix, die meestal een klein organisch zuur of base is.
  4. Nadat de spuitvolgorde is voltooid, haalt u het monster uit de spuitbak en bewaart u het in een uitdrogingskast tot de analyse.

5. Voorbereiding van bacteriële macrokolonies voor MALDI imaging massaspectrometrie data-acquisitie

OPMERKING: Alle imaging massaspectrometrie analyses werden uitgevoerd met behulp van een Fourier transform ion cyclotron resonance (FTICR) massaspectrometer. Dit instrument is uitgerust met een Nd:YAG MALDI lasersysteem (2 kHz, 355 nm).

  1. Plaats het met matrix gecoate monster in de MALDI-doelplaatmicroscoopschuifadapter en schrijf ten minste drie fiduciale markers in die het monstergebied omvatten met behulp van permanente markers (figuur 4). Gebruik een flatbedscanner om een optisch beeld van de microscoopglaasje te verkrijgen, inclusief de fiduciale markers.
    OPMERKING: De fiduciale markers maken de registratie van het optische beeld in het MALDI-camerabeeld dat in het instrument wordt waargenomen, mogelijk.
  2. Definieer een MS-instrumentmethode die is geoptimaliseerd voor het gewenste massabereik, de gewenste gevoeligheid en resolutie, waaronder massakalibratie, MALDI-laserinstellingen, ionoptiekparameters en ICR-celcondities. Selecteer voor deze methode een massavenster van 100 Da van m/z 100 tot 200 voor gasfasesignaalverrijking in negatieve ionenmodus met behulp van een continue accumulatie van geselecteerde ionen (CASI)-benadering,23 die de m/z-waarden van de relevante metabolieten omvat.
  3. Open de beeldacquisitiesoftware van het instrument en gebruik de installatiewizard om de bestandsnaam en -locatie, de MS-acquisitiemethode, de te bemonsteren interessegebieden en de ruimtelijke resolutie van de afbeelding te definiëren.
    OPMERKING: Ruimtelijke resoluties van 100-300 μm worden meestal gebruikt voor bacteriële macrokoloniebeeldvorming.
  4. Zodra alle parameters zijn gedefinieerd, start u de acquisitiereeks om serieel een massaspectrum te verkrijgen bij elke pixel in de gedefinieerde regio of regio's van belang.
    OPMERKING: De beeldacquisitietijd is afhankelijk van de instrumentinstellingen, maar varieert meestal van 2 tot 6 uur voor afbeeldingen met 5.000-10.000 pixels.

6. Beeldvorming massaspectrometrie data-analyse en identificatie van verbindingen

  1. Na het verkrijgen van afbeeldingen slaat u de gegevens op met een bestandsextensie ".mis", een leverancierspecifieke bestandsindeling voor beeldvormingsplatforms voor massaspectrometrie. Open het gegevensbestand in flexImaging- of SCiLS-softwarepakketten of exporteer naar een niet-bedrijfseigen gegevensindeling zoals .mzml en visualiseer met behulp van leveranciersneutrale software (bijv. Cardinal24 of MSIreader25,26).
    OPMERKING: Een gemiddeld massaspectrum wordt weergegeven bij het openen van de beeldgegevens in flexImaging, dat de gemiddelde intensiteiten van alle ionen vertegenwoordigt die in de bemonsterde regio's zijn gedetecteerd. Pieken van belang kunnen voorlopig worden geïdentificeerd op basis van nauwkeurige massametingen. Doorgaans zijn massanauwkeurigheden van meer dan 5 delen per miljoen (ppm) voldoende voor metabolietidentificatie op FTICR-massaspectrometers.
  2. Definieer met behulp van de software waarnaar wordt verwezen massavensters voor interessante pieken om valse kleurenwarmtekaarten van ionverdelingen over de bemonsterde regio's te genereren.
    1. Op de weergave van het gemiddelde massaspectrum zoomt u in op de piek van interesse en selecteert u een geschikt massavenster dat het gebied van het piekprofiel omvat.
    2. Klik met de rechtermuisknop op het gemarkeerde massavenster en selecteer Massafilter toevoegen .... Label de geselecteerde m/z-waarde met behulp van de voorlopige identificatie voor de verdachte metaboliet zoals bepaald door de nauwkeurige massameting met hoge resolutie.
    3. Selecteer de intensiteitsdrempel om het dynamische bereik van de analytafbeelding aan te passen die wordt weergegeven door de heatmap met valse kleuren. Pas de massafilterparameters verder aan zodat het massavenster het gebied van het piekprofiel omvat en voeg vervolgens het massafilter toe.
      OPMERKING: Intensiteitsnormalisatie kan indien nodig worden uitgevoerd om de relatieve kwantificering tussen gemeten regio's te verbeteren. De experimenten hierin maakten gebruik van CASI-gegevensverzameling (vide infra), waardoor de normalisatiemethoden voor het totale ionenaantal (TIC) en het wortelgemiddelde kwadraat (RMS) onnauwkeurig kunnen worden. Als zodanig worden alle ionenafbeeldingen die hierin worden weergegeven, weergegeven zonder normalisatie.

7. Bereiding en verzending van niet-geïnfecteerde controle- en C . difficile-geïnfecteerde cecale weefsels van muizen

  1. Innoculeer 4-8 weken oude C57BL/6 mannelijke muizen met antibiotica (0,5 mg/ml cefoperazon of 0,5 mg/ml cefoperazon + 1 mg/ml vancomycine) in drinkwater ad libitum gedurende 5 dagen, gevolgd door een herstelperiode van 2 dagen en daaropvolgende infectie.
  2. Euthanaseer de dieren door CO 2-asphixiatie en oogst het blindedarmorgaan van de muis onmiddellijk. Inbedden in een 20% mengsel van optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding in gedestilleerd water.
  3. Plaats de monsters op droogijs en verpak en verzend ze vervolgens voor analyse; bewaren bij -80 °C tot de analyse.

8. Cryosectie van niet-geïnfecteerde controleorganen C. difficile -geïnfecteerde cecale weefsels van muizen

  1. Reinig alle cryosectieapparatuur door te spoelen met 100% ethanol en laat drogen voordat u monsters in de cryostaatkamer plaatst. Bereid ITO-gecoate microscoopglaasjes voor met behulp van een ohmmeter om de zijkant van de dia met de geleidende coating te identificeren. Gebruik een scribent met diamantpunt om de met ITO gecoate zijde van de microscoopglaasje te etsen en te labelen.
    OPMERKING: De juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen, laboratoriumbrillen, een laboratoriumjas en cryostaatmouwen, moeten worden gedragen.
  2. Voer cryosectie uit op een cryomicrotoom voor onderzoek. Breng de oct-embedded muis ceca-weefsels over van een -80 °C vriezer naar de cryomicrotoomkamer (30 °C kamertemperatuur, -28 °C objecttemperatuur) op droogijs. Monteer de te vergelijken weefselmonsters met behulp van beeldvormende massaspectrometrie (bijv. niet-geïnfecteerde controle versus C. difficile-geïnfecteerde) op dezelfde microscoopglaasje om een identieke monstervoorbereiding van beide weefseltypen te garanderen en nauwkeurige metabolietvergelijkingen mogelijk te maken.
  3. Monteer in de cryomicrotoomkamer het OCT-ingebedde weefsel op een monsterboor met behulp van een extra OCT-oplossing. Nadat de OCT-oplossing is gestold, bevestigt u de klauwplaat op de monsterkop. Begin met cryosectieren in stappen van 10-50 μm om de gewenste weefseldiepte / vlak van het orgaan te bereiken.
  4. Zodra een optimale doorsnede van het weefsel is bereikt, begint u met het verzamelen van secties met een dikte van 12 μm. Manipuleer het plakje voorzichtig met behulp van kunstenaarspenselen en plaats het op een met teflon gecoate microscoopglaas.
  5. Rol de ITO-gecoate microscoopglaasje bovenop het weefselgedeelte om het weefsel van de met teflon gecoate dia op te pakken. Ontdooi monteer het weefselgedeelte op de microscoopglaasje door de handpalm tegen de achterkant van de met ITO gecoate dia te drukken. Blijf monteren totdat het weefselgedeelte overgaat van doorschijnend naar een ondoorzichtige / matte textuur.
  6. Breng de op weefsel gemonteerde microscoopglaasjes op droogijs over naar een droge doos met droogmiddel voor opslag voor analyse op dezelfde dag, of bewaar bij -80 °C voor opslag op langere termijn.

9. Voorbereiding van niet-geïnfecteerde controle versus C. difficile-geïnfecteerde muizencecale weefsels voor matrixtoepassing en MALDI-beeldvormingsmassaspectrometrie

  1. Voer de MALDI-matrixtoepassing uit met hetzelfde protocol als beschreven in stap 4 (30 ° C nozzletemperatuur, acht gangen, 0,1 ml / min-debiet, CC-patroon, 0 s droogtijd, 10 psi).
  2. Voer MALDI-beeldvormende massaspectrometrie uit met behulp van dezelfde protocollen die worden beschreven in stap 5 en 6.
  3. Analyseer de ionenbeelden van meerdere biologische replicaties en vergelijk de resultaten op significantie via intensiteitsboxplotvergelijkingen met behulp van de statistische SCiLS-software waarnaar hierboven wordt verwezen.
    OPMERKING: De juiste statistische tests en vergelijkingen zijn afhankelijk van de toepassing en kunnen ruimtelijke segmentatie, classificatiemodellen en vergelijkende analyse omvatten voor het bepalen van discriminerende en gecorreleerde spectrale kenmerken. Vergelijkende analyses kunnen bestaan uit het toewijzen van p-waarden aan significante kenmerken, het genereren van hoofdcomponentenanalyses voor weefselvergelijkingen en het visualiseren van boxplots om variaties te identificeren. Het is ook nuttig om het weefsel te visualiseren met behulp van brightfield-microscopie van de weefselsectie gekleurd via hematoxyline en eosine (H &E) na beeldvorming massaspectrometrie. Dit maakt een duidelijke identificatie van morfologische kenmerken in het weefsel mogelijk en kan worden geanalyseerd in overleg met een opgeleide patholoog.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We hebben metaboliet MALDI imaging massaspectrometrie uitgevoerd van model bacteriële kolonies en muizen gecokoloniseerd met E. faecalis en C. difficile om de rol van aminozuren in microbe-microbe interacties te bestuderen. Bacteriële macrokolonies gekweekt op agar dienen als een goed gedefinieerd model om verschillende biochemische veranderingen in bacteriële biofilmvorming te analyseren. Het is belangrijk om te zorgen voor een gecontroleerd droogproces voor bacteriecultuur macrokolonies gekweekt op ag...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Tijdens maldi imaging massaspectrometrie is het belangrijk om een vlak monsteroppervlak te hebben om te zorgen voor een consistente brandpuntsdiameter van de invallende MALDI-laser op het monstersubstraat. Afwijkingen in de monsterhoogte kunnen ertoe leiden dat de MALDI-laserstraal onscherp wordt, waardoor veranderingen in de diameter en intensiteit van de bundel ontstaan, wat de MALDI-ionisatie-efficiëntie kan beïnvloeden. Deze veranderingen in ionisatie-efficiëntie kunnen resulteren in verschillen in analytintensiteit ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) onder toekenning GM138660. J.T.S. werd ondersteund door de Charles and Monica Burkett Family Summer Fellowship van de Universiteit van Florida. J.P.Z. werd ondersteund door NIH-subsidies K22AI7220 (NIAID) en R35GM138369 (NIGMS). A.B.S. werd ondersteund door de Cell and Molecular Biology Training Grant aan de Universiteit van Pennsylvania (T32GM07229).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0,2 μm Titan3 nylon spuitfiltersThermo Scientific42225-NN
1,5-diaminonaftaleen MALDI matrixSigma Aldrich2243-62-1
20 mL Henke Ject luer lock spuitHenke Sass Wolf4200.000V0 
275i series convectie vacuümmeterKurt J. Lesker companyKJL275807LL
7T solariX FTICR massaspectrometer uitgerust met een Smartbeam II Nd:YAG MALDI laser systeem (2 kHz, 355 nm) Bruker Daltonics
Azijnzuur oplossing, geschikt voor HPLCSigma Aldrich64-19-7
Acetonitril, geschikt voor HPLC, gradient graad, ≥99,9%Sigma Aldrich75-05-8
Ammoniumhydroxide oplossing, 28% NH3 in H2O, ≥99,99% trace metals basisSigma Aldrich1336-21-6
Autoklaveerbare biogevaren zakken: 55 galGrainger45TV10
Biogevaren specimen transport zakken (8 x 8 inch)Fisher Scientific01-800-07
Brain heart infusion bouillonBD Biosciences90003-040
C57BL/6 mannelijke muizen Jackson Laboratories
CanoScan 9000F Mark II foto en document scannerCanon
CM 3050S onderzoek cryomicrotoomLeica Biosystems
Exiccator kastSigma AldrichZ268135
Diamant tip schraper, Electron Microscopy Sciences Fisher Scientific50-254-51
Drierite exiccator pelletsDrierite21005
Ethanol, 200 ProofDecon Labs2701
flexImaging softwareBruker Daltonics
ftmsControl softwareBruker Daltonics
Glazen vacuüm valSigma AldrichZ549460
HTX M5 TM robot spuiterHTX Technologies
Indium Tin Oxide (ITO)-gecoate microscoopglazenDelta TechnologiesCG-81IN-S115
Inline HEPA filter naar vacuümpompLABCONCO7386500
Methanol, HPLC GraadFisher Chemical  67-56-1
MTP slide-adapter IIBruker Daltonics235380
Optimal cutting temperature (OCT) compoundFischer Scientific23-730-571
Peridox RTU Sporicide, Desinfectant en CleanerCONTECCR85335 
PTFE (Teflon) bedrukte glazen, Electron Microscopy SciencesVWR100488-874
Rotary vane vacuümpomp RV8EdwardsA65401903
Tissue-Tek Accu-Edge Wegwerp Hoog Profiel Microtome BladenElectron Microscopy Sciences63068-HP
Transparante vacuüm buisCole PalmerEW-06414-30
Ultragrade 19 vacuümpomp olieEdwardsH11025011
Variabele spanning transformatorPowerstat
Water, geschikt voor HPLCSigma Aldrich7732-18-5
Wide-mouth dewar flaconSigma AldrichZ120790

Referenties

  1. Biteen, J. S., et al. Tools for the microbiome: nano and beyond. ACS Nano. 10 (1), 6-37 (2016).
  2. Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
  3. Watrous, J. D., Alexandrov, T., Dorrestein, P. C. The evolving field of imaging mass spectrometry and its impact on future biological research. Journal of Mass Spectrometry. 46 (2), 209-222 (2011).
  4. Gessel, M. M., Norris, J. L., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: spatial molecular analysis to enable a new age of discovery. Journal of Proteomics. 107, 71-82 (2014).
  5. Fang, J., Dorrestein, P. C. Emerging mass spectrometry techniques for the direct analysis of microbial colonies. Current Opinion in Microbiology. 19, 120-129 (2014).
  6. Wheatcraft, D. R. A., Liu, X., Hummon, A. B. Sample preparation strategies for mass spectrometry imaging of 3D cell culture models. Journal of Visualized Experiments. (94), e52313(2014).
  7. Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Capturing small molecule communication between tissues and cells using imaging mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (146), e59490(2019).
  8. Li, H., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
  9. Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. Imaging mass spectrometry in microbiology. Nature Reviews Microbiology. 9 (9), 683-694 (2011).
  10. Dunham, S. J. B., Ellis, J. F., Li, B., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging of complex microbial communities. Accounts of Chemical Research. 50 (1), 96-104 (2017).
  11. Frydenlund Michelsen, C., et al. Evolution of metabolic divergence in Pseudomonas aeruginosa during long-term infection facilitates a proto-cooperative interspecies interaction. Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10 (6), 1323-1336 (2016).
  12. Si, T., et al. Characterization of Bacillus subtilis colony biofilms via mass spectrometry and fluorescence imaging. Journal of Proteome Research. 15 (6), 1955-1962 (2016).
  13. Wakeman, C. A., et al. The innate immune protein calprotectin promotes Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus interaction. Nature Communications. 7, 11951(2016).
  14. Phelan, V. V., Fang, J., Dorrestein, P. C. Mass spectrometry analysis of Pseudomonas aeruginosa treated with azithromycin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 873-877 (2015).
  15. Ferreyra, J. A., et al. Gut microbiota-produced succinate promotes C. difficile infection after antibiotic treatment or motility disturbance. Cell Host & Microbe. 16 (6), 770-777 (2014).
  16. Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).
  17. Schubert, A. M., et al. Microbiome data distinguish patients with Clostridium difficile infection and non-C. difficile-associated diarrhea from healthy controls. mBio. 5 (3), 01021-01014 (2014).
  18. Auchtung, J. M., et al. Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), 00387(2020).
  19. Zackular, J. P., et al. Dietary zinc alters the microbiota and decreases resistance to Clostridium difficile infection. Nature Medicine. 22 (11), 1330-1334 (2016).
  20. Tomkovich, S., Stough, J. M., Bishop, L., Schloss, P. D. The initial gut microbiota and response to antibiotic perturbation influence Clostridioides difficile clearance in mice. mSphere. 5 (5), 00869(2020).
  21. Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous matrix deposition on dried agar for MALDI imaging mass spectrometry of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
  22. Yang, J. Y., et al. Primer on agar-based microbial imaging mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
  23. Prentice, B. M., et al. Dynamic range expansion by gas-phase ion fractionation and enrichment for imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (19), 13092-13100 (2020).
  24. Bemis, K. D., et al. Cardinal: an R package for statistical analysis of mass spectrometry-based imaging experiments. Bioinformatics. 31 (14), 2418-2420 (2015).
  25. Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: An open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (5), 718-721 (2013).
  26. Bokhart, M. T., Nazari, M., Garrard, K. P., Muddiman, D. C. MSiReader v1.0: Evolving open-source mass spectrometry imaging software for targeted and untargeted analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (1), 8-16 (2018).
  27. Smith, A. B., et al. Enterococci enhance Clostridioides difficile Pathogenesis. Nature. , (2022).
  28. Korte, A. R., Lee, Y. J. MALDI-MS analysis and imaging of small molecule metabolites with 1,5-diaminonaphthalene (DAN). Journal of Mass Spectrometry. 49 (8), 737-741 (2014).
  29. Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (9), 1646-1652 (2007).
  30. Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: Enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Analytical Chemistry. 84 (4), 2048-2054 (2012).
  31. Huizing, L. R., et al. Development and evaluation of matrix application techniques for high throughput mass spectrometry imaging of tissues in the clinic. Clinical Mass Spectrometry. 12, 7-15 (2019).
  32. Anderton, C. R., Chu, R. K., Tolić, N., Creissen, A., Paša-Tolić, L. Utilizing a robotic sprayer for high lateral and mass resolution MALDI FT-ICR MSI of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 556-559 (2016).
  33. Gilmore, M. S., Clewell, D. B., Ike, Y., Shankar, N. Enterococci: From commensals to leading causes of drug resistant infection. Massachusetts Eye and Ear Infirmary. , Boston. (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

MALDI analyseagarkwekenweefselinfectiemodellenmetabole mappingaminozuurmetabolietencryosectie van weefselruimtelijk metabolisme
Onderzoek naar microbiële samenwerking via beeldvorming massaspectrometrie analyse van bacteriekolonies gekweekt op agar en in weefsel tijdens infectie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.