Het protocol kreeg ethische goedkeuring van het Animal Care Committee, het algemene onderzoeksinstituut van Toronto. Dieren kregen humane zorg in overeenstemming met de National Society of Medical Research and Guide for the care of laboratory animals, National Institute of Health (NIH), Ontario, Canada. Voor deze studie werden 15 weken oude niet-verwante Yorkshire mannelijke varkens gebruikt, met een gewicht van 40-50 kg.
OPMERKING: Het volledige protocol van het onderzoek is verdeeld in de volgende belangrijke stappen: (i) Orgaanherstel en voorbereiding van de back-table; (ii) Totale pancreatectomie van de ontvanger en (iii) Transplantaatimplantatie. De gehele operatie van donor en ontvanger wordt in 1 dag uitgevoerd.
1. Ophalen van donororganen en voorbereiding van de back-table
OPMERKING: De methode voor het ophalen van organen is beschreven in een afzonderlijk protocol6. Het protocol wordt hier echter in het kort beschreven, samen met enkele extra afhaalpunten die specifiek zijn voor de chirurgische techniek (chirurgische tips die relevant zijn voor donoroperaties).
- Kortom, verdoof het donorvarken en beveilig de luchtweg en de centraal veneuze katheter (hieronder beschreven in de sectie van de ontvangerpancreatectomie). Insnijd en belicht de ingewanden. Voer aortocavaldissectie en mobilisatie uit tot de bifurcatie in iliacale vaten.
- Darmbehandeling: De dunne darm van varkens is lang en kronkelig en de dikke darm is meestal opgezwollen. Zorg ervoor dat u de darmlussen na elke stap van de donoroperatie in hun anatomische positie plaatst om voldoende perfusie te garanderen en de mogelijkheid van mesenteriale torsie te voorkomen.
- Hilar dissectie: Ligate en verdeel de arteriële takken en galwegen om de poortader bloot te leggen. Ontleed het hilum (hepato-duodenale ligament) zo hoog / distaal mogelijk om het risico op verwonding van de kleine vasculaire kanalen te voorkomen die het superieure aspect van het pancreato-duodenale gebied doordrenken. Begin met het skeletiseren van de vaten in een volgorde van rechts naar links, totdat het voorste oppervlak van de poortader kaal ligt.
- Aorto-caval dissectie: Leg het supra-hepatische infra-diafragmatische deel van de aorta bloot door de diafragmatische crura te delen. Vermijd dissectie van de inferieure vena cava rond het pancreato-duodenale bos. Gebruik de nierslagaders aan beide zijden als de gemarkeerde bovengrens van dissectie.
- Leg de alvleesklier bloot door de kleinere zak te openen. Ligate en verdeel de nierslagaders. Kannuleer de infrarenale aorta en maak verbinding met de oplossing van de Universiteit van Wisconsin (UW) voor spoelen.
- Ligate de supra-hepatische aorta en klem. Spoel met 1,5 L-2 L UW-oplossing om te zorgen voor voldoende spoeling van de darm en alvleesklier (duidelijk te zien aan het visuele uiterlijk van bleekheid). Tijdens het in situ spoelen van het orgaan, verplaatst u de dunne darm en de dikke darm achter elkaar naar de middellijn en zorgt u ervoor dat er geen mesenteriale draaiing ontstaat. Deze stap zorgt voor een uniforme spoeling van de darm en alvleesklier met de UW (University of Wisconsin) -oplossing en is belangrijk om te onthouden.
- Snijd de poortader en infrahepatische vena cava gelijktijdig in na het starten van de spoeling om het veneuze effluent uit te laten. Bedek de buik met ijs om koude perfusie te garanderen. Ontleed het orgaan (pancreatoduodenale graft met delen van retroperitoneum, psoas, milt en bijnier) massaal.
- Koude dissectie: Start mobilisatie van het transplantaat van laterale naar mediale richting, van de staart van de pancreas tot de overgang tussen het hoofd en het corpus, door scherpe dissectie van de fascia tussen de pancreas en de dikke darm. Houd tijdens het uitvoeren van deze stap de alvleesklier vast bij zijn retroperitoneale bedekking met een tang en vraag de assistent om tegentractie te geven op de dikke darm naar de voet.
- Mesenteriale klemming: Na het delen van het dunne weefsel rond het corpus van de alvleesklier, duodenojejunale lus en dikke darm, vraag de assistent om rond de mesenteriale steel te lus en de dikke darmlus caudaal te trekken. Dit zorgt voor afbakening van het mesenterium en veilige plaatsing van de klem om de mesenteriale hoofdvaten in volgorde te verdelen zonder het pancreasparenchym te verwonden.
- Volledige extra-peritoneale dissectie van het transplantaat: Na het delen van de mesenteriale vaten, begint u met het ophalen van het transplantaat door dissectie van mediaal naar lateraal in tegenwijzerzin, waarbij de extrapancreasweefsels worden verdeeld, inclusief de pararenale fascia, bijnier, manchet van IVC, psoas-spier en diafragmatische crus. Zorg voor een adequaat vlak weg van de aorta om te voorkomen dat de superieure mesenteriale en coeliakieslagaders gewond raken.
- Voer de voorbereiding van de achterste tafel uit op ijs. Bewaar het orgaan in een ijskast (koude ischemietijd van 5 uur).
2. Pancreatectomie van de ontvanger
- Preoperatieve voorbereiding
- Vast het dier gedurende ten minste 6 uur vóór de voorgeschreven inductietijd. Dien een injectie met midazolam (0,15 mg/kg), atropine (0,04 mg/kg) en ketamine (25 mg/kg) subcutaan (SC) toe, 15 minuten voordat het dier naar de operatiekamer (OK) wordt vervoerd. Dien buprenorfine 0,3 mg injectie SC met aanhoudende afgifte toe 15 minuten voorafgaand aan het transport naar de OK.
- Positionering: Plaats het dier liggend op de operatietafel en gebruik de voorpoten om een stabiele positie tijdens de operatie te garanderen.
- Luchtweg en inductie: Ventileer het dier met behulp van een zak en masker met 3% -5% isofluraan en 2-3 L zuurstof per min, terwijl u de pulsoximetersonde aansluit en de hartslag en O2-verzadiging bewaakt.
- Na voldoende ontspanning, bevestigd door ontspanning van de kaken en stabiele zuurstofverzadiging en hartslag, vraag de assistent om de mond open te houden met voldoende tractie op de ontspannen boven- en onderkaak van het dier en visualiseer de stembanden met behulp van de laryngoscoop. Spray 2% lidocaïne om de stembanden te ontspannen om spasmen veroorzaakt door intubatie te voorkomen (de stembanden van varkens zijn zeer vasculair en fragiel!).
- Intubeer met een 7 mm endotracheale buis en blaas de manchet op met 3-5 ml lucht. Zorg voor de positie van de buis met behulp van de end-tidal CO 2 (ETCO2) sonde en sluit de buis aan op de ventilator, met 14-16 ademhalingen per minuut om een getijdenvolume van 10-15 ml / kg te bereiken. Verlaag de isofluraan tot 2,5% als onderhoudsdosis inhalatie-anesthesie.
- Intraveneuze lijn: Bereid de chirurgische plaats aseptisch voor met betadine en plaats een steriel gordijn. Identificeer vervolgens het oriëntatiepunt om de centrale veneuze katheter te plaatsen, die het middelpunt is van de driehoek gevormd tussen het mastoïde proces, het acromionproces en de kop van het sleutelbeen. Gebruik een naald van 16 G om de ader te doorboren; na het verzekeren van een vrije stroom van veneus bloed, zichtbaar door de kleur en het gebrek aan pulsatiliteit, introduceert u een geleidedraad met behulp van de Seldinger-techniek.
- Verwijd het kanaal met behulp van de meegeleverde dilatator. Vervang de geleidingsdraad en dilatator door een katheter van 8,5 x 10 Fr en zet deze vast door te hechten met een 0-0 zijden hechtnaald. Verbind de IV-lijn met de intraveneuze antibiotica die cefazoline (1 gm) en metronidazol (500 mg) bevatten, gevolgd door intraveneuze anesthesie door propofolinfusie met een snelheid van 10 ml / uur.
- Invasieve bloeddrukmonitoring: Na aseptisch voorbereiden van de chirurgische site met betadine, plaatst u een steriel gordijn en maakt u een incisie parallel aan de luchtpijp op 2 cm van de middellijn. Ontleed de vezels van de sternomastoïde spier en paratracheale fascia door stompe dissectie met behulp van Lahey's haakse tang en hemostatische tang.
- Identificeer de halsader lateraal aan de vezels van de riemspieren en ontleed langs de spiercompartimentering van de halsslagader mediaal met behulp van stompe dissectie zoals hierboven beschreven. Identificeer de slagader aan de hand van de pulsatie, textuur (koordachtig) en perivasculaire plexus. Mobiliseer het schip en slinger het met behulp van twee zijden 2-0 banden.
- Prik het vat door met een angio-katheter van 16 G met een afgeschuinde punt die naar boven wijst en trek de binnenste stijl terug zodra deze in het vat zit. Schuif de buitenste kathetermantel met behulp van de Seldinger-techniek en sluit de uitlaat aan op het arteriële bloeddrukmeetsysteem (BP). Voordat u de invasieve BP-monitor aansluit, kalibreert u de meting op nul om een nauwkeurige registratie te garanderen en de katheter op zijn plaats te houden met behulp van de zijden banden overdwars.
- Temperatuurbewaking en opwarming: Plaats de temperatuurregistratiesonde oraal. Bedek het dier met het Bair-hugger verwarmingsdekbed en zorg voor een temperatuur van 37-38 °C. Smeer de ogen in met een neutrale oogsmeergel. Verf en drapeer het chirurgische veld
- Chirurgische ingreep
OPMERKING: De huid wordt aseptisch voorbereid op alle chirurgische ingrepen met behulp van betadine scrubs gevolgd door de plaatsing van steriele gordijnen.- Incisie en blootstelling: Maak een middellijnincisie van het xiphisternum naar de symphysis pubis met behulp van de pure snijmodus van Bovie's elektrocauterie. Zorg ervoor dat u lateraal naar de urethra in het onderste deel van de incisie voorbij de fallus blijft om letsel te voorkomen. Plaats het zelfklevende buikwandoprolmechanisme en zorg ervoor dat de milt en lever niet worden verwond, om de blootstelling van het chirurgische veld te optimaliseren.
- Mobilisatie van de kop van de pancreas: Met de assistent die tegentractie biedt aan het pancreato-duodenale bos, begin met het ontleden langs het avasculaire fasciale vlak tussen het pancreasparenchym (duodenale kwab) en de infra-hepatische IVC.
- Pancreasringmobilisatie: De varkensalvleesklier vormt een ring rond de mesenterico-portaalas (verbindingslob). Ontleed langs de fascia op beide aspecten van de poortader (PV) om volledige mobilisatie van de verbindingskwab van de bovenliggende PV te garanderen. De veiligste manier is om de dissectie langs weerszijden van de poortader te starten en de weefsels met de klok mee of tegen de klok in te scheiden.
- Pancreasstaartmobilisatie: Identificeer vervolgens de overgang tussen de pancreas- en pararenale weefsels (gezien als een witte lijn) en begin met het ontleden van de staart van de onderliggende miltader die dicht bij het parenchym blijft. Ligate en verdeel de kleine veneuze zijrivieren naar het parenchym, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de miltader niet wordt verwond met behulp van zijden 3/0-banden.
- Pancreascorpusmobilisatie: Ontleed langs de dunne laag weefsel die het parenchym scheidt van de dikke darm en de maag, waarbij de dunne vasculaire arcade langs het infra-pylorische gebied behouden blijft.
- Pancreato-duodenale mobilisatie: Scheid vervolgens het parenchym van de C-lus van de twaalfvingerige darm door scherpe dissectie in het pancreato-duodenale bos door tractie-tegentractie, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de dunne vasculaire arcade langs de C-lus van de twaalfvingerige darm behouden blijft.
- Verdeling van het pancreaskanaal: Identificeer het pancreaskanaal, ligaat met zijde 2-0-banden en verdeel rond 3-5 mm stomp van het kanaal op de duodenale C-lus, wegblijvend van de vasculaire arcade van de twaalfvingerige darm (in nauwe relatie tot het kanaal).
- Verwijdering van het specimen: Voltooi het laatste deel van de mobilisatie door het parenchym te ontleden van de kruising tussen de verbindingskwab, twaalfvingerige darm en dikke darm aan weerszijden van de poortader. Extraheer het monster massaal (figuur 1) door de verbindingslob te verdelen over het voorste aspect van het PV. Verdeling van het parenchym is vereist om het monster eruit te halen vanwege de omtreklocatie rond het PV.
- Zorg voor hemostase langs de dissectiegebieden en inspecteer de twaalfvingerige darm op eventuele verwondingen en vasculaire congestie (figuur 2).
- Implantatie van het pancreato-duodenale transplantaat
- Voorbereiding van het transplantaat: Bereid het PV-transplantaat en het proximale aorta-uiteinde voor door de randen bij te snijden op anastomose. Plaats het bereide transplantaat in de orgaanzak met UW-oplossing op een ijsbad. Neem kernnaaldbiopten uit de pancreasstaart - bewaar in formaline, snap freeze en extraheer RNA in een later stadium. Hecht de biopsieplaats met Prolene 6-0 op een manier van 8.
- Aorto-caval dissectie: Begin met het identificeren van de juiste urineleider en ontleed langs de fascia die de urineleider scheidt van de retroperitoneale bedekking over de inferieure vena cava. Ontleed langs de laterale rand van de aorta om deze bloot te leggen aan de onderliggende psoasspier . Ontleed vervolgens langs het interaortocaval-bos om de aorta van de IVC te scheiden.
- Klemtest: Zorg voor voldoende mobilisatie van de aorta en IVC door een proef met de vasculaire klemplaatsing van Satinsky. Wissel van positie met de eerste assistent en bereid het chirurgische veld voor door de darmlussen aan de linkerkant in te trekken om de belangrijkste bloedvaten bloot te stellen voor anastomose. Plaats de proefklemmen op IVC en aorta om een adequate mobilisatie van beide vaten voor anastomose opnieuw te beoordelen.
- Veneuze anastomose: Na het plaatsen van de vasculaire zij-bijtklem in de IVC, maakt u een kleine opening in de voorste wand van het vat en verlengt u deze tot een voldoende grootte (afgestemd op het transplantaatvat) craniaal en caudaal met behulp van de schaar van Pott. Spoel het lumen met gehepariniseerde zoutoplossing met behulp van de flexibele mantel van een IV-canule.
- Maak met Prolene 6-0 dubbele naald hoeknaden op de IVC (binnenstebuiten) en transplantaatpoortader (binnenstebuiten). Zet de caudale hoekhechting vast en laat een van de naalden continu langs de achterwand van het transplantaat en de ontvangende ader lopen. Bevestig de voorste wand op een vergelijkbare (buiten-in continu) manier en zet de knoop in het midden van de voorste wand vast na het spoelen van het lumen van de anastomose met gehepariniseerde zoutoplossing.
- De ader ontklemmen: Plaats de vasculaire klem van een Bulldog op de poortader van het transplantaat, weg van de anastomose, en laat de zijwaartse bijtende klem langzaam los van de ontvangende IVC. Controleer op veneuze vulling en eventuele grote bloedingen van de anastomose.
- Arteriële anastomose: Plaats de zij-bijtende klem op de aorta en zorg ervoor dat de lumbale takken langs de posteromediale wand van het vat niet worden verwond. Instrueer de anesthesist om heparine (100 E/kg lichaamsgewicht) en methylprednisolon (500 mg) te injecteren via de centraal veneuze katheter.
- Maak een opening op de voorste wand van het vat en verleng deze craniaal en caudaal, zorg ervoor dat u niet langs de vaatwand ontleedt. Spoel het lumen met gehepariniseerde zoutoplossing en gebruik Prolene 6-0 dubbele naald, hecht het proximale uiteinde van de transplantaataorta op een continue manier aan de aortaopening van de ontvanger door de parachutetechniek. Spoel het lumen met gehepariniseerde zoutoplossing voordat u de laatste knoop op de voorste wand van het vat bindt.
- Reperfusie: Zorg voor de volgende twee aspecten tijdens het uitvoeren van deze stap. Ten eerste de hemodynamische veranderingen waarbij een drastische daling van de gemiddelde BP optreedt. Controleer de invasieve BP van minuut tot minuut en voer een dosistitratie uit van de vasopressor (noradrenaline-infusie) en vloeistofvoorspanning om de doelgemiddelde BP tussen 45-50 mmHg te houden.
- Ten tweede, handhaaf de hemostase. Na verwijdering van de bulldogklem uit de ader, beoordelen op eventuele grote bloedingen van het parenchym, para-aorta gebied en peri-portaal gebied; Laat vervolgens de aortaklem los en controleer op bloedingen van de arteriële anastomotische plaats. Beveilig de bloedingspunten met ligaturen en hemostatisch hechten. Vraag de anesthesist om een injectieflacon met tranexaminezuur door de centraal veneuze katheter te injecteren.
OPMERKING: Een belangrijke regel is om agressieve hantering van de alvleesklier tijdens deze fase van reperfusie te minimaliseren (om oedeem en hematoom van transplantaat te voorkomen).
- Darmanastomose: Nadat u geen mesenteriale torsie hebt veroorzaakt, isoleert u een lus van jejunum, op 40-50 cm afstand van de duodenojeunale overgang, en brengt u deze dicht bij het transplantaat. Anastomoseer de twaalfvingerige darm op het ontvangende jejunum op een zijwaartse continue manier met behulp van Polydioxanone 4-0-hechtdraad, waarbij wordt gezorgd voor een adequate luminale diameter van 1,5-2 cm.
- Hemostase en post-reperfusiebiopsie: Zorg voor hemostase rond het transplantaat en op de plaatsen van anastomose. Neem drie kernnaaldbiopten uit de pancreasstaart1 uur na reperfusie-opslag in formaline, snap freeze en extraheer RNA in een later stadium. Hecht de biopsieplaats met Prolene 6-0 in een cijfer van 8.
- Sluiting van de buikwand: Na het beoordelen op vastgehouden dweilen en het vastzetten van hemostase, hecht u de rectus abdominis op een continue manier met behulp van Polydioxanone 0-naald die zorgt voor de onderste middellijn om weg te blijven van de urethra. Sluit de huid met zijde 0-hechtdraad op een continue manier.
OPMERKING: Idealiter worden monofilament hechtingen (Nylon) aanbevolen; Omdat dit echter een 3-daags overlevingsmodel is, is zijde acceptabel in deze experimentele modellen.
- Omsnoeren van de centrale veneuze katheter: Maak een onderhuidse tunnel in de nek en zet de centrale veneuze katheter vast door deze onder de tunnel te begraven en de bovenliggende huid te hechten met een zijden 0-0 snijnaald.
- Verwijdering van de arteriële katheter: Na het verzekeren van een stabiele gemiddelde BP (40-50 mmHg) en een verbeterende trend van pH- en lactaatspiegels bij de bloedgasanalyse, verwijdert u de arteriële katheter en ligate het vat om hemostase in de nek te beveiligen. Sluit de bovenliggende huid met zijde 0-hechtdraad op een continue manier.
- Plaats het dier en extubatie: Draai onder alle noodzakelijke voorzorgsmaatregelen het dier sternal op een transportkar. Let op de O 2-verzadiging en omkering van de anesthesie (beweging van ledematen, spontane ademhalingsinspanningen, SpO 2 >95% korting op O2 en beademingsondersteuning) en extubeer het dier. Transporteer naar het hok en plaats het sternale dier en controleer de hemodynamische status totdat het stabiel is.

Figuur 1: Pancreatectomie exemplaar massaal gereseceerd. Let op de ring van pancreasweefsel rond de poortader in vivo. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Afbeelding van de twaalfvingerige darm. De C-lus van de twaalfvingerige darm met een bewaard gebleven vasculaire arcade (pijlpunt) vergeleken met de omringende jejunale lus en beoordeeld op congestie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.