C. elegans Gonad dissectie en freeze crack voor immunofluorescentie en DAPI-kleuring

Summary

Dit is een veelgebruikte methode voor C. elegans gonad-dissectie gevolgd door vriesscheur, die kiembaanmonsters produceert voor immunofluorescentie via antilichaamkleuring, of voor eenvoudige DAPI-kleuring om DNA te visualiseren. Dit protocol is succesvol geweest voor studenten in een onderzoekslaboratorium en in een op cursussen gebaseerde niet-gegradueerde onderzoekservaring.

Abstract

De C. elegans kiembaan is een uitstekend model voor het bestuderen van meiose, deels vanwege het gemak van het uitvoeren van cytologische analyses op ontleedde dieren. Hele bergpreparaten behouden de structuur van meiotische kernen, en belangrijk is dat elke geslachtsarm alle stadia van meiose bevat, georganiseerd in een temporeel-ruimtelijke progressie die het gemakkelijk maakt om kernen in verschillende stadia te identificeren. Volwassen hermafrodieten hebben twee geslachtsarmen, elk georganiseerd als een gesloten buis met prolifererende kiembaanstamcellen aan het distale gesloten uiteinde en gecelluliseerde eicellen aan het proximale open uiteinde, die samenkomen in het midden bij de baarmoeder. Dissectie bevrijdt een of beide geslachtsarmen uit de lichaamsholte, waardoor het geheel van meiose kan worden gevisualiseerd. Hier wordt een gemeenschappelijk protocol voor immunofluorescentie tegen een eiwit van belang gepresenteerd, gevolgd door DAPI-kleuring om alle chromosomen te markeren. Jongvolwassenen worden geïmmobiliseerd in levamisol en snel ontleed met behulp van twee spuitnaalden. Na kiembaanextrusie wordt het monster gefixeerd voordat het een vriesscheur in vloeibare stikstof ondergaat, wat helpt de cuticula en andere weefsels te doordringen. Het monster kan vervolgens worden gedehydrateerd in ethanol, gerehydrateerd en geïncubeerd met primaire en secundaire antilichamen. DAPI wordt toegevoegd aan het monster in het montagemedium, wat een betrouwbare visualisatie van DNA mogelijk maakt en het gemakkelijk maakt om dieren te vinden om onder een fluorescerende microscoop in beeld te brengen. Deze techniek wordt gemakkelijk overgenomen door degenen die bekend zijn met het hanteren van C. elegans na een paar uur besteed te hebben aan het oefenen van de dissectiemethode zelf. Dit protocol is onderwezen aan middelbare scholieren en studenten die in een onderzoekslaboratorium werken en opgenomen in een op cursussen gebaseerde niet-gegradueerde onderzoekservaring aan een liberal arts college.

Introduction

Meiose is de gespecialiseerde celdeling die wordt gebruikt om gameten (eieren en sperma /stuifmeel) te maken in alle seksueel reproducerende organismen ^1,2. Crossover recombinatie is de wederzijdse uitwisseling van DNA tussen homologe chromosomen; het is essentieel voor meiose, zowel een belangrijke bron van genetische diversiteit als het bevorderen van genoomstabiliteit door generaties heen. Chromosomen die tijdens meiose niet ten minste één cross-over vormen, zullen willekeurig scheiden, wat kan resulteren in chromosoom nondisjunctie, waardoor gameten ontstaan met het onjuiste aantal chromosomen - een aandoening die meestal fataal is voor het resulterende nageslacht³. Tijdens meiose worden crossovers geïnduceerd door geprogrammeerde dubbelstrengs DNA-breuken⁴. Een subset van deze breuken zal worden gerepareerd als cross-overs die fysieke koppelingen van DNA bieden, chiasmata genaamd, die homologe chromosomen helpen oriënteren ter voorbereiding op celdeling⁵. Meiotische stadia zijn sterk geconserveerd in alle eukaryoten en hun chromosomale conformatie maakt het mogelijk om ze gemakkelijk te identificeren.

Als een fundamenteel concept in de biologie is meiose een onderwerp dat studenten meerdere keren tegenkomen in verschillende biologiecursussen. Ze maken vaak kennis met de mechanica van meiotische chromosoomsegregatie op de middelbare school, terwijl cursussen op universitair niveau zich richten op de celbiologie van segregatie en de genetische impact van crossover-recombinatie. Meiose is echter een notoir lastig concept voor veel studenten¹. Een gebrek aan begrip van de relatie tussen genen, DNA, chromosomen en meiose kan misvattingen en hiaten in het begrip van studenten genereren die een volledig begrip van genetische overerving belemmeren ^6,7. Een manier om het begrip van abstracte onderwerpen door studenten te verbeteren, is door concrete, praktische activiteiten te bieden. Bij het onderwijzen van meiose kunnen instructeurs bijvoorbeeld kiezen uit activiteiten die moleculaire analyse⁸ nabootsen, 3D-modellen waarmee studenten moleculen⁹ kunnen manipuleren, of rollenspel waarbij studenten zelf de moleculaire choreografie uitvoeren¹. Het opnemen van onderzoek met onbekende resultaten is een bijzonder effectieve manier om het begrip van studenten te verbeteren. Deze praktijk staat bekend als een op cursussen gebaseerde niet-gegradueerde onderzoekservaring (CURE) en heeft het extra voordeel dat de houding en het agentschap van studenten worden versterkt, vooral voor degenen die behoren tot groepen die ondervertegenwoordigd blijven in STEM^10,11. De nematodenworm Caenorhabditis elegans is bijzonder ontvankelijk voor klasstudies van gedrag, vruchtbaarheid en genetische kruisingen en is een effectief model om studenten kennis te laten maken met biologisch onderzoek¹².

C. elegans maakt een krachtig modelorganisme voor celbiologie door moleculaire genetica te combineren met eenvoudige cytologische analyse. Het is ook bijzonder geschikt voor gebruik in een biologielokaal 13,14,15. Ze zijn gemakkelijk en economisch te onderhouden in een laboratorium en produceren elke 3 dagen honderden nakomelingen, zowel bij standaard kamertemperatuur als bij 20 °C, de meest voorkomende incubatietemperatuur. Belangrijk is dat ze kunnen worden ingevroren als glycerolvoorraden en in een vriezer van -80 ° C kunnen worden bewaard, wat betekent dat eventuele houderijfouten van beginnende onderzoekers gemakkelijk kunnen worden gecorrigeerd¹⁶. Bovendien maakt het goed geannoteerde genoom voorwaartse en omgekeerde genetische technieken^{mogelijk 17,18}, waardoor C. elegans kan worden gebruikt om biologische vragen aan te pakken, variërend van moleculair tot evolutionair. Ten slotte hebben C. elegans-onderzoekers een ondersteunende gemeenschap gecreëerd die vaak bereid is om hulp en advies te bieden aan beginnende wetenschappers¹⁹. Deze voordelen hebben ertoe geleid dat C. elegans is opgenomen in een aantal CURE's bij verschillende soorten instellingen 12,19,20,21,22,23.

Naast de voordelen voor onderzoek en onderwijs, is C. elegans een populair model geworden voor studies van meiose en kiembaanontwikkeling 24,25,26. De optische helderheid van deze dieren vereenvoudigt cytologische benaderingen²⁷, en bij volwassenen vertegenwoordigen geslachtsklieren bijna de helft van het dier, waardoor honderden meiotische cellen worden gebruikt om te bestuderen. In geslachtsklieren zijn meiotische kiembaankernen gerangschikt als een assemblagelijn (figuur 1); mitotische replicatie vindt plaats aan de distale punt van de gonade, waarbij kernen door meiotische stadia gaan terwijl ze migreren naar het proximale uiteinde van de gonade, waar bevruchte embryo's uit de vulva tevoorschijn komen. Omdat de stereotiepe ruimtelijke organisatie ook een temporele progressie door meiose vertegenwoordigt, kunnen verschillende stadia gemakkelijk worden geïdentificeerd op basis van hun chromosomale organisatie en locatie in de geslachtsklier. Ten slotte creëren processen die meiose verstoren en aneuploïdie veroorzaken fenotypen die eenvoudig te karakteriseren zijn, zelfs voor beginners: steriliteit, embryonale letaliteit of een hoge incidentie van mannen (Him fenotype)²⁸.

Dit is een eenvoudig protocol voor het visualiseren van meiotische chromosomen in C. elegans. Montage, dissectie, fixatie en antilichaamkleuring worden allemaal uitgevoerd op dezelfde microscoopglaas, wat het protocol vereenvoudigt en bijna perfect monsterherstel mogelijk maakt. Deze methode werkt voor eenvoudige DAPI-kleuring om chromosomen te visualiseren en kan worden gebruikt voor immunofluorescentie om de lokalisatie van eiwitten in de geslachtsklier te visualiseren. Studenten ontleden geslachtsklieren met behulp van basisontledenmicroscopen, genereren hele voorbereidingen voor visualisatie van DNA of immunofluorescentie en brengen ze in beeld op een samengestelde fluorescerende microscoop. Dit protocol is onderwezen aan middelbare scholieren en studenten die werken in een C. elegans onderzoekslaboratorium en opgenomen in een CURE op een liberal arts college¹². Hoewel de CURE een relatief kleine klassengrootte had, zou dit protocol geschikt zijn voor klassen bij een reeks instellingen vanwege de relatief lage kosten van wormstammen en reagentia. Instructeurs zouden alleen worden beperkt door het aantal ontleedmicroscopen dat beschikbaar is voor gebruik. De vorige implementatie had studenten die in groepen van drie werkten om een enkele microscoop te delen en vond plaats gedurende drie sessies van 90 minuten: de eerste om dissectie te oefenen, de tweede om dissectie en DAPI-kleuring te implementeren en de derde om dia's op een widefield fluorescentiemicroscoop te fotograferen. Deelname aan niet-gegradueerd onderzoek biedt veel voordelen voor studenten^{van 11,29}, zowel academisch als persoonlijk. Door onderzoek in te bedden in cursussen via CURE's kunnen studenten deelnemen aan onderzoek tijdens de normale lestijd 11,30,31, waardoor blootstelling aan deze voordelen toegankelijker en rechtvaardiger wordt.

Protocol

1. C. elegans veehouderij

OPMERKING: Zie C. elegans onderhoudsprotocol¹⁶ en Elgin et ^al.32 voor meer details. C. elegans-stammen kunnen gemakkelijk worden verkregen van het Caenorhabditis Genetics Center (https://cgc.umn.edu) en worden via gewone post naar elke locatie in de VS verzonden. Elke soort kost $ 10 en elk laboratorium / gebruiker betaalt een jaarlijkse vergoeding van $ 30.

1. Bereid met behulp van steriele techniek 6 cm nematoden groeimedium agar platen (NGM agar platen).
   OPMERKING: Gegoten platen kunnen ondersteboven worden bewaard in hun originele plastic hoezen of luchtdichte containers bij 4 °C gedurende enkele maanden.
   1. Om NGM-agarplaten te maken, voegt u 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-pepton, 20 g NGM-agar en ddH₂O toe aan 1 L (~ 975 ml). Autoclaaf de media met behulp van een vloeistofcyclus die gedurende 20 minuten op 121 °C blijft. Laat afkoelen tot 55 °C en voeg met behulp van steriele techniek 1 ml cholesterol, 0,5 ml 1 M CaCl₂, 1 ml 1 M MgSO₄ en 25 ml kaliumfosfaatbuffer (pH 6) toe.
      OPMERKING: Om 1 M kaliumfosfaatbuffer te maken, mengt u 108,3 g KH₂PO₄ (monobasisch) en 35,6 g K₂HPO₄ (dibasisch); stel indien nodig de pH in op 6 met KOH. Voeg ddH₂O toe tot 1 L (meestal ~ 900 ml) en autoclaaf gedurende 40 minuten bij 121 ° C. 1 L NGM maakt ongeveer 100 platen met elk 10 ml.
2. Gebruik een serologische of transferpipet om de platen te spotten met drie druppels E.coli OP50 bacterieculturen (~150 μL). Probeer in het midden van de plaat te spotten en plaats geen vlekken te dicht bij de plaatranden; dit zal de dieren ontmoedigen om langs de zijkanten van de platen omhoog te kruipen en uit te drogen.
3. Zodra het bacteriële gazon droogt, bewaar je de gevlekte platen ondersteboven bij kamertemperatuur (RT) gedurende maximaal 2 weken. Door platen minstens 1-2 dagen voor gebruik te spotten, kunnen de bacteriële gazons dikker worden en een hogere dichtheid van dieren ondersteunen.
   OPMERKING: Om OP50-bacterieculturen te bereiden, kan OP50 worden besteld bij het Caenorhabditis Genetics Center. OP50-bacteriën worden uit een glycerolvoorraad op een LB-plaat gestreept om enkele kolonies te garanderen en gedurende 4-6 weken bij 4 °C gehouden. OP50 bacterieculturen worden 's nachts gekweekt in LB bij 37 °C van een enkele kolonie – schudden is niet nodig. Voeg voor de bereiding van LB-media 10 g Tryptone, 10 g NaCl, 5 g gistextract, 950 ml ddH₂O toe, stel de pH in op 7 met 10 N NaOH en pas het uiteindelijke volume aan op 1 l met ddH₂O. Aliquot in hoeveelheden van 100 ml en autoclaaf gedurende 20 minuten bij 121 °C.
4. Om een werkvoorraad voor elke soort te maken, kies je drie L4-fase hermafrodieten op een gevlekte NGM-plaat. Bewaar de platen bij 15-25 °C. De standaard kweekconditie is 20 °C. Als toegang tot temperatuurgecontroleerde incubators niet beschikbaar is, onderhoud dan de culturen op de bench top bij RT.
   OPMERKING: L4-stadium hermafrodieten kunnen gemakkelijk worden geënsceneerd, zowel op grootte (kleiner dan volwassenen) als op de aanwezigheid van een duidelijke halve cirkel halverwege hun lichaam (de zich ontwikkelende vulva). Bij 20 °C bereiken dieren het L4-stadium 34-46 uur na het uitkomen (dat is ongeveer 40-52 uur nadat embryo's zijn gelegd). Zie Corsi et ^al.14 voor meer informatie over de timing van ontwikkelingsstadia.
   1. Verplaats de culturen naar verschillende temperaturen om de snelheid van ontwikkeling te regelen. Dieren groeien sneller bij hogere temperaturen en langzamer bij lagere temperaturen. Ze zullen steriel worden bij temperaturen hoger dan 25 °C.
      OPMERKING: Sommige gemuteerde genotypen zijn temperatuurgevoelig en vertonen verschillende fenotypen, afhankelijk van de kweektemperatuur.
5. Onderhoud de werkvoorraden door elke 4 dagen drie L4-traps hermafrodieten te kiezen tot een nieuwe gevlekte NGM-plaat. Dit zorgt voor een constante, goed gevoede populatie met een breed scala aan ontwikkelingsstadia.

2. Gonade dissectie

1. Het verzamelen van leeftijdsgematchte volwassenen: 12-24 uur voor de dissectie, kies L4-stadium hermafrodieten tot een nieuwe gevlekte NGM-plaat - deze groeien de volgende dag uit tot jonge volwassenen, wat ideaal is voor dissectie. Het aantal L4-stadium hermafrodieten zal afhangen van de cytologische analyse die wordt uitgevoerd; meestal worden 10-20 hermafrodieten per dia ontleed, waarbij twee tot vier dia's per toestand worden gegenereerd.
   OPMERKING: Geslachtsklieren worden het meest efficiënt geëxtrudeerd in goed gevoede dieren. Zorg ervoor dat u L4-hermafrodieten kiest uit werkende voorraden die niet uitgehongerd zijn (d.w.z. nog steeds een zichtbaar bacterieel gazon op de plaat hebben). Uitgehongerde dieren hebben de neiging om onvolledige gonade-extrusies te ondergaan, waardoor ze moeilijk te visualiseren zijn.
   1. Bij het beoordelen van latere stadia van meiose, zoals diakinese, ontleed oudere volwassenen (48 uur na L4) omdat ze meer diakinese-stadiumkernen accumuleren, waardoor de analyse wordt vereenvoudigd. Onderzoekers moeten echter rekening houden met de mogelijkheid dat sommige effecten kunnen worden veroorzaakt door gevorderde maternale leeftijd.
2. Bereid je voor op dissectie.
   1. Bereid M9: Voeg 3 g KH₂PO₄ (monobasisch), 6 g Na₂HPO₄ (dibasisch), 5 g NaCl toe en voeg ddH₂O toe aan 100 ml. Autoclaaf de oplossing gedurende 20 minuten bij 121 °C, laat afkoelen en voeg vervolgens 1 ml 1 M MgSO₄ toe met behulp van een steriele techniek.
   2. Bereid de ontleedbuffer voor: Meng 1 μL van 10% Tween 20, 12 μL van 100 mM levamisol, 10 μL van 10x M9 en 77 μL ddH₂O.
      OPMERKING: Tween 20 is opgenomen in de ontleedbuffer om de oppervlaktespanning te verminderen en weefselmembranen verder te permeabiliseren.
   3. Fixoplossing bereiden (2% PFA [100 μL]): Meng 12,5 μL 16% paraformaldehyde (PFA), 10 μL van 10x M9 en 77,5 μL ddH₂O; zorg ervoor dat u een verse ampul PFA gebruikt (niet langer dan 2 weken geopend).
      LET OP: PFA is een gevaarlijke chemische stof en de oplossing moet in de zuurkast worden bereid.
   4. Het instellen van de vriesmethode - vloeibare stikstof is gemakkelijker te beheren, maar indien nodig kan een aluminium blok bovenop droogijs worden gebruikt.
      1. Vloeibare stikstof methode: Plaats een plastic bekerglas of een plastic Coplin pot in een polystyreen doos. Vul het bekerglas met vloeibare stikstof (overloop in de polystyreencontainer is prima). Zet het pincet in de buurt. Idealiter zou het bekerglas smal genoeg moeten zijn om te voorkomen dat microscoopglaasjes volledig horizontaal vallen - dia's moeten op een kanteling liggen en gemakkelijk te pakken zijn met een pincet.
         OPMERKING: Het is belangrijk om plastic containers te gebruiken bij het werken met vloeibare stikstof in plaats van glas om verbrijzeling als gevolg van snelle koeling te voorkomen.
      2. Droogijs methode:
         1. Plaats een plat aluminium blok op droogijs in een polystyreen container of rechthoekige ijsemmer. Het is gemakkelijker om de dia's in te vriezen als de bovenkant van het blok boven de bovenkant van de container zit.
         2. Draag handschoenen, druk zachtjes op het aluminium blok om goed contact met droogijs te garanderen en het koelproces te versnellen (het kan een krijs afgeven als het metaal snel afkoelt). Zet een scheermesje in de buurt.
         3. Laat het aluminium blok minstens 30 minuten op droogijs staan voordat het vriespunt stopt om volledige afkoeling mogelijk te maken, wat nodig is voor een snelle bevriezing.
            OPMERKING: Idealiter moeten vaste blokken droogijs worden gebruikt, waardoor het oppervlak vlak blijft. Indien nodig kan aluminium blok op droogijskorrels worden geplaatst, maar er moet voor worden gezorgd dat het oppervlak vlak blijft.
         4. Het oppervlak van het aluminium blok verzamelt vorst, wat nauw contact tussen de dia's en het blok kan voorkomen. Gebruik het scheermesje om vorst van het oppervlak te schrapen en maak voor elke glijbaan een gebied vrij. Het bedekken van de polystyreencontainer met een deksel helpt overmatige vorstophoping te voorkomen.
   5. Vul een Coplin pot met ~40 ml 95% ethanol.
   6. Vul drie Coplin potten met ~40 ml PBS-T.
      OPMERKING: Om PBS-T te maken, mengt u 100 ml 10x PBS, 5 ml Triton X-100 en 2 ml 0,5 M EDTA (pH 8). Voeg 873 ml ddH2O toe. Schud krachtig om Triton X-100 op te lossen. Om 10x PBS te maken, meng 25,6 g Na₂HPO₄·7H₂O, 80 g NaCl, 2 g KCl en 2 g KH₂PO₄. Voeg ddH₂O toe om het volume op 1 L te brengen. Autoclaaf gedurende 40 min bij 121°C. Het wasmiddel Triton X-100 is opgenomen in de wasbuffer PBS-T om de oppervlaktespanning te verminderen en het vasthouden van hele dieren op de glijbaan te verbeteren.
3. Ontleed de dieren op een glazen afdekplaat van 18 mm x 18 mm. Deze stap is tijdgevoelig door de verdamping van de ontleedbuffer. Het duurt minder dan 5 minuten om de dissecties te voltooien.
   OPMERKING: Levamisol wordt gebruikt om dieren te immobiliseren om ze gemakkelijker te ontleden, maar als je ze te lang in levamisol laat zitten, zal dit resulteren in slechte gonade-extrusie. Het is het gemakkelijkst om het aantal dieren dat per dia wordt ontleed te verminderen om binnen het tijdsbestek van 5 minuten te passen.
   1. Plaats een houdplaat op het podium van een ontleedmicroscoop - de houdglaas wordt gebruikt om de coverslip gemakkelijker te verplaatsen en kan voor onbepaalde tijd worden hergebruikt (figuur 2A, linkerfoto).
   2. Plaats de coverslip bovenop de houdplaat en pipetteer 4 μL van de ontleedoplossing in het midden van de coverslip. Verplaats de houdschuif naar één kant van het werkgebied om de weergave vrij te maken.
   3. Kies 10-20 hermafrodieten in de druppel van de ontleedoplossing. Kies genoeg dieren om ~10 per dia af te beelden, maar niet zoveel dat ze niet binnen 5 minuten kunnen worden ontleed.
   4. Ontleed de dieren met behulp van twee spuitnaalden, één voor elke hand (figuur 2A).
      1. Kruis de punten van de naalden om een X-vorm te maken en gebruik de onderkant van de X om een volwassene vast te pinnen op het oppervlak van de coverslip.
         OPMERKING: Het kan oefening vergen om de beste manier te ontdekken om elke naald vast te houden in termen van hoek en rotatie. Begin met het vasthouden van de naalden met hun schuine kanten (schuine rand) naar beneden gericht. Zie de discussie voor suggesties over het eerst leren ontleden in een groter volume (figuur 2D).
      2. Plaats de X-vorm direct achter de keelholte, ongeveer 1/5 van de lichaamslengte van een jongvolwassene, of net onder het heldere deel van het hoofd (figuur 2A, rechterdiagram).
      3. Onthoofd het dier met één schaarbeweging (zoals het snijden van voedsel met een mes en vork). Een goede extrusie zal ertoe leiden dat één arm van de geslachtsklier (of soms beide armen) volledig uit de lichaamsholte loslaat, samen met een of beide darmhelften (figuur 2B, linker afbeelding). De darm zal donkerder en van uniforme breedte lijken, terwijl de geslachtsklier helder zal lijken met een distale taps toelopende punt.
         1. Elk dier mag slechts één keer worden gesneden; als de geslachtsklier niet extrudeert na het maken van de snede, ga dan gewoon naar het volgende dier. De eerste snede vermindert de hydrostatische druk in het lichaam aanzienlijk, waardoor verdere sneden waarschijnlijk niet zullen resulteren in een betere extrusie. Onvolledige of slechte extrusies zijn gemakkelijk zichtbaar tijdens het beeld en kunnen worden genegeerd (figuur 2B, rechter afbeelding).
            OPMERKING: Probeer de geslachtsklier niet van het karkas te scheiden - dit zal meestal het weefsel scheuren en het aantal meiotische stadia beperken dat kan worden geanalyseerd.
      4. Herhaal de dissectie voor de resterende dieren op de afdekplaat.
4. Bevestig het monster met formaldehyde.
   1. Werk voorzichtig en pipetteer 4 μL van de fix-oplossing op de deklip zeer dicht bij de druppel met dieren. Idealiter zijn de druppels dicht genoeg om samen te voegen; vermijd het direct pipetteren in de dissectiedruppel en het verplaatsen van de ontlede karkassen.
   2. Pin de coverslip met één vinger vast aan de houdplaat. Veeg met de andere hand voorzichtig een paar keer over de coverslip om de druppels te mengen. De uiteindelijke fix concentratie is 0,8% PFA.
   3. Houd een positief geladen glijbaan aan de voorkant naar beneden en gebruik deze om de coverslip in het midden van de dia op te pakken. Raak de monsterdruppel voorzichtig aan en de oppervlaktespanning van de druppel zal de coverslip oppikken.
      OPMERKING: Positief geladen dia's hebben een elektrostatische coating die weefsels helpt zich aan het oppervlak te hechten om monsterverlies te voorkomen.
      1. Plaats desgewenst de afdekplaat diagonaal, zodat één hoek 1 mm aan de boven- of onderrand van de glijbaan hangt. Het achterlaten van een overhang maakt het gemakkelijker om de coverslip af te kraken na bevriezing (figuur 2C).
   4. Zet de schuif op de bank en bevestig precies 5 minuten op RT. Gedurende deze tijd labelt u de dia met een potlood.
      OPMERKING: Het is gebruikelijk om de monsters te overfixeren, wat kan worden gedetecteerd door een uitsluiting van antilichamen uit kernen of zelfs alle weefsels. Bovendien zijn sommige antilichamen bijzonder gevoelig voor formaldehyde. Verminder in deze gevallen de fixatietijd of verlaag de uiteindelijke concentratie van het gebruikte formaldehyde.
5. Vries-crack
   1. Bevries onmiddellijk na de fix de dia's.
      1. Bij gebruik van vloeibare stikstof: Houd de gelabelde rand van de dia met een pincet vast en laat deze voorzichtig zakken tot vloeibare stikstof. Laat de schuif zo los dat deze tegen de zijkant van het bekerglas leunt, met de zijkant naar boven. Dia's worden binnen 10 s ingevroren (zodra de vloeistof stopt met koken).
      2. Bij gebruik van droogijs: schraap de vorst van het oppervlak van het aluminium blok met een scheermes. Houd de gelabelde rand van de glijbaan stevig vast en plaats deze op het vrijgemaakte oppervlak, waarbij u enige druk naar beneden uitoefent om volledig contact met het blok te garanderen. De coverslip moet volledig op het blokoppervlak liggen. Bevriezing vindt plaats binnen 10 s en kan visueel worden bevestigd als het monster onder de deklip in ijs verandert.
      3. Voor beide methoden laat u de dia's ten minste 5 minuten volledig bevriezen.
         OPMERKING: Eenmaal bevroren, kunnen de dia's gedurende 15-20 minuten in vloeibare stikstof of op het blok worden achtergelaten, zolang ze bevroren blijven. Hierdoor kunnen in dit stadium meerdere dia's worden verzameld voordat u doorgaat met de kraakstap.
   2. Werk snel en kraak de coverslip van het monster. Deze stap is tijdgevoelig. Verwijder de coverslip en dompel de dia onder in ethanol voordat het monster begint te ontdooien.
      1. Verwijder de bevroren dia (met een pincet voor vloeibare stikstof).
      2. Pak de gelabelde korte rand van de glijbaan stevig vast en zet een lange rand tegen de bank.
      3. Pak met de andere hand een scheermes stevig vast en schuif de rand van het scheermes langs de glijbaan om de deklip van en weg van het monster te vegen. Deze stap is iets gemakkelijker als de coverslip is geplaatst met een hoekoverhang (figuur 2C).
6. Plaats de dia onmiddellijk in een Coplin-pot met 95% ethanol bij RT. Laat de dia's minstens 5 minuten in ethanol staan.
   OPMERKING: Dia's kunnen een tijdje in ethanol worden achtergelaten - hierdoor kunnen meerdere dia's bij deze stap worden verzameld voordat ze doorgaan met wassen. Dia's kunnen bij deze stap ook meerdere dagen worden bewaard. Verplaats bij opslag de Coplin-pot met dia's in ethanol naar -20 °C.
7. Was de dia's in PBS-T drie keer gedurende 5 minuten elk op RT. Gebruik verse PBS-T voor elke wasbeurt.
8. Als kleuring met antilichamen, ga dan verder met stap 3 (antilichaamkleuring). Als alleen kleuring met DAPI om chromosomen te visualiseren, ga dan verder met stap 4 (montage en beeldvorming).

3. Antilichaamkleuring

1. Primaire antilichaam incubatie
   OPMERKING: Bij het uitwerken van geschikte omstandigheden voor nieuwe antilichamen is het belangrijk om de volgende negatieve controles op te nemen om de specificiteit van het fluorescerende signaal te verifiëren: 1) Een dia die geen primair antilichaam heeft en alleen een secundair antilichaam heeft; 2) een dia met alleen een primair antilichaam dat geen secundair antilichaam heeft. Elk van deze negatieve controles zou een volledig gebrek aan signaal moeten produceren. Als fluorescentie wordt geïdentificeerd op de secundaire antilichaam-only dia, moet de secundaire antilichaamverdunning worden verhoogd of moet een andere secundaire worden gebruikt. Als fluorescentie wordt geïdentificeerd op de primaire antilichaam-only dia, is dit waarschijnlijk te wijten aan autofluorescentie of andere potentiële verontreinigingen.
   1. Verdun het primaire antilichaam in antilichaamverdunningsbuffer (50 mg BSA + 50 μL 10% natriumazide + 10 ml PBS-T ) - bereid voldoende antilichaamverdunning voor om 20-30 μL per dia te gebruiken.
   2. Bereid een vochtige kamer voor: Bekleed de bodem van een plastic container met een luchtdicht deksel met vochtige papieren handdoeken. Leg een enkele laag glazen Pasteur pipetten op de papieren handdoeken. Deze pipetten creëren een oppervlak waardoor de dia's waterpas kunnen blijven en ze van de papieren handdoeken omhoog blijven.
      OPMERKING: Voor vochtige kamers is het het beste om plastic voedselopslagcontainers met klikdeksels te gebruiken, waardoor het gemakkelijker wordt om de container te openen en te sluiten zonder de dia's binnenin te verstoren. Zoek er een die lang genoeg is voor de Pasteur pipetten, maar ook een relatief vlakke bodem heeft zonder inkepingen om de dia's volledig horizontaal te laten rusten.
   3. Verwijder de schuif uit de uiteindelijke PBS-T was. Werk snel vanaf deze stap voorwaarts om het monster te allen tijde nat te houden en verdamping te voorkomen. Als het monster uitdroogt, zal de kleuring van antilichamen negatief worden beïnvloed.
   4. Droog het hele oppervlak van de dia met behulp van een veegweefsel gevouwen in een compacte rechthoek. Veeg de voor- en achterkant van de glijbaan schoon, maar laat voldoende ruimte rond het monster. Wees extra voorzichtig bij het drogen van het oppervlak in de buurt van het monster - vermijd te dicht bij het monster te komen, waardoor een gebied ter grootte van de deklip onaangetast blijft. Zorg er echter voor dat de omtrek van het monster droog is voor de volgende stap.
   5. Teken een cirkel rond het monster met een hydrofobe PAP-pen. Wees voorzichtig om het hele monstergebied te omsluiten, maar vermijd het verstoren van kadavers van dieren die zichtbaar zijn op het oppervlak van de dia. Wacht op ~5 s om de barrière volledig te laten drogen.
      OPMERKING: Een hydrofobe barrière is nodig om de primaire antilichaamoplossing te bevatten, omdat het oppervlak van de dia is gecoat met PBS-T, dat een reinigingsmiddel bevat. De PAP-pen werkt het beste op een droog glijoppervlak, dus het is belangrijk om een droge omtrek rond het monster te creëren. Door het gebied dat zich het dichtst bij het monster bevindt ongemoeid te laten, wordt het monster tijdens deze stap beschermd
   6. Werk snel en gebruik de hoek of rand van het gevouwen veegweefsel om vloeistof weg te voeren van het monster binnen de hydrofobe barrière. Zorg ervoor dat u de karkassen van dieren niet verstoort.
   7. Pipetteer onmiddellijk 20 μL van de primaire antilichaamoplossing in de ring die door de hydrofobe barrière wordt gecreëerd. Zorg ervoor dat u voorzichtig en onder een hoek pipetteert om te voorkomen dat karkassen worden verstoord. Vermijd pipetteren direct op een karkas.
   8. Kantel de glijbaan voorzichtig om ervoor te zorgen dat het hele oppervlak binnen de hydrofobe barrière wordt bedekt door de oplossing.
      OPMERKING: Het is het beste als de hydrofobe barrières een binnenomtrek van 1-1,5 cm hebben, die volledig wordt bedekt door 20 μL van de antilichaamoplossing. De omtrekbreedte is afhankelijk van hoe de karkassen worden verdeeld tijdens de vries-kraakstap. Bredere barrières kunnen een groter volume antilichaamoplossing vereisen. Indien gewenst kunnen kleine vierkantjes parafilm (gesneden tot de grootte van de 18 mm x 18 mm afdekplaat) voorzichtig bovenop het monster worden geplaatst. De parafilmvierkanten zorgen ervoor dat de antilichaamoplossing het hele monster bedekt en helpen ook verdamping te voorkomen.
   9. Herhaal stap 3.1.3-3.1.8 voor de rest van de dia's.
   10. Breng de dia's voorzichtig over naar de vochtige kamer en zorg ervoor dat de oplossing zich in de hydrofobe barrière blijft bevinden en dat de dia's volledig waterpas rusten.
   11. Incubeer de dia's 's nachts bij RT. Afhankelijk van het antilichaam kan deze stap worden verkort tot 6 uur of 's nachts bij 4 °C worden uitgevoerd door de vochtige kamer in een koude kamer of een koelkast te houden.
       OPMERKING: Het gebruik van een vochtige kamer en hydrofobe barrières is meestal voldoende om verdamping van de antilichaamoplossing te voorkomen, zelfs voor lange nachtelijke incubaties. Als verdamping echter een probleem blijkt te zijn, kunnen kleine vierkantjes parafilm voorzichtig op elk monster worden geplaatst, wat verdamping helpt voorkomen. Deze kunnen in de eerste wasstap worden verwijderd: dompel elke dia onder in een Coplin-pot gevuld met PBS-T (die geen andere dia's bevat) en laat de parafilm wegdrijven van het monster. Verwijder de parafilm uit de Coplin-pot voordat u dezelfde pot gebruikt om de parafilm van de volgende dia te verwijderen.
2. Was de dia's in Coplin potten met ~40 ml PBS-T drie keer gedurende 5 minuten elk op RT. Gebruik verse PBS-T voor elke wasbeurt.
   1. Verdun tijdens deze wasbeurten het secundaire antilichaam in antilichaamverdunningsbuffer. Bereid voldoende antilichaamverdunning voor om 20-30 μL per dia te gebruiken. Het is gebruikelijk om Alexa Fluor geconjugeerde secundaire antilichamen te gebruiken die op 1:200 zijn verdund.
3. Secundaire antilichaam incubatie
   1. Verwijder de schuif uit de uiteindelijke PBS-T was. Werk snel vanaf deze stap voorwaarts om het monster te allen tijde nat te houden en verdamping te voorkomen.
   2. Droog de glijbaan met een gevouwen veegdoekje. Vermijd het drogen van het gebied dat zich door de hydrofobe barrière bevindt.
   3. Werk snel en gebruik de hoek of rand van het gevouwen veegweefsel om vloeistof weg te voeren van het monster binnen de hydrofobe barrière. Zorg ervoor dat u de kadavers van het dier niet verstoort.
   4. Pipetteer onmiddellijk 20 μL van de secundaire antilichaamoplossing in de ring die door de hydrofobe barrière wordt gecreëerd. Zorg ervoor dat u voorzichtig en onder een hoek pipetteert om te voorkomen dat de karkassen worden verstoord.
   5. Vermijd pipetteren direct op een karkas. Zorg ervoor dat het hele oppervlak binnen de hydrofobe barrière wordt bedekt door de oplossing. Bredere barrièreomtrek kan een groter volume antilichaamoplossing vereisen. Bedek het monster desgewenst met een klein vierkantje parafilm (zie de opmerking onder stap 3.1.8).
   6. Breng de glijbaan voorzichtig over naar de vochtige kamer en zorg ervoor dat de oplossing zich in de hydrofobe barrière blijft bevinden en dat de glijbaan volledig waterpas rust. Plaats het deksel op de vochtige kamer om de glijbaan in het donker te houden.
   7. Herhaal stap 3.3.1-3.3.6 voor de rest van de dia's.
   8. Incubeer in het donker gedurende 4 uur bij RT.
      OPMERKING: Afhankelijk van het antilichaam kan deze stap worden verkort tot 2 uur of worden verlengd tot 6 uur. Als de vochtige kamer niet donker is, plaats deze dan in een lade of bedek deze met een kartonnen doos. Als alternatief kan de vochtige kamer worden gewikkeld in aluminiumfolie om de dia's in het donker te houden.
4. Was de dia's in Coplin potten met ~40 ml PBS-T drie keer gedurende 5 minuten elk op RT. Gebruik verse PBS-T voor elke wasbeurt.

4. Montage en beeldvorming

1. Bereid u voor op het monteren van het monster door montagemedium + DAPI (2 μg /ml), 18 mm x 18 mm glazen afdekplaten en nagellak binnen handbereik te hebben.
2. Verwijder de glijbaan uit de laatste was en droog af met een gevouwen veegdoekje. Vermijd het drogen van het gebied dat zich door de hydrofobe barrière bevindt.
3. Gebruik de hoek van het gevouwen veegweefsel en zuig voorzichtig vloeistof van het monster binnen de barrière af. Verwijder de meeste vloeistof bij deze stap, maar zonder de karkassen volledig uit te laten drogen.
4. Werk snel en voeg 8 μL van het montagemedium toe aan het monster. Pipetteer voorzichtig en onder een hoek om te voorkomen dat de karkassen worden verstoord. Vermijd pipetteer direct op de karkassen.
5. Nog steeds snel werkend, laat voorzichtig een glazen deklip op het monster zakken.
   1. Luchtbellen kunnen de beeldvorming verstoren en leiden tot degradatie van monsters. Om luchtbellen te minimaliseren, plaatst u een rand van de coverslip op de schuif naast het monster, zodat deze diagonaal over het monster wordt gehouden. Het kan helpen om de hogere rand van de coverslip op een potlood of pincet te laten rusten. Laat vervolgens langzaam de hogere rand van de coverslip naar beneden zakken - deze beweging zorgt ervoor dat het montagemedium een vloeibare afdichting kan creëren die van de ene rand naar de tegenovergestelde rand gaat.
6. Herhaal stap 4.2-4.5 voor de rest van de dia's.
7. Sluit de coverslips af met nagellak. Zorg ervoor dat u niet op de coverslip drukt (waardoor het monster wordt verpletterd) of dat u de coverslip horizontaal ontwricht (waardoor het monster wordt uitgesmeerd).
   1. Voeg een klein puntje nagellak toe aan elke hoek van een coverslip (~1 mm breed). Deze helpen de coverslip op zijn plaats te houden. Laat de stippen volledig drogen.
   2. Wanneer de hoeken helemaal droog zijn, sluit je de randen af met nagellak. Zorg ervoor dat de polish de opening tussen de coverslip en de schuif volledig opvult, maar vermijd het bedekken van de coverslip het monster te veel. Het is het beste om een overlap van 1 mm op de coverslip te behouden. Gebruik alleen zoveel nagellak als nodig is. Vermijd het gebruik van te veel of overtollige polijstmiddelen, die lang kan duren om te drogen en het risico loopt het microscoopdoel te beschadigen.
      OPMERKING: Het heeft de voorkeur om gekleurde nagellak te gebruiken in plaats van helder, waardoor het gemakkelijker is om de grens van de zeehond te zien en helpt voorkomen dat dieren die onder de nagellakgrens liggen, in beeld worden gebracht.
   3. Laat de nagellak volledig drogen voordat u gaat filmen. Deze stap is belangrijk, omdat natte nagellak de microscoopdoelstellingen ernstig kan beschadigen.
      OPMERKING: Dia's moeten vanaf hier zoveel mogelijk in het donker worden bewaard. Gebruik een platte kartonnen doos om ze te bedekken terwijl ze op de bank drogen.
8. Bewaar de dia's in het donker bij 4 °C gedurende 1-2 weken voordat u ze in beeld brengt. Bewaar de dia's indien nodig bij -20 °C voor een langere duur.
9. Afbeelding met behulp van standaard fluorescentie samengestelde lichtmicroscopie.
   1. Bekijk voor elke dia eerst het volledige monster op 10x in het DAPI-kanaal om goed geëxtrudeerde geslachtsklieren te identificeren en hun plaatsing te noteren. Vermijd voor de meeste toepassingen het in beeld brengen van geslachtsklieren die zijn afgehakt, onvolledig of gedeeltelijk bedekt door een ander deel van het dier. Voor de meeste dieren zal slechts één geslachtsklierarm volledig geëxtrudeerd en zichtbaar zijn.
      OPMERKING: Het kan nuttig zijn om een afbeelding met een lagere vergroting te maken op 10x van de gehele geslachtsklier in het DAPI-kanaal om te gebruiken voor latere oriëntatie of om de locatie van specifieke kernen te identificeren.
   2. Afhankelijk van de toepassing kunnen foto's worden gemaakt met 40x, 63x of 100x. Als de hele geslachtsklier moet worden vastgelegd, maakt u een montage met overlappende grenzen. Onthoud tijdens het beeldhouwen dat de gonade een holle buis is, met kernen die het dichtst zijn aan de boven- en onderkant.

Results

DAPI bindt sterk aan DNA en de kleuring ervan is robuust, zelfs onder een breed scala aan omstandigheden (figuur 3A, B). Het moet aanwezig zijn in alle kernen en maakt daarom een effectieve positieve controle voor de aanwezigheid van wormweefsel op de dia en het vermogen om fluorescentie op de microscoop te detecteren. Kleuring is effectief wanneer het antilichaam aanwezig is in meiotische kernen (figuur 3A,B). Figuur 3A,B toont bijvoorbeeld mid-pachyteneenkernen gekleurd met DAPI en een antilichaam gericht op RAD-51, een marker voor dubbelstrengsbreuken. KLE-2 is een component van condensine, een sterk geconserveerd eiwitcomplex dat chromosomen structureert ter voorbereiding op mitose en meiose. kle-2/+ mutanten hebben kleine defecten in de chromosoomstructuur, zoals blijkt uit licht ongeordende DAPI-kleuring en een toename van het dubbelstrengs breukgetal dat tot uiting komt in het hogere aantal RAD-51-foci (figuur 3B). Een veelgemaakte fout voor immunofluorescentie is dat het monster te lang in de fix-oplossing blijft. Overfixatie kan leiden tot mislukte kleuring omdat het meestal voorkomt dat antilichamen zich in kernen verspreiden. Deze fout kan worden geïdentificeerd wanneer het antilichaam diffuus is in de cytoplasmatische gebieden van de gonade, maar lijkt te zijn uitgesloten van kernen.

In de kiembaan (figuur 1) vermenigvuldigen kernen zich mitotisch aan de distale punt, komen meiose binnen tijdens de overgangszone en vorderen door pachyteen (dat vaak in drie gelijke stadia wordt verdeeld door een aantal kernenrijen) voordat ze diploteen en uiteindelijk diakinese binnengaan. Eicellen in diakinese worden genummerd op basis van hun nabijheid tot de spermatheca, waarbij de -1 eicel het meest proximaal is van de spermatheca, de -2 eicel de volgende distale, enzovoort. C. elegans hebben zes chromosomen, die zich manifesteren als compacte ovalen in diakinesekernen. Elk van deze vertegenwoordigt een homoloog paar van twee zusterchromatiden bij elkaar gehouden door een chiasma, ook wel een bivalent genoemd (figuur 3C). Mutanten, zoals spo-11, die crossover-formatie verstoren, zullen er niet in slagen chiasmata te vormen; daarom zullen diakinesekernen 12 afzonderlijke DAPI-lichamen hebben (ook univalenten genoemd), één voor elke zusterchromatide (figuur 3D).

Figuur 1: Kiembaankernen zijn gerangschikt op een ruimtelijk-temporele manier die hun progressie door meiose vertegenwoordigt. (A) Whole-mount jongvolwassen hermafrodiet gekleurd met DAPI. Gonaden en meiotische stadia worden geschetst, van de distale punt (asterisk) tot het proximale gebied (de -1 eicel, aangegeven met een pijl), die de spermatheca (driehoek) bevat. Schaalbalk vertegenwoordigt 100 μm. (B) Geprojecteerd fluorescentiebeeld van een ontleedde hermafrodiet gonade gekleurd met DAPI. Meiotische stadia worden aangeduid, met representatieve kernen weergegeven in inzetstukken (alle inzetstukken worden getoond om met elkaar te schalen). Kernen kunnen gemakkelijk worden geënsceneerd op basis van hun locatie in de kiembaan en karakteristieke chromosoommorfologie, die zich ontwikkelt van de mitotische zone aan de distale punt (asterisk) naar de overgangszone, via pachyteen, diploteen en diakinese. De spermatheca wordt gemarkeerd door een driehoek. Dit cijfer is aangepast van Hillers et al. onder licentie CC BY 3.0²⁸. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Demonstratie van de dissectie-instelling. (A) Microscoopfase tijdens de dissectie. Dieren worden ontleed in 4 μL dissectieoplossing op een afdekplaat op de houderplaat, die wordt gebruikt om de coverslip in het zicht te brengen. Het diagram toont de ideale plaatsing van de naald. Naalden worden vastgehouden met een afgeschuinde rand naar beneden gericht, gekruist over het faryngeale gebied. Roze pijlen tonen een schaarachtige beweging voor naalden. De roze stippellijn geeft de ideale snijlocatie aan. (B) Afbeeldingen van ontleedde dieren, met een voorbeeld van een volledige extrusie en een onvolledige extrusie. Secties van geëxtrudeerde geslachtsklieren en ingewanden zijn gelabeld. (C) Afbeelding die de freeze-crack stap demonstreert. De glijbaan moet stevig in één hand worden gehouden, met de zijkant van de coverlip weg van het lichaam. De tegenoverliggende rand is tegen de bank gezet. Het scheermes moet in de andere hand worden gehouden. De roze pijl geeft de bewegingsrichting aan voor het scheermes om de coverslip van de dia te vegen, met een lichte draai zodat de coverslip weg van het lichaam veegt. Merk op dat de coverslip zo is geplaatst dat een hoek over de lange rand van de glijbaan hangt. (D) Afbeelding van de opstelling voor dissectiepraktijk in een glasembryo-kleuringsschaal. Dieren worden in 50-200 μL dissectieoplossing geplaatst, wat het probleem van verdamping tenietdoet en de tijd voor dissectie verlengt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Representatieve fluorescentieresultaten van kiembaankernen. (A,B) Z-stack projecties van late pachyteenkernen gekleurd met RAD-51 antilichaam (groen) en DAPI (rood) in (A) wild-type en (B) kle-2/+ heterozygoten. (C,D) Z-stack projecties van een enkele diakinesekern gekleurd met DAPI in (C) wild-type (met zes DAPI-kleuringslichamen) en (D) spo-11 mutanten (met 12 DAPI-kleuringslichamen). Schaalbalken vertegenwoordigen 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Seksuele voortplanting vereist de creatie van haploïde gameten, die worden geproduceerd via de gespecialiseerde celdeling van meiose. C. elegans is een populair model geworden voor de cytologische studie van meiose vanwege de optische transparantie, handige kiembaananatomie en krachtige genetica²⁸. Eenvoudige organismale experimenten die vruchtbaarheid en embryonale letaliteit beoordelen, kunnen worden gecombineerd met moleculaire genetica om veel vragen in het laboratorium of het klaslokaal te beantwoorden. Omdat cross-overs bijvoorbeeld essentieel zijn voor een goede chromosoomsegregatie, zullen processen die hun vorming of resolutie verstoren, aneuploïde gameten genereren. Aneuploïdie leidt op zijn beurt tot levensvatbaar nageslacht, dat gemakkelijk kan worden beoordeeld door nakomelingen te tellen, of door de iets gecompliceerdere methode om embryonale letaliteit te bepalen. Cytologisch gezien zal een gebrek aan cross-overs van invloed zijn op het aantal DAPI-kleuringslichamen dat tijdens diakinese wordt waargenomen. De robuustheid van DAPI-kleuring en het gemak van scoren maakt dit een ideaal experiment om cytologische technieken aan te leren. De temporele-ruimtelijke lay-out van kernen in de hermafrodietkiemlijn biedt een momentopname van elk stadium van meiose op een enkel moment in de tijd. Kernen hebben ongeveer 54 uur nodig om van het distale mitotische uiteinde van de kiembaan naar het proximale uiteinde te gaan (zie bijvoorbeeld Jaramillo-Lambert et ^al.33, Stamper et ^al.34 en Libuda et ^al.35). Deze gevestigde timing van meiotische vooruitgang maakt pulse-chase labeling of DNA-beschadigende experimenten mogelijk.

Omdat DAPI-kleuring bijna altijd werkt, dient het als een nuttige technische controle voor fluorescentiemicroscopie (en kan het tevredenheid bieden voor microscopisten-in-opleiding). Antilichaamkleuring kan meer variabel zijn en is een goede maat voor reproduceerbaarheid tussen replicaties. C.elegans-geslachtsklieren kunnen moeilijk consistent te fixeren zijn, omdat deze stap een balans vereist tussen het behoud van de chromosomale structuur en het toestaan van voldoende antilichaamdiffusie. Fixeren met formaldehyde behoudt de chromosomale morfologie het best en het bereiden van formaldehyde vers uit paraformaldehyde-ampullen heeft de meest reproduceerbare resultaten opgeleverd. Het is ook mogelijk om formaldehyde bereid uit formaline (37% waterig formaldehyde en methanol) te gebruiken. Fixatiesterkte en timing moeten mogelijk empirisch worden bepaald voor elk antilichaam. Alternatieve methoden omvatten het overslaan van de formaldehydefixatie in stap 2.4 en, na vriesscheur, onderdompeling in 100% ethanol bij -20 °C, of onderdompeling in 100% methanol gedurende 10 minuten gevolgd door onderdompeling in 100% aceton gedurende 10 minuten bij -20 °C. Deze fix-omstandigheden maken een betere penetratie van antilichamen mogelijk, maar zullen de weefselmorfologie negatief beïnvloeden (chromosomen zullen er uitgeblazen en puffier uitzien).

Timing is erg belangrijk voor de dissectie- en fix-stappen die in stap 2 worden beschreven. Omdat het volume van de dissectieoplossing zo klein is, kan verdamping de uiteindelijke fixatieconcentratie beïnvloeden, wat variabele antilichaamkleuring zal veroorzaken. Een ervaren C. elegans handler kan vanaf het begin (stap 2.3) een slide voorbereiden om te fixen (stap 2.4). De belangrijkste technische hindernis is het vermogen om dieren in de druppel van dissectie-oplossing te plukken en ze snel te ontleden. Het kan gemakkelijker zijn om te leren ontleden in grotere volumes. Nieuwe stagiairs beginnen eerst met het plukken van dieren in 50-200 μL dissectieoplossing in een glazen embryovlekaat (figuur 2D); het bredere oppervlak biedt meer manoeuvreerruimte bij het identificeren van een ideale naaldpositie voor goede gonade-extrusies, terwijl het grotere volume vloeistof verdamping minder een probleem maakt. Eenmaal vertrouwd met de bewegingen van ontleden, beginnen cursisten te ontleden met slechts 50 μL in de schaal en schakelen vervolgens over op ontleden in 20 μL op een dia. Eenmaal ontleed op dia's, kunnen cursisten snel beginnen met het verminderen van de hoeveelheid oplossing totdat ze snel genoeg zijn in het werken in 4 μL om verdamping verwaarloosbaar te maken.

Als de timing van de dissectie een probleem blijft, kunnen cursisten in stap 2.3 8 μL van de dissectieoplossing ontleden. Vervolgens kunnen ze tijdens stap 2.4 8 μL van de fixoplossing toevoegen, voorzichtig pipetteren om grondig te mengen (nauwlettend in de gaten houden of ervoor zorgen dat karkassen niet worden verstoord of weggepipetteerd) en 8 μL uit de gemengde oplossing verwijderen. Deze alternatieve aanpak zal resulteren in hetzelfde eindvolume van 8 μL en dezelfde uiteindelijke fixatieconcentratie; dit volume is belangrijk om ervoor te zorgen dat karkassen tijdens de vriesscheur in stap 2.5 zowel de afdekplaat als het schuifoppervlak raken. Als de timing van het voorbereiden van elke dia een probleem blijft, zelfs in grotere dissectievolumes, wordt een suspensiemethode voor kiembaanimmunofluorescentieprotocol beschreven door Gervaise en Arur²⁶.

De belangrijkste beperking van het gebruik van immunofluorescentie om eiwitten in situ te visualiseren, is de beschikbaarheid van primaire antilichamen gericht op een bepaald eiwit van belang. Als er echter een getagde versie van het eiwit is ontworpen, kan dit protocol worden aangepast om de eiwittag te visualiseren. Antilichamen gericht op veelgebruikte tags, zoals FLAG, HA of GFP, zijn algemeen verkrijgbaar. Fluorescerende tags zoals GFP kunnen vaak worden geblust door fixatiestappen, dus het wordt aanbevolen om een primair antilichaam te gebruiken dat gericht is op GFP, in plaats van te vertrouwen op het inheemse fluorescentiesignaal zelf. Een andere beperking van dit protocol is dat het de kiembaan binnen een enkel tijdsbestek vangt (hoewel alle stadia van oogenese binnen de kiembaan worden weergegeven). Daarom kan deze techniek dynamische veranderingen missen die kunnen optreden naarmate een eicel vordert door oogenese. De timing van gametogenese is echter goed bestudeerd bij C. elegans; bij een wildtype jongvolwassene heeft een eicel ongeveer 60 uur nodig om van de distale punt van de kiembaan (de mitotische zone) naar diakinese te gaan³³. Daarom zou een pulsachtervolging of specifieke interventie zoals bestraling gevolgd door een tijdsverloop de observatie van effecten in verschillende stadia van meiose mogelijk maken.

Concluderend beschrijft dit protocol C. elegans gonaddissectie gevolgd door DAPI en antilichaamkleuring voor fluorescentiemicroscopie. Het ontleden en bevestigen (stap 2) duurt 60-90 minuten, afhankelijk van het aantal gegenereerde dia's. Antilichaamkleuring (stap 3) is meestal hands-off en kan variëren van 7 uur op minimaal 1,5 dag, afhankelijk van de incubatietijden van antilichamen. Montage (stappen 4.1-4.7) duurt ongeveer 15 minuten. Deze algemene benadering voor het visualiseren van kiembaanchromosomen en de gonade kan worden gebruikt voor cytologische studies van elk eiwit als er een antilichaam of fluorescerend tag-reagens bestaat. In zijn eenvoudigste vorm kan DAPI-kleuring van diakinesekernen worden gebruikt om te screenen op factoren die van invloed zijn op meiotische recombinatie. In combinatie met organismale analyses van het aantal nakomelingen, de incidentie van mannen (Him-fenotype) en embryonale letaliteit, biedt deze cytologische benadering een eencellig contrapunt voor populatiegebaseerde analyses.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	Molecular Probes	711-545-152
Aluminum heating/cooling block	Millipore Sigma	Z743497
Bacto Peptone	Gibco	DF0118 17 0
Borosilicate Glass Pasteur Pipets, Disposable, 5.75 inches	Fisherbrand	13 678 20B	Used to make worm picks
BSA, Bovine Serum Albumin	VWR	97061 420
C. elegans wild type (ancestral)	Caenorhabditis Genetics Center	N2 (ancestral)
C. elegans kle-2 (ok1151) mutants	Caenorhabditis Genetics Center	VC768	The full genotype of this strain is: kle-2(ok1151) III/hT2 [bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III). It has kle-2 balanced with a balancer chromosome marked with pharangeal GFP. Pick non-green animals to identify homozygous kle-2 mutants.
C. elegans spo-11 (me44) mutants	Caenorhabditis Genetics Center	TY4342	The full genotype of this strains is: spo-11(me44)  IV / nT1[qIs51] (IV:V). It has spo-11 balanced with a balancer chromosome marked with pharangeal GFP. Pick non-green animals to identify homozygous spo-11 mutants.
Calcium Chloride Anhydrous	VWR	97062 590
Cholesterol	Sigma Aldrich	501848300
DAPI	Life Technologies	D1306
EDTA, Disodium Dihydrate Salt	Apex Bioresearch Products	20 147
Embryo Dish, glass, 30mm cavity	Electron Microscopy Services	100492-980	Used to practice dissecting; glass is preferred because dissected animals can stick to plastic
Escherichia coli	Caenorhabditis Genetics Center	OP50
Food storage container, plastic	various	n/a	Plastic containers with (1) relatively flat bottoms, to allow slides to rest level; (2) lids that are air-tight, but can still be easily removed without disturbing contents of container, and (3) are about 9 inches long by 6 inches wide are preferred
Glass Coplin Jar	DWK Life Sciences Wheaton	08-813E
Hydrophobic Barrier PAP Pen	ImmEdge	NC9545623
Kimwipes	Kimtech Science	06 666A
Levamisole Hydrochloride	Sigma Aldrich	L0380000
Magnesium Sulfate Anhydrous	Fisher Chemical	M65 500
Needles, Single-use, 25 G	BD PrecisionGlide	14 821 13D	blue, 1 inch
NGM Agar, Granulated	Apex Bioresearch Products	20 249NGM
Parafilm	Bemis	16 101
Paraformaldehyde (16% w/v) Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	50 980 487
PBS, Phosphate Buffered Saline (10x Solution)	Fisher BioReagents	BP399500
Petri Dishes, 60-mm	Tritech Research	NC9321999	Non-vented, sharp edge
Platinum wire (90% platinum, 10% iridium)	Tritech Research	PT 9010	Used to make worm picks
Potassium Chloride	Fisher	BP366-500
Potassium Phosphate Dibasic	VWR BDH Chemicals	BDH9266 500G
Potassium Phosphate Monobasic	VWR BDH Chemicals	BDH9268 500G
Premium Cover Glasses 18 mm x 18 mm	Fisherbrand	12-548-AP	0.13–0.17 mm thickness
Razor Blades, Single Edge	VWR	55411 055
SlowFade Gold Antifade Mountant	Molecular Probes	S36937	Alternatives: VectaShield Antifade Mounting Medium (Vector Laboratories, H-1000-10) or ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher Scientific, P36970). If using ProLong Diamond, no nail polish is required for sealing, but slides must cure for 24 hours before imaging.
Sodium Azide	Fisher BioReagents	BP922I 500
Sodium Chloride	Fisher Chemical	S271 500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	Sigma Aldrich	7558 79 4
Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate	Sigma Aldrich	S9390
Styrofoam box	various	n/a	Approximate dimensions of interior: 12 inches long, 9 inches wide, 8 inches deep
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	22 037 246
Triton X-100	Fisher BioReagents	BP151 500
Tryptone	Apex Bioresearch Products	20 251
Tween 20	Fisher Chemical	BP337 500
Yeast Extract	Apex Bioresearch Products	20 254