Onderzoek naar Caspase-mutaties en posttranslationele modificatie door moleculaire modelleringsbenaderingen

Summary

Het huidige protocol maakt gebruik van een biomoleculair simulatiepakket en beschrijft de moleculaire dynamica (MD) benadering voor het modelleren van het wild-type caspase en zijn mutante vormen. De MD-methode maakt het mogelijk om de dynamische evolutie van de caspasestructuur en het potentiële effect van mutaties of posttranslationele modificaties te beoordelen.

Abstract

Apoptose is een soort geprogrammeerde celdood die beschadigde cellen elimineert en de ontwikkeling en weefselhomeostase van meercellige organismen regelt. Caspasen, een familie van cysteïneproteasen, spelen een sleutelrol bij de initiatie en uitvoering van apoptose. De rijping van caspasen en hun activiteit wordt verfijnd door posttranslationele modificaties op een zeer dynamische manier. Om het effect van posttranslationele veranderingen te beoordelen, worden potentiële locaties routinematig gemuteerd met residuen die persistent zijn voor eventuele wijzigingen. Het serineresidu wordt bijvoorbeeld vervangen door alanine of asparaginezuur. Dergelijke substituties kunnen echter de conformatie van de caspase actieve site veranderen, wat leidt tot verstoringen in katalytische activiteit en cellulaire functies. Bovendien kunnen mutaties van andere aminozuurresiduen op kritieke posities ook de structuur en functies van caspasen breken en leiden tot apoptoseverstoring. Om de moeilijkheden van het gebruik van gemuteerde residuen te voorkomen, kunnen moleculaire modelleringsbenaderingen gemakkelijk worden toegepast om het potentiële effect van aminozuursubstituties op de caspasestructuur te schatten. Het huidige protocol maakt het modelleren van zowel het wild-type caspase als zijn mutante vormen mogelijk met het biomoleculaire simulatiepakket (Amber) en supercomputerfaciliteiten om het effect van mutaties op de eiwitstructuur en -functie te testen.

Introduction

Apoptose is een van de meest bestudeerde cellulaire processen die de morfogenese en weefselhomeostase van meercellige organismen reguleren. Apoptose kan worden geïnitieerd door een breed scala aan externe of interne stimuli, zoals de activering van doodsreceptoren, verstoring van de celcyclussignalen, DNA-schade, endoplasmatisch reticulum (ER) stress en verschillende bacteriële en virale infecties¹. De caspasen - belangrijke apoptotische spelers - worden conventioneel ingedeeld in twee groepen: initiators (caspase-2, caspase-8, caspase-9 en caspase-10) en effectors (caspase-3, caspase-6 en caspase-7), afhankelijk van hun domeinstructuur en de plaats in de caspase cascade ^2,3. Bij celdoodsignalen interageren de initiator caspases met adaptermoleculen die nabijheidsgeïnduceerde dimerisatie en autoprocessing vergemakkelijken om een actief enzym te vormen. De caspasen van de effector worden geactiveerd door splitsing door initiator caspasen en voeren stroomafwaartse uitvoeringsstappen uit door meerdere cellulaire substraten^{te splitsen 4}.

De rijping en functie van de initiator en effector caspasen worden gereguleerd door een groot aantal verschillende intracellulaire mechanismen, waaronder de posttranslationele modificatie een onmisbare rol speelt bij celdoodmodulatie⁵. De toevoeging van modificerende groepen (fosforylering, nitrosylering, methylatie of acetylering) of eiwitten (ubiquitinatie of SUMOylation) verandert de enzymatische activiteit van caspasen of de eiwitconformatie en stabiliteit die apoptose reguleren. Site-gerichte mutagenese wordt op grote schaal toegepast om de potentiële posttranslationele modificatiesites te onderzoeken en hun rol te onderscheiden. Een vermeende modificatieplaats wordt meestal vervangen door een ander aminozuur, dat niet verder kan worden gewijzigd. Zo worden potentieel gefosforyleerde serine en threonine gemuteerd tot alanine en worden lysine-ubiquitinatieplaatsen vervangen door arginine. Een andere strategie omvat het vervangen van een aminozuur dat met name posttranslationele modificatie nabootst (glutamaat en aspartaat zijn bijvoorbeeld gebruikt om gefosforyleerde serine of threonine na te bootsen)⁶. Sommige van deze substituties in de hoge omgeving van een actieve locatie of in kritieke posities kunnen echter de caspasestructuur veranderen, de katalytische activiteit verstoren en apoptotische celdood onderdrukken⁷. Vergelijkbare effecten kunnen worden waargenomen in gevallen van tumor-geassocieerde missense mutaties in caspase genen. De tumor-geassocieerde mutatie van caspase-6 - R259H - resulteerde bijvoorbeeld in conformatieveranderingen van lussen in de substraatbindende pocket, waardoor de efficiënte katalytische omzet van substraten^{werd verminderd 8}. De G325A-aminozuursubstitutie in caspase-8 geïdentificeerd in hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom zou de caspase-8-activiteit kunnen belemmeren, wat leidde tot de modulatie van nucleaire factor-kB (NF-kB) signalering en tumorigenese bevorderde⁹.

Om het potentiële effect van aminozuursubstituties op de structuur en functie van caspase te beoordelen, kan moleculaire modellering worden toegepast. De moleculaire dynamica (MD) benadering wordt in dit werk beschreven voor het modelleren van het wild-type caspase en zijn mutante vormen met behulp van het biomoleculaire simulatiepakket (Amber). De MD-methode geeft een beeld van de dynamische evolutie van de eiwitstructuur na de introductie van mutaties. Oorspronkelijk ontwikkeld door de groep van Peter Kollman, werd het Amber-pakket een van de meest populaire softwaretools voor biomoleculaire simulaties 10,11,12,13. Deze software is verdeeld in twee delen: (1) AmberTools, een verzameling programma's die routinematig worden gebruikt voor systeemvoorbereiding (atoomtypetoewijzing, toevoegen van waterstofatomen en expliciete watermoleculen, enz.) en trajectanalyse; en (2) Amber, dat is gecentreerd rond het pmemd-simulatieprogramma. AmberTools is een gratis pakket (en een voorwaarde voor het installeren van Amber zelf), terwijl Amber wordt gedistribueerd met een aparte licentie- en vergoedingsstructuur. Parallelle simulaties op een supercomputer en/of met behulp van grafische verwerkingseenheden (GPU's) kunnen de prestaties voor het wetenschappelijk onderzoek naar eiwitstructuurdynamica aanzienlijk verbeteren¹⁴. De nieuwste beschikbare softwareversies zijn AmberTools21 en Amber20, maar de beschreven protocollen kunnen ook worden gebruikt met de vorige versies.

Protocol

1. Systeemvoorbereiding

OPMERKING: De moleculaire modellen van de inheemse en mutante eiwitvormen zijn gebouwd op basis van een geschikte kristalstructuur verkregen uit de Protein Data Bank^15,16.

1. Om de geselecteerde PDB-structuur op te halen, gebruikt u de vervolgkeuzelijst Bestanden downloaden en klikt u op PDB-indeling. Verwijder opmerkingen en connectiviteitsgegevens en plaats een TER-kaart tussen afzonderlijke eiwitketens in het PDB-bestand. Stel desgewenst de protonatiestatus van histidineresiduen in door de residunaam HIS te vervangen door HIE, HID of HIP (aanvullend bestand 1).
   OPMERKING: Het is redelijk om kristallografisch opgeloste watermoleculen (indien aanwezig in het PDB-bestand) niet te verwijderen.
2. Als u het startmodel wilt voorbereiden, start u het tleap-programma (AmberTools-pakket) en voert u opdrachten in die tleap-objecten manipuleren.
   1. Start het programma: tleap. Laad het ff14SB-krachtveld om het eiwit met moleculaire mechanica te beschrijven: > bron leaprc.protein.ff14SB.
   2. Belastingskrachtvelden voor watermoleculen en atomaire ionen (Na⁺, Cl^-): > bron leaprc.water.tip3p.
   3. Laad het PDB-bestand en bouw coördinaten voor waterstofatomen, waardoor een object met de naam mol: > mol = loadpdb-eiwit.pdb ontstaat.
   4. Controleer op interne inconsistenties die problemen kunnen veroorzaken: > controleer mol.
      OPMERKING: Disulfidebruggen, indien aanwezig, moeten handmatig worden gespecificeerd. Vervang de namen van covalent gebonden cysteines CYS door CYX en typ het volgende commando in tleap om een binding tussen SG-atomen te creëren: binding mol.X.SG mol.Y.SG (X en Y zijn cysteïneresidunummers).
   5. Maak een oplosmiddeldoos rond het eiwit (TIP3P water, 12 Å afstand): > solvatebox mol TIP3PBOX 12.0.
   6. Controleer de totale lading: > lading mol, en voeg counterions (Na ⁺ of Cl^-) toe om het systeem te neutraliseren:
      > voeg toe aan Mol Na⁺ 0.
   7. Maak het topologie prmtop-bestand en het coördinaat-inpcrd-bestand (invoer voor het uitvoeren van een simulatie): > saveamberparm mol protein.prmtop protein.inpcrd. Sluit het tleap-programma af: > stop.
      OPMERKING: Amber-formaat coördinaatbestanden kunnen eenvoudig worden geconverteerd naar PDB-indeling met behulp van de ambpdb-tool (raadpleeg de gebruikershandleiding, zie Materiaaltabel).

2. Energieminimalisatie

OPMERKING: De energieminimalisatie is nodig om slechte contacten en overlappingen tussen atomen in het startsysteem te verwijderen die leiden tot instabiliteit bij het uitvoeren van MD.

1. Voer de eerste fase van de energieminimalisatie uit (2.500 stappen van het steilste afdalingsalgoritme + 2.500 stappen van het geconjugeerde gradiëntalgoritme) om de posities van toegevoegde waterstofatomen en watermoleculen te optimaliseren terwijl de eiwitcoördinaten worden vastgesteld door positionele beperkingen op zware atomen.
   1. Voer het pmemd-programma als volgt uit:
      pmemd -O -i min1.in -p protein.prmtop -c protein.inpcrd -o protein_min1.out
      -r protein_min1.rst -ref protein.inpcrd.
   2. Volg de vereiste argumenten: -i FILE control data; -p FILE moleculaire topologie, krachtveldparameters, atoomnamen; -c FILE initiële coördinaten; -o FILE door de gebruiker leesbare loguitvoer; -r FILE eindcoördinaten; -ref FILE referentiecoördinaten voor positievergrendelingen.
   3. Geef opties op in het invoerbestand min1.in:
      &CNTRL
      imin=1, maxcyc=5000, ncyc=2500,
      cut=10,0, ntb=1,
      ntc=1, ntf=1,
      ntpr=10,
      ntr=1,
      restraintmask=':1-517 & !@H=',
      restraint_wt=2,0
      /
      OPMERKING: Invoeropties: imin = 1 presteren minimalisatie; maxcyc = 5000 maximaal aantal minimalisatiecycli; ncyc=2500 minimalisatiemethode wordt na ncyc-cycli overgeschakeld van steilste afdaling naar geconjugeerde gradiënt; cut=10,0 niet-gebonden cutoff (Å); ntb=1 periodieke grenzen worden opgelegd, constant volume; ntc=1 er worden geen beperkingen toegepast op bindingslengtes (voor een betere energieconvergentie); ntf=1 alle interacties worden berekend; ntpr=10 energie-informatie wordt elke ntpr-stap in het uitbestand afgedrukt; ntr=1 vlag voor het fixeren van gespecificeerde atomen met behulp van een harmonische potentiaal; restraintmask=':1-517 & !@H=' specificeert ingehouden atomen; restraint_wt=2,0 gewicht (kcal/mol∙Ų) voor positionele beperkingen.
2. Voer de tweede fase van de energieminimalisatie uit (5.000 steilste afdalingsstappen + 5.000 geconjugeerde gradiëntstappen) zonder beperkingen om het hele systeem te optimaliseren.
   1. Gebruik min2.in en protein_min1.rst als ingangen: pmemd -O -i min2.in -p protein.prmtop
      -c protein_min1.rst -o protein_min2.out -r protein_min2.rst.
   2. Geef opties op in het invoerbestand min2.in:
      &CNTRL
      imin=1, maxcyc=10000, ncyc=5000,
      cut=10,0, ntb=1,
      ntc=1, ntf=1,
      NTPR=10
      /

3. Verwarming

OPMERKING: Deze fase is bedoeld om het systeem te verwarmen van 0 K tot 300 K. Initiële snelheden worden toegewezen aan atomen omdat het startmodel op basis van het PDB-bestand geen snelheidsinformatie bevat.

1. Voer het verwarmingsproces uit met positionele beperkingen op de eiwitatomen (50 ps, constant volume).
   1. Gebruik heat.in en protein_min2.rst als ingangen: pmemd -O -i heat.in -p protein.prmtop
      -c protein_min2.rst -o protein_heat.out
      -r protein_heat.rst -x protein_heat.mdcrd -ref protein_min2.rst
   2. Volg de vereiste argumenten: -x FILE-coördinatensets die zijn opgeslagen over het MD-traject.
   3. Geef opties op in het invoerbestand heat.in:
      &CNTRL
      imin=0, irest=0, ntx=1,
      nstlim=25000, dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      cut=10,0, ntb=1,
      ntpr=500, ntwx=500,
      ntt=3, gamma_ln=2,0,
      tempi=0,0, temp0=300,0,
      ntr=1, restraintmask=':1-517',
      restraint_wt=1,0,
      nmropt= 1
      /
      &wt TYPE='TEMP0',
      istep1=0, istep2=25000,
      waarde1=0,1, waarde2=300,0 /
      &wt TYPE ='EINDE' /
      OPMERKING: Invoeropties: imin = 0 run MD; irest=0 een nieuwe simulatie uitvoeren; ntx=1 er worden geen beginsnelheden gelezen uit het eerste bestand; nstlim=25000 aantal MD stappen; dt=0,002 tijdstap (ps); ntc=2 bindingen met waterstof worden beperkt met behulp van het SHAKE-algoritme; ntf=2 krachten voor de beperkte bindingen worden niet berekend; ntwx=500 coördinaten worden elke ntwx-stap naar het mdcrd-bestand geschreven; ntt=3 Langevin temperatuurregeling; gamma_ln=2,0 botsingsfrequentie voor Langevindynamica (ps⁻¹); tempi=0,0 begintemperatuur; temp0=300.0 referentietemperatuur; nmropt=1 parameters gespecificeerd in een &wt naamlijst worden gelezen; TYPE='TEMP0' varieert de doeltemperatuur.

4. Evenwicht

OPMERKING: Deze fase is nodig om de dichtheid van water aan te passen en de evenwichtstoestand van het eiwit te verkrijgen.

1. Voer de equilibratie uit bij 300 K zonder enige beperking (500 pk, constante druk).
   1. Gebruik equil.in en protein_heat.rst als ingangen: pmemd -O -i equil.in -p protein.prmtop
      -c protein_heat.rst -o protein_equil.out -r protein_equil.rst -x protein_equil.mdcrd.
   2. Geef opties op in het invoerbestand equil.in:
      &CNTRL
      imin=0, irest=1, ntx=5,
      nstlim=250000,
      dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      cut=10,0, ntb=2, ntp=1, taup=2,0,
      ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=50000,
      ntt=3, gamma_ln=2,0,
      temp0=300,0
      /
      OPMERKING: Invoeropties: irest = 1 start de simulatie opnieuw; ntx=5 coördinaten en snelheden worden gelezen uit een eerder gegenereerd eerste bestand; ntb=2 periodieke grenzen worden opgelegd, constante druk; ntp = 1 isotrope drukschaling; taup=2,0 drukontspanningstijd (ps); ntwr = 50000 elke ntwr-stap , het eerste bestand wordt geschreven, waardoor herstel van een crash wordt gegarandeerd.

5. Productiedynamiek

1. Nadat het evenwicht met succes is bereikt, voert u een productie MD-simulatie (10 ns of langer) uit bij constante druk en genereert u het trajectbestand voor latere analyse van de eiwitstructuur.
   1. Gebruik prod.in en protein_equil.rst als ingangen: pmemd -O -i prod.in -p protein.prmtop
      -c protein_equil.rst -o protein_prod.out -r protein_prod.rst -x protein_prod.mdcrd.
   2. Geef opties op in het invoerbestand prod.in:
      &CNTRL
      imin=0, irest=1, ntx=5,
      nstlim=5000000,
      dt=0,002,
      ntc=2, ntf=2,
      cut=10,0, ntb=2, ntp=1, taup=2,0,
      ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=50000,
      ntt=3, gamma_ln=2,0,
      temp0=300,0, ig=-1
      /
      OPMERKING: De parallelle versie van pmemd (pmemd. MPI) of GPU-versnelde versie (pmemd.cuda) kan worden gebruikt op computerclusters en supercomputers. Een lange MD-simulatie kan in verschillende segmenten worden opgesplitst en sequentieel worden uitgevoerd. Het wordt sterk aanbevolen om ig=-1 (random seed optie) in te stellen voor elke simulatie herstart. De ptraj - of cppptraj-programma's kunnen worden gebruikt voor de analyse en verwerking van coördinaattrajecten. Zie de gebruikershandleiding van de software voor meer informatie.

Results

Het huidige protocol kan gemakkelijk worden toegepast in studies van posttranslationele modificatie van caspasen of pathogene mutaties. In deze sectie wordt de MD-modelleringsworkflow geïllustreerd (figuur 1), die met succes is gebruikt in de studie van caspase-2⁷. Met behulp van in vitro site-gerichte mutagenese van potentiële fosforyleringsplaatsen (Ser/Thr tot Ala) en biochemische benaderingen, werd aangetoond dat de Ser384Ala-mutatie caspase-2-verwerking voorkwam en enzymatische activiteit en de inductie van apoptotische celdood blokkeerde (aanvullende figuur 1). Noch massaspectrometrie-analyse noch Phos-Tag-technologie bevestigde echter dat Ser384 fosforylering ondergaat⁷. Om te begrijpen hoe Ser384 de caspase-2-activiteit reguleert, werd MD-modellering van de driedimensionale eiwitstructuur uitgevoerd (figuur 1).

De moleculaire modellen van wild-type en mutante vormen van caspase-2 werden geconstrueerd met behulp van de 1pyo kristalstructuur (beschikbare caspase-2 structuren zijn vermeld in aanvullende tabel 1). De Ser384Ala-mutant werd gecreëerd door het^O-γ-atoom in het Ser384-residu te verwijderen (in PDB worden Ser- en Ala-residuen onderscheiden door het^O-γ atoom). Waterstofcoördinaten zijn meestal afwezig in kristalstructuren. Daarom werden waterstofatomen toegevoegd aan de eiwitstructuur en vervolgens werd het opgelost door een 12 Å dikke laag TIP3P-water om verdere expliciet-oplosmiddelsimulaties mogelijk te maken. Natriumionen werden toegevoegd om het systeem te neutraliseren. De verkregen startmodellen van caspase-2 werden onderworpen aan energieminimalisatie, equilibratie en daaropvolgende 10 ns MD-simulatie volgens het MD-modelleringsprotocol, met behulp van de min1.in, min2.in, heat.in, equil.in en prod.in controlegegevensbestanden.

In de kristalstructuur van caspase-2 is Ser384, samen met Arg219 en Arg378, betrokken bij het vormen van het oppervlak van de holte op de actieve plaats. Arg219 en Arg378 vormen waterstofbruggen met de carboxylgroep van het substraat, terwijl Ser384 niet ingrijpt in directe interacties met het substraat. MD-simulaties bevestigden dat de Ser384Ala-substitutie geen invloed had op de katalytische residuen Cys320 (nucleofiel) en His277 (algemene base), maar een belangrijke conformatieverandering in Arg378 veroorzaakte. De guanidiniumgroep draaide zich naar het bulkoplosmiddel zodat het N^ε atoom geen essentiële waterstofbrug kon vormen met de carboxylgroep van het substraat (figuur 1). In het inheemse enzym treedt een elektrostatische interactie op tussen het^O-γ atoom van Ser384 (gedeeltelijke negatieve lading) en de Arg378 guanidiniumgroep (positieve lading). De serinesubstitutie verstoort deze interactie echter blijkbaar. Zo werd aangetoond dat de Ser384Ala-substitutie de substraatherkenning door de arginineresiduen in de actieve plaats caspase-2 beïnvloedde, waardoor de enzymatische activiteit en het vermogen om apoptotische celdood te veroorzaken, werden aangetast. Het ontdekte mechanisme lijkt evolutionair geconserveerd en gebruikelijk voor andere caspase-familieleden. De implementatie van MD-simulaties maakte het dus mogelijk om de biochemische resultaten te bevestigen en nieuwe inzichten te verkrijgen in de moleculaire structuur van het actieve centrum van caspasen.

Figuur 1: MD-modelleringsworkflow die wordt gebruikt om de caspase-structuur te bestuderen. De wild-type caspase-2 en zijn Ser384Ala mutant werden onderzocht volgens de instructies in de protocol sectie. Er werd onthuld dat de Ser384Ala-substitutie een belangrijke conformatieverandering induceert in het actieve plaatsresidu Arg378. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Functie van caspase-2 bij celdood. Als reactie op extrinsieke en intrinsieke stimuli kan wild-type caspase-2 worden geactiveerd door een autoproteolytisch mechanisme. Actieve caspase-2 splijt Bid, wat op zijn beurt mitochondriale buitenmembraanpermeabilisatie en apoptotische celdood bevordert. De Ser384Ala mutatie voorkomt caspase-2 activatie en de inductie van celdood. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Caspase-2-structuren beschikbaar in de eiwitgegevensbank. De structuren zijn gesorteerd op releasedatum. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Verschillende stappen bij het bewerken van een PDB-bestand. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

De beschreven MD-benadering maakt het mogelijk om zowel de wild-type als mutante vormen van caspase te modelleren met behulp van de biomoleculaire simulatiepakketten. Verschillende belangrijke kwesties van de methodologie worden hier besproken. Eerst moet een representatieve kristalstructuur van caspase worden geselecteerd uit de Protein Data Bank. Belangrijk is dat zowel monomere als dimerische vormen van caspase acceptabel zijn. Het kiezen van structuren met een hoge resolutie met een minimum aantal ontbrekende residuen is een goed idee. De protonatiestatus van sommige residuen kan handmatig worden ingesteld in het invoer-PDB-bestand. In figuur 1 werd bijvoorbeeld een waterstofatoom bevestigd aan het N^ε2-atoom (HIE-vorm) van het katalytische residu His277. Ten tweede moet er een oplosmiddeldoos rond het eiwit worden gemaakt voor verdere expliciete oplosmiddelsimulaties. Energieminimalisatie is nodig om de coördinaten van toegevoegde waterstofatomen en watermoleculen te optimaliseren. Ten derde moeten de verwarming en equilibratie worden uitgevoerd voorafgaand aan de simulatie van de productiedynamiek. In de verwarmingsfase moet men ervoor zorgen dat de holtes en bindingszakken op het eiwitoppervlak zich vullen met watermoleculen (indien nodig kan men het aantal MD-stappen verhogen). In het evenwichtsfase moet de verwerving van de evenwichtsconformatie van het eiwit worden bevestigd door de wortelgemiddelde-kwadraatafwijking van de ruggengraatatomen van de beginposities¹² te analyseren. Ten vierde is het monitoren van de conformatieveranderingen van de eiwitstructuur tijdens de productiedynamieksimulatie vereist. Voor dit doel moet men trajectframes op de startstructuur plaatsen door de ruggengraatatomen te passen en vervolgens de conformatieveranderingen analyseren met behulp van een moleculair visualisatiegereedschap (VMD, PyMOL, enz.) ¹⁷. Indien nodig kan men het aantal MD-stappen verhogen en/of de simulatie opsplitsen in verschillende segmenten die achtereenvolgens worden uitgevoerd. Ten vijfde wordt aanbevolen om de GPU-versnelde versie van het MD-simulatieprogramma (pmemd.cuda) te gebruiken, waarvan de prestaties aanzienlijk hoger zijn dan die welke haalbaar zijn door de traditionele CPU-implementatie^14,18.

Een mogelijke beperking van de beschreven methode is de beschikbaarheid van bepaalde caspasestructuren in de Protein Data Bank. Er zijn echter meer dan 900 VOB-vermeldingen gevonden onder het "caspase"-verzoek, wat aangeeft dat caspase-structuren in detail zijn onderzocht. Sommige problemen kunnen zich voordoen wanneer een kristalstructuur wordt verkregen bij een lage resolutie (d.w.z. op een grof detailniveau) of enkele fragmenten mist die belangrijk zijn voor de caspase-functie.

Samenvattend zijn MD-modelleringsbenaderingen effectief gebleken in het voorspellen van structurele veranderingen van eiwitten na mutaties van hun genen, modificaties of intermoleculaire interacties. De toepassing van MD-simulatie op het gebied van celdood opent grote mogelijkheden om de moleculaire mechanismen van caspase-regulatie te bestuderen door posttranslationele modificaties. In dit opzicht zou md-simulatie op lange termijn het dynamische gedrag van functionele regio's en het potentiële effect van aminozuursubstituties kunnen beoordelen om de moleculaire oorzaken op te helderen die verband houden met gemuteerde of gemodificeerde caspase-2 en andere caspasen. Missense mutaties van initiator caspase genen (caspase-2/caspase-8/caspase-9/caspase-10) werden bijvoorbeeld gedetecteerd bij gastro-intestinale kankers en in tumoren van het centrale en perifere zenuwstelsel¹⁹. Samen is MD-modellering van caspasen een krachtige in silico-benadering voor het begrijpen van de mechanismen die geprogrammeerde celdood en bijbehorende aandoeningen reguleren en voor het ontwikkelen van nieuwe effectieve therapieën.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amber20	University of California, San Francisco		Software voor moleculaire dynamica simulatie http://ambermd.org
AmberTools21	University of California, San Francisco		Software voor moleculair modelleren en analyse http://ambermd.org