Methodenartikel

Scheiding van immuuncelsubpopulaties in perifere bloedmonsters van kinderen met infectieuze mononucleosis

DOI:

10.3791/64212

⸱

7 september 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infectious Diseases, Key Laboratory of Major Diseases in Children, Ministry of Education, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Laboratory of Infection and Virology, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, National Center for Children's Health, 2Research Unit of Critical Infection in Children, 2019RU016, Chinese Academy of Medical Sciences

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een methode die immunomagnetische kralen en fluorescentie-geactiveerde celsortering combineert om gedefinieerde immuuncelsubpopulaties van perifere mononucleaire bloedcellen (monocyten, CD4 + T-cellen, CD8 + T-cellen, B-cellen en natural killer-cellen) te isoleren en te analyseren. Met behulp van deze methode kunnen magnetische en fluorescerend gelabelde cellen worden gezuiverd en geanalyseerd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infectieuze mononucleosis (IM) is een acuut syndroom dat meestal wordt geassocieerd met primaire Epstein-Barr-virus (EBV) -infectie. De belangrijkste klinische symptomen zijn onregelmatige koorts, lymfadenopathie en significant verhoogde lymfocyten in perifeer bloed. Het pathogene mechanisme van IM is nog onduidelijk; er is geen effectieve behandelmethode voor, waarbij voornamelijk symptomatische therapieën beschikbaar zijn. De belangrijkste vraag in EBV-immunobiologie is waarom slechts een kleine subgroep van geïnfecteerde personen ernstige klinische symptomen vertoont en zelfs EBV-geassocieerde maligniteiten ontwikkelt, terwijl de meeste personen asymptomatisch zijn voor het leven met het virus.

B-cellen zijn voor het eerst betrokken bij IM omdat EBV-receptoren op hun oppervlak worden gepresenteerd. Natural killer (NK) cellen zijn cytotoxische aangeboren lymfocyten die belangrijk zijn voor het doden van EBV-geïnfecteerde cellen. Het aandeel CD4+ T-cellen neemt af, terwijl dat van CD8+ T-cellen dramatisch uitbreidt tijdens acute EBV-infectie, en de persistentie van CD8+ T-cellen is belangrijk voor levenslange controle van IM. Die immuuncellen spelen een belangrijke rol in IM en hun functies moeten afzonderlijk worden geïdentificeerd. Voor dit doel worden monocyten eerst gescheiden van perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) van IM-individuen met behulp van CD14-microbeads, een kolom en een magnetische separator.

De resterende PBMC's zijn gekleurd met peridinine-chlorofyl-eiwit (PerCP)/Cyanine 5,5 anti-CD3, allophycocyanine (APC)/Cyanine 7 anti-CD4, phycoerythrin (PE) anti-CD8, fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56 en APC anti-CD16 antilichamen om CD4+ T cellen, CD8+ T cellen, B cellen en NK cellen te sorteren met behulp van een flow cytometer. Bovendien werd transcriptoomsequencing van vijf subpopulaties uitgevoerd om hun functies en pathogene mechanismen in IM te onderzoeken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epstein-Barr-virus (EBV), een γ-herpesvirus ook bekend als humaan herpesvirus type 4, is alomtegenwoordig in de menselijke bevolking en vestigt levenslange latente infectie bij meer dan 90% van de volwassen bevolking1. De meeste PRIMAIRE EBV-infecties treden op tijdens de kindertijd en adolescentie, waarbij een fractie van de patiënten zich manifesteert met infectieuze mononucleosis (IM)2, met karakteristieke immunopathologie, waaronder een geactiveerde immuunrespons met CD8+ T-cellen in het bloed en een voorbijgaande proliferatie van EBV-geïnfecteerde B-cellen in de orofarynx3. Het verloop van IM kan 2-6 weken duren en de meerderheid van de patiënten herstelt goed4. Sommige personen ontwikkelen echter aanhoudende of terugkerende IM-achtige symptomen met een hoge morbiditeit en mortaliteit, die is geclassificeerd als chronische actieve EBV-infectie (CAEBV)5. Bovendien is EBV een belangrijk oncogene virus, dat nauw verwant is aan een verscheidenheid aan maligniteiten, waaronder epithelioïde en lymfoïde maligniteiten zoalsnasofaryngeaal carcinoom, Burkitt-lymfoom, Hodgkin-lymfoom (HL) en T / NK-cellymfoom6. Hoewel EBV al meer dan 50 jaar wordt bestudeerd, zijn de pathogenese en het mechanisme waarmee het de proliferatie van lymfocyten induceert, niet volledig opgehelderd.

Verschillende studies hebben de moleculaire handtekeningen voor de immunopathologie van EBV-infectie onderzocht door transcriptoomsequencing. Zhong et al. analyseerden volledige transcriptoomprofilering van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) van Chinese kinderen met IM of CAEBV om te ontdekken dat CD8 + T-celexpansie voornamelijk werd gevonden in de IM-groep7, wat suggereert dat CD8 + T-cellen een belangrijke rol kunnen spelen bij IM. Evenzo vond een andere studie lagere percentages EBV-specifieke cytotoxische T- en CD19 + B-cellen en hogere percentages CD8 + T-cellen bij patiënten met IM veroorzaakt door primaire EBV-infectie dan bij patiënten met IM veroorzaakt door zowel EBV-reactivatie als andere middelen8. B-cellen zijn voor het eerst betrokken bij IM omdat EBV-receptoren op hun oppervlak worden gepresenteerd. Al Tabaa et al. vonden dat B-cellen polyclonaal geactiveerd en gedifferentieerd waren inplasmablasten (CD19+, CD27+ en CD20−, en CD138− cellen) en plasmacellen (CD19+, CD27+ en CD20−, en CD138+) tijdens IM9. Bovendien vonden Zhong et al. dat monocytmarkers CD14 en CD64 werden geupreguleerd in CAEBV, wat suggereert dat monocyten een belangrijke rol kunnen spelen in de cellulaire immuunrespons van CAEBV via antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (ADCC) en hyperactieve fagocytose7. Alka et al. karakteriseerden het transcriptoom van MACS gesorteerde CD56dim CD16+ NK cellen van vier patiënten van IM of HL en vonden dat NK-cellen van zowel IM als HL gedownreguleerde aangeboren immuniteit en chemokine signaleringsgenen hadden, die verantwoordelijk zouden kunnen zijn voor de hyporesponsiviteit van NK-cellen10. Daarnaast analyseerden Greenough et al. genexpressie van gesorteerde CD8 + T-cellen van 10 PBMC's van personen met IM. Ze meldden dat een groot deel van de CD8 + T-cellen in IM virusspecifiek, geactiveerd, delend en klaargestoomd waren om effectoractiviteiten uit te oefenen11. Zowel T-cel-gemedieerde, EBV-specifieke responsen als NK-cel-gemedieerde, niet-specifieke responsen spelen essentiële rollen tijdens primaire EBV-infectie. Deze studies onderzochten echter alleen de transcriptoomresultaten van het diverse mengsel van immuuncellen of alleen een bepaalde subpopulatie van lymfocyten, wat niet voldoende is voor de uitgebreide vergelijking van de moleculaire kenmerken en functies van verschillende immuuncelsubpopulaties bij kinderen met IM in dezelfde ziektetoestand.

Dit artikel beschrijft een methode die immunomagnetische kralen en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) combineert om gedefinieerde immuuncelsubpopulaties van PBMC's (monocyten, CD4 + T-cellen, CD8 + T-cellen, B-cellen en NK-cellen) te isoleren en te analyseren. Met behulp van deze methode kunnen magnetische en fluorescerend gelabelde cellen worden gezuiverd met behulp van een magnetische separator en FACS of worden geanalyseerd door flowcytometrie. RNA kan uit de gezuiverde cellen worden geëxtraheerd voor transcriptoomsequencing. Deze methode zal de karakterisering en genexpressie van verschillende immuuncellen in dezelfde ziektetoestanden van personen met IM mogelijk maken, wat ons begrip van de immunopathologie van EBV-infectie zal vergroten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bloedmonsters werden verkregen van patiënten met IM (n = 3), gezonde EBV-dragers (n = 3) en EBV-niet-geïnfecteerde kinderen (n = 3). Vrijwilligers werden gerekruteerd uit het Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, en alle studies werden ethisch goedgekeurd. Ethische goedkeuring werd verkregen door de ethische commissie van het Beijing Children's Hospital, Capital Medical University (goedkeuringsnummer: [2021]-E-056-Y). Er werd afgezien van geïnformeerde toestemming van patiënten, omdat de studie alleen de resterende monsters gebruikte voor klinische tests. Alle gegevens werden volledig gedeïdentificeerd en geanonimiseerd om de privacy van patiënten te beschermen.

1. Isolatie van PBMC's uit perifeer bloed

  1. Verzamel vers perifeer bloed (2 ml) van patiënten met IM in K3EDTA-buizen door standaard venapunctie.
    OPMERKING: Het proces moet snel zijn om de levensvatbaarheid van de cel te behouden.
  2. Verdun perifeer bloed tot een tweevoudig volume met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en leg het bovenop het menselijke lymfocytenscheidingsmedium (dichtheid: 1,077 ± 0,001 g / ml) in een centrifugebuis van 15 ml.
    OPMERKING: De volumeverhouding van bloed, PBS en scheidingsmedium was 1:1:1. Voeg het bloed langzaam toe aan het scheidingsmedium en centrifugeer onmiddellijk om te voorkomen dat bloed in het scheidingsmedium bezinkt.
  3. Centrifugeer bij 800 × g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Breng de middelste laag (verrijkte PBMC's) over naar een andere centrifugebuis van 15 ml.
    OPMERKING: Na centrifugatie bevinden zich aan de onderkant van de buis erytrocyten, de middelste laag is het scheidingsmedium, de bovenste laag is plasma en tussen de plasmalaag en de scheidingsvloeistoflaag bevonden zich de PBMC's (inclusief lymfocyten en monocyten).
  4. Was de PBMC's met 10 ml PBS en centrifugeer op 800 × g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur; gooi het supernatant voorzichtig weg.
  5. Herhaal het wassen en centrifugeren (stap 1.4) 2 x. Resuspendeer de PBMC's met 1 ml PBS in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en tel de cellen met een op trypan blue gebaseerde, geautomatiseerde teller.

2. Isolatie van CD14 + monocyten van PBMC's met behulp van CD14 microbeads

  1. Bereid een bufferoplossing met 0,5% foetaal runderserum (FBS) en 2 mM EDTA in PBS (pH 7,2). Houd de buffer koud (2−8 °C).
    OPMERKING: Ontgas de buffer voor gebruik, omdat luchtbellen de kolom kunnen blokkeren. Houd de cellen koud om te voorkomen dat de antilichamen op het celoppervlak worden afgedekt en niet-specifieke celetikettering.
  2. Centrifugeer de PBMC's op 300 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant voorzichtig weg. Resuspendeer de cellen met 80 μL van de buffer. Voeg 20 μL CD14 microbeads toe aan de celsuspensie.
    OPMERKING: Als er ≤ 107 PBMC's zijn, gebruik dan het hierboven aangegeven volume. Als er > 107 PBMC's zijn, verhoog dan proportioneel alle reagensvolumes en het totale volume.
  3. Meng de CD14 microbeads en de cellen goed in de 1,5 ml microcentrifugebuis en incubeer gedurende 15 minuten in een koelkast van 4 °C. Was de PBMC's met 1 ml buffer en centrifugeer op 300 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant volledig weg. Resuspendeer de cellen met 500 μL van de buffer.
    OPMERKING: Als er ≤ 108 PBMC's zijn, gebruik dan het hierboven aangegeven volume. Als er > 108 PBMC's zijn, verhoog dan proportioneel het buffervolume.
  4. Magnetische scheiding met kolommen:
    1. Plaats de kolom op de magnetische kraalscheider en was de kolom met 3 ml buffer. Voeg de celsuspensie (uit stap 2.3) toe aan de kolom.
    2. Verzamel de niet-gelabelde cellen die door de kolom gaan in een centrifugebuis van 15 ml en was de kolom met 3 ml buffer. Was de kolom met 3 x 3 ml buffer. Verzamel het totale effluent in de centrifugebuis van 15 ml.
    3. Plaats de kolom in een nieuwe centrifugebuis van 15 ml. Voeg 5 ml buffer toe aan de kolom. Duw de zuiger stevig in de kolom om de magnetisch gelabelde cellen onmiddellijk in de centrifugebuis van 15 ml te spoelen.
    4. Centrifugeer de magnetisch gelabelde cellen op 300 × g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Resuspensie van de cellen in 500 μL PBS in een microcentrifugebuis van 1,5 ml voor gebruik in de daaropvolgende transcriptoomsequencing.

3. Scheiding van lymfocytenpopulaties van PBMC's door fluorescerend gelabelde antilichaamkleuring en FACS

  1. Centrifugeer de niet-gelabelde cellen (stap 2.4.2) bij 300 × g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Resuspensieer de cellen in 100 μL PBS in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
  2. Voeg 2 μL van elk gelabeld antilichaam (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56) toe aan de 100 μL celsuspensie (de volumes en geconjugeerde fluorofoorinformatie van antilichamen worden weergegeven in tabel 1), incubeer op ijs gedurende 30 minuten en bescherm tegen licht.
  3. Was de cellen 2 x door 1 ml PBS toe te voegen en te centrifugeren op 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspensieer de cellen in 500 μL PBS in de 1,5 ml microcentrifugebuis. Vortex de celsuspensie voorzichtig voordat gegevens worden verkregen op een flow cell sorter cytometer.

4. Instelling van de flowcytometrieparameter

  1. Neem indien nodig 100 μL van de celsuspensie (zie rubriek 1) in microcentrifugebuizen van 1,5 ml en stel een negatief controlemonster, een CD3-monster met één kleuring, een CD4-monster met één kleuring, een CD8-monster met één kleuring, een CD19-monster met één kleuring en een CD56/CD16-kleuringsmonster in.
  2. Voeg 2 μL van het overeenkomstige fluorescerend gelabelde antilichaam toe per 100 μL van de celsuspensie en vortex. Broed op ijs gedurende 30 minuten in het donker. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 × g en adem het supernatant aan. Resuspendeer de pellets met 500 μL PBS en vortex.
  3. Zet de sorteerstroom in en vertraag de druppels met behulp van de fluorescerende kralen als volgt:
    1. Open het celsorteersysteem, voer het inschakelprogramma uit, installeer het mondstuk van 85 μm en open de sorteerstroom. Stel de sorteerspanning in op 4.500 V en de Freq op 47.
    2. Pas de parameters voornamelijk aan door het hoofdstroomdruppelbreekpunt en de druppelvertraging aan te passen volgens de instructies van de fabrikant12. Stel de eerste druppelbreekpuntpositie (Drop1) in op 275 en de gap op 8 in het breakoff-venster . Schakel de sweet spot automatische sorteermodus in zodat de cytometrie automatisch de amplitudewaarde van de druppel kan bepalen om de stroom te stabiliseren.
    3. Pas de druppelvertraging aan op 30,31 in het side stream-venster door de fluorescerende kralen te laden, zodat de kralen een zijstroomafbuiging van > 99% bereiken in de initiële of fijnafstellingsmodus.
  4. Raadpleeg de gatingstrategie in figuur 1 om gating als volgt uit te voeren:
    1. Teken met behulp van een forward scatter-area (FSC-A)/side scatter-area (SSC-A) dot plot de polygoonpoort (P1) om de intacte lymfocytenpopulatie te identificeren.
    2. Gebruik een FSC-A/FSC-hoogte (FSC-H) dot plot, teken de polygoon poort (P2) om de enkele cellen te identificeren en doubletten uit te sluiten (figuur 1A).
    3. Teken met behulp van een CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A dot plot de rechthoekige poort (P3) om CD3+ T-cellen en CD19+ B-cellen te selecteren (figuur 1A,B).
    4. Teken met behulp van een CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A dot plot een rechthoekige poort om CD4+ T-cellen en CD8+ T-cellen te selecteren (cellen met een hoge fluorescentie voor deze markers, respectievelijk).
    5. Teken met behulp van een CD56/CD16 APC-A/SSC-A dot plot een rechthoekige poort om CD56+/CD16+ NK-cellen te selecteren (figuur 1C).
  5. Pas instrumentele parameters aan met behulp van het negatieve controlemonster:
    1. Installeer de negatieve bedieningsbuis op de laadpoort en klik op Laden in het Acquisitiedashboard. Selecteer de cytometerinstellingen in de software.
    2. Klik in het venster Infovenster op het tabblad Parameters en pas de spanningen van FSC, SSC en verschillende fluorescerende kleurstoffen aan; FSC: 231, SSC: 512, PE: 549, APC: 615, APC-Cyanine 7: 824, FITC: 555, PerCP-Cyanine 5.5: 663.
  6. Pas de compensatie aan met behulp van de enkelgekleurde monsters13.
    1. Laad de enkelvlekbuizen sequentieel op de cytometrie en selecteer Cytometerinstellingen in de software. Klik op het tabblad Compensatie om de compensatie aan te passen.
      OPMERKING: De compensatiereferentie van flowcytometrie is weergegeven in tabel 2.

5. Celsortering en het verzamelen van gegevens via flowcytometrie

  1. Vortex de celsuspensie (gescheiden PBMC's volgens secties 1-3) kort om de cellen te resuspenderen voordat de buis in de cytometer wordt geladen. Houd de resterende buizen op ijs.
  2. Voeg 200 μL FBS toe aan vier verzamelstroombuizen om te voorkomen dat de gesorteerde cellen aan de buiswand blijven plakken en plaats ze in de verzamelkamer van de cytometer.
  3. Verzamel CD3+CD4+ T-cellen, CD3+CD8+ T-cellen, CD3−CD19+ B-cellen en CD3− CD56+/CD16+ NK-cellen afzonderlijk van het monster van een patiënt met IM in de vier stroombuizen (figuur 2A).
  4. Centrifugeer de gescheiden cellen op 300 × g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Voeg 200 μL RNA-isolatiereagens toe aan de cellen voor transcriptoomsequencing.
  5. Scheid de immuuncelsubpopulaties van monsters van gezonde EBV-dragers en EBV-niet-geïnfecteerde kinderen volgens de bovenstaande stappen (figuur 2B, C).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Referentie van de gatingstrategie
De gatingstrategie die wordt gebruikt om de vier lymfocytensubpopulaties te sorteren, is weergegeven in figuur 1. Kortom, lymfocyten worden geselecteerd (P1) op een dot plot die de granulositeit (SSC-A) versus grootte (FSC-A) weergeeft. Vervolgens worden afzonderlijke cellen geselecteerd (P2) op een dot plot met de grootte (FSC-A) versus forward scatter (FSC-H), terwijl doubletcellen worden uitgesloten. CD3+ T-cellen (P3) en CD...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is een efficiënte manier om subpopulaties van perifere immuuncellen in het bloed te sorteren. In deze studie werden veneuze bloedmonsters van patiënten met IM, gezonde EBV-dragers en EBV-niet-geïnfecteerde kinderen geselecteerd als onderzoeksdoelstelling. Dit werk met behulp van het perifere bloed van patiënten met IM richt zich voornamelijk op het analyseren en bepalen van de verhoudingen van verschillende celsubsets door middel van meerkleurige flowcytometrie. Transcriptoomsequencing wordt voornamelijk geb...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82002130), Beijing Natural Science Foundation (7222059) en het CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
APC anti-human CD16Biolegend302012Fluorescente antilichaam 
APC anti-human CD56 (NCAM)Biolegend362504Fluorescente antilichaam 
APC/Cyanine7 anti-human CD4Biolegend344616Fluorescente antilichaam 
Geautomatiseerde celtellerBIO RADTC20Celtelling
BD FACSAria fluorescentie-geactiveerde flow cel sorteerder-cytometer (BD FACSAria II)Becton, Dickinson and Company644832Celsortering
CD14 MicroBeads, humanMiltenyi Biotec130-050-201microbeads
Celtelling slidesBIO RAD1450016Celtelling
CentrifugebuizenFalcon3520971515 mL centrifugebuis
EDTA (≥99%, BioPremium)BeyotimeST1303EDTA
Ethyleen diamine tetra azijnzuur (EDTA) anticoagulansbuizenBecton, Dickinson and Company 367862 EDTA anticoagulansbuizen
FITC anti-human CD19Biolegend302206Fluorescente antilichaam 
Gibco Foetaal RundserumThermo Fisher Scientific16000-044Foetaal Rundserum
 Hoge-snelheid centrifugeSigma 3K15Celcentrifugering voor 15 mL centrifugebuis
 Hoge-snelheid centrifugeEppendorf5424RCelcentrifugering voor 1,5 mL Eppendorf (EP) buis
Menselijke lymfocytscheidingsmediumDakeweDKW-KLSH-0100Ficoll-Paque
LS  Scheidings kolommenMiltenyi Biotec130-042-401Scheidings kolommen
MicrocentrifugebuizenAxygenMCT-150-C1,5 mL microcentrifugebuis
MidiMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-302Magneetpareltjesscheider
PE anti-human CD8Biolegend344706Fluorescente antilichaam 
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3Biolegend344808Fluorescente antilichaam 
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)BI02-024-1ACSPBS
Polystyreen buisjes met ronde bodemFalcon3522355 mL buisje voor FACS flow cytometer
TRIzol reagentAmbion15596024Lyse cellen voor RNA extractie
Trypan Blue Kleuring Celvitaliteit Assay KitBeyotimeC0011Trypan Blue Kleuring

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60(2016).
  2. Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells. Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).
  3. Balfour, H. H., et al. Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students. Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).
  4. Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. Infectious mononucleosis. New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).
  5. Fujiwara, S., et al. Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan. Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).
  6. Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270(2017).
  7. Zhong, H., et al. Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 17775(2017).
  8. Fedyanina, O. S., et al. The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children. Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).
  9. Al Tabaa, Y., et al. B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis. Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).
  10. M, A., et al. Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation. Immunobiology. 225 (3), 151907(2020).
  11. Greenough, T. C., et al. A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection. Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).
  12. Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry. Gastroenterology Research and Practice. , 5436961(2019).
  13. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  14. Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431(2019).
  15. Djaoud, Z., et al. Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).
  16. Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders. Cancers. 13 (8), 1836(2021).
  17. Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection. PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110(2018).
  18. Zamai, L., et al. Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy. Cells. 9 (3), 753(2020).
  19. Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers In Microbiology. 9, 416(2018).
  20. Choi, I. K., et al. Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Scheiding van immuuncellenEpstein Barrvirusflowcytometriefluorescentie geactiveerde sorteringimmunomagnetische beadsCD4 T cellenCD8 T cellennatural killer cellen

Gerelateerde artikelen