Methodenartikel

Oprichting van een eenvoudig en effectief rattenmodel voor intraoperatieve beeldvorming van bijschildklieren

DOI:

10.3791/64222

⸱

17 augustus 2022

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Head & Neck Cancer Translational Research of Zhejiang Province, Zhejiang Cancer Hospital, 2The Cancer Hospital of the University of Chinese Academy of Sciences (Zhejiang Cancer Hospital), 3Institute of Basic Medicine and Cancer (IBMC), Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tot op heden wordt de ontwikkeling van bijschildklier (PG) identificatiemethoden beperkt door het gebrek aan diermodellen in preklinisch onderzoek. Hier stellen we een eenvoudig en effectief rattenmodel op voor intraoperatieve PG-beeldvorming en evalueren we de effectiviteit ervan door ijzeroxidenanodeeltjes te gebruiken als een nieuw PG-contrastmiddel.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bijschildklier (PG) identificatie is een kritieke onvervulde behoefte bij thyroidectomie. De identificatie van de PG is een uitdaging bij schildklierchirurgie omdat het qua kleur vergelijkbaar is met de schildklier. Het gebrek aan effectieve diermodellen in preklinisch onderzoek is een ernstige beperking voor de ontwikkeling van PG-identificatietechnieken. Dit protocol maakt het mogelijk om een eenvoudig en effectief rattenmodel voor PG-identificatie vast te stellen. In dit model worden zwarte ijzeroxide nanodeeltjes (IONPs) lokaal in de schildklier geïnjecteerd en snel diffunderen in de schildklier, maar niet in de PG. Een negatief gekleurde PG en een positief bevlekte schildklier kunnen gemakkelijk met het blote oog worden geïdentificeerd zonder dat externe microscopen nodig zijn. De positie van de PG kan worden geïdentificeerd door het kleurcontrast tussen de schildklier en de PG te verhogen, op basis van de kleur van de zwarte IONPs. Dit rattenmodel is goedkoop en handig voor PG-identificatie, en de IONPs zijn een nieuw PG-contrastmiddel.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bijschildklier (PG) is een kleine, ovaalvormige endocriene klier in de nek van mensen en andere gewervelde dieren, die bijschildklierhormonen produceren en afscheiden om calcium- en fosforspiegels in het bloed en in botten te reguleren en in evenwicht te brengen1. Mensen hebben meestal twee paren PG achter de schildklierkwabben op variabele locaties; de grootte van menselijke PG meet doorgaans 6 mm x 4 mm x 2 mm, met een gewicht van ongeveer 35-40 mg2. Verwijdering of beschadiging van de PG veroorzaakt hypoparathyreoïdie (HP), een endocriene aandoening die wordt gekenmerkt door hypocalciëmie en lage of niet-detecteerbare niveaus van bijschildklierhormonen, die een breed scala aan symptomen veroorzaken, van krampachtige spasmen tot misvormde tanden tot chronische nierziekten. Sommige van deze complicaties zijn fataal (bijv. hartfalen en epileptische aanvallen)3,4,5; PG is dus essentieel bij het reguleren van het metabolisme van het lichaam en het in stand houden van het leven.

HP is een van de meest voorkomende complicaties na een voorste nekoperatie, vooral bij thyroidectomie, een gevestigde curatieve behandeling voor schildklierkanker, de meest voorkomende endocriene kanker wereldwijd 6,7. Post-thyroidectomie HP wordt voornamelijk veroorzaakt door direct trauma, ischemie of verwijdering van de PG bij een operatie vanwege een ernstig gebrek aan vermogen om de PG betrouwbaar te onderscheiden van schildklierkwabben en andere omliggende weefsels (bijv. lymfeklieren en perifere vetdeeltjes) in realtime in de operatiekamer. In 2021 rapporteerden Barrios et al. een gemiddeld PG-missectiepercentage van 22,4% binnen 1.114 gevallen van thyroidectomie, en zelfs ervaren chirurgen met een minimaal foutenpercentage van 7,7% 8. Dergelijke hoge PG-missectiepercentages zijn consistent met andere vergelijkbare rapporten 9,10,11. Onjuiste bijschildklierectomie is dus een onafhankelijke risicofactor voor voorbijgaande en permanente postoperatieve HP.

Het ontwikkelen van effectieve intraoperatieve PG-identificatiemethoden bevat de sleutel tot het aanpakken van deze kritieke onvervulde medische behoefte; het is echter ernstig beperkt door het gebrek aan diermodellen in preklinisch onderzoek. Tot op heden zijn de meeste intraoperatieve PG-identificatieonderzoeken uitgevoerd op menselijke patiënten en grote dieren (bijv. honden)12, die duur zijn en moeilijk om ethische goedkeuring te krijgen, het aantal proefpersonen uit te breiden en tests te herhalen. Ondertussen heeft de muis, het meest gebruikte gewervelde model in biologisch onderzoek, extreem kleine PG, met een grootte van minder dan 1 mm13. Vanwege deze beperking zijn PG-modellen van muizen zelden gebruikt in intraoperatief PG-identificatieonderzoek.

Dit artikel rapporteert de oprichting van een eenvoudig, eenvoudig en effectief rattenmodel voor intraoperatieve PG-identificatiestudies. We onderzochten het gebruik van inheemse Sprague-Dawley (SD) ratten zonder chirurgische modificaties of genetische manipulatie als een betrouwbaar diermodel voor het testen van een PG-beeldcontrastmiddel, IONPs, in een thyroidectomiechirurgie. Dit rattenmodel toont een zeer vergelijkbare fysiologische structuur van PG en de omliggende micro-omgeving als die van mensen, en de grootte van rat PG is groot genoeg om visueel te worden gedetecteerd in vergelijking met die van muizen. De meeste ratten hebben één PG aan elke kant van de schildklier. De eenvoud en effectiviteit van dit rattenmodel zijn aangetoond door het uitvoeren van intraoperatieve IONP-verbeterde PG-beeldvorming bij thyroidectomiechirurgie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierstudies zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Institute of Basic Medicine and Cancer, Chinese Academy of Sciences. Dit is een non-survival operatie.

1. Dier

  1. Gebruik een 6-8 weken oude vrouwelijke SD-rat, met een gewicht van 250 g, voor intraoperatieve PG-beeldvorming.

2. Anesthesie

  1. Schakel het anesthesieapparaat in.
  2. Voordat u begint, moet u ervoor zorgen dat het isofluraanniveau vol is in de anesthesieverdamper. Schakel vervolgens de zuurstof in en stel het debiet in op 0,4-0,8 l / min. Anesthesie induceren met 3-5% isofluraan en handhaven op 2% isofluraan (debiet: 0,4-0,8 l/min).
  3. Plaats de SD-rat in de doos van het anesthesieapparaat en selecteer het Kanaalmodel om de anesthesie van dieren te starten.
  4. Observeer de rattenactiviteit in de doos. Wanneer de rat in coma raakt, verplaats deze dan naar de neuskegel om de anesthesie te behouden (onbewuste rugligging zonder pijnreflex en hoornvliesreflex).
  5. Gebruik het anesthesiemasker om de neus van de rat te bedekken en schakel het anesthesieapparaat in de maskermodus om het dier tijdens de operatie onder narcose te houden.

3. Houding en fixatie

  1. Breng de verdoofde rat over op een chirurgisch gordijn op een operatietafel. Plaats een voorbewarmd verwarmingskussen onder het dier om de lichaamstemperatuur van het dier tijdens de operatie te ondersteunen.
  2. Gebruik elastiekjes om de ledematen van de rat aan de operatietafel te bevestigen. Plaats een cilindrisch kussen gemaakt van drape onder de schouder van de rat om zijn hoofd naar achteren te leunen, waardoor het nekgebied volledig wordt blootgesteld.
  3. Breng kunstmatige tranenzalf aan op beide ogen van de rat om uitdroging tijdens de anesthesie te voorkomen.

4. Ontharing

  1. Breng ontharingscrème aan op het nekgebied: tot aan de submandibulaire ruimte, tot aan het xiphoid-proces en aan beide zijden aan de buitenkant van de sternocleidomastoïde spier.
  2. Veeg na 3 min voorzichtig het haar en de ontharingscrème af met een tissue.

5. Sterilisatie

  1. Gebruik een joodofore watje om het operatiegebied 3 keer te desinfecteren van het midden van de nek tot de omgeving. Desinfecteer alleen het gebied waaruit het haar is verwijderd.

6. Chirurgische drape leggen

  1. Gebruik een chirurgisch gordijn om het operatiegebied van de nek van de rat te bedekken. Houd het gat van het chirurgische gordijn uitgelijnd met het desinfectiegebied van het dier.

7. Incisie

  1. Bevestig het chirurgische vlak van anesthesie via het ontbreken van een teenknijpreflex voordat u de incisie maakt. Plaats vervolgens het mes in het scalpel en gebruik het scalpel om een longitudinale incisie te maken in de voorste middellijn van de nek van de rat. Zorg ervoor dat de incisielengte ongeveer 5 cm is en alleen in de dermis.

8. Dissectie van onderhuids weefsel uit de voorste cervicale spier

  1. Til de huid langs beide zijden van de incisie op.
  2. Gebruik een schaar om langs de linea alba cervicalis in de lengterichting te knippen.
  3. Gebruik een tang om de sternohyoïde spier en de sternothyroid spier te scheiden.

9. Bevestig de voorste nekspieren aan beide zijden

  1. Gebruik een vasculaire tang om de gescheiden sternohyoïde spier en sternothyroid spier voor de nek te klemmen en het geklemde weefsel naar buiten te trekken.
  2. Gebruik een retractor of de naald om de hechting (3-0 #) door het geklemde weefsel te laten gaan, maak een knoop en bevestig de hechting aan het chirurgische gordijn van de operatietafel.

10. Lokalisatie van de schildklier

  1. Lokaliseer het schildklierkraakbeen en cricoid kraakbeen als de bovengrens in het operatiegebied. Identificeer het schildklierkraakbeen op basis van de schildvorm en het cricoid kraakbeen op basis van de ringvorm.
  2. Zoek de luchtpijp als de ondergrens in het operatiegebied. Zoek naar de luchtpijp aan de voorkant en het midden van de nek, gebaseerd op de buisvormige kraakbeenringvorm.
  3. Lokaliseer de schildklier tussen de boven- en ondergrens - een rode klier in de vorm van een vlinder aan de andere kant van de luchtpijp.

11. Visuele identificatie van de PG

  1. Lokaliseer de PG aan de boven- en buitenkant van de schildklier. Zoek naar twee PG in een fusiforme vorm van ongeveer 1,2-2 mm lang en 1,0-1,5 mm breed die roodachtig zijn maar lichter dan de omliggende schildklier met een bepaalde grens.
  2. Maak een frontale foto van de PG met de luchtpijp, schildklier en strottenhoofd om de effecten van IONP voor en na injectie kwantitatief te vergelijken.
  3. Ontleed de achterkant van de slokdarm en gebruik vervolgens de retractor om de rechterkant van de PG bloot te leggen. Maak een rechterfoto van de PG met de schildklier en luchtpijp.
  4. Verwissel het retractor om de andere kant van de PG bloot te leggen en maak een foto aan de linkerkant van hen met de schildklier en de luchtpijp.

12. Schildklierinjectie van de IONPs

  1. Gebruik een insulinespuit om lokaal 10 μL IONPs-suspensie (20 mg / ml in fosfaat-gebufferde zoutoplossing) in het midden van de schildklier te injecteren. Druk de injectieplaats voorzichtig aan met gaas gedurende 5 s.

13. Identificatie van de PG na ionps-injectie

  1. Observeer na injectie de snelle diffusie van de IONP's in de schildklieren, maar niet de PG, omdat het de PG negatief kleurt en onderscheidt van de omliggende schildklier.
  2. Maak een voorfoto van de negatief gekleurde PG samen met de luchtpijp, schildklier en strottenhoofd.
  3. Maak links- en rechtsfoto's van de negatief gekleurde PG met dezelfde procedures als hierboven vermeld.

14. Resectie van de keel en luchtpijp met de schildklier en PG

  1. Zodra de ratten overtollig isofluraan (5% isofluraan gedurende meer dan 5 minuten) hebben ingeademd en onder diepe anesthesie zijn, euthanaseert u ze door intracardiale injectie van 0,5 ml verzadigde kaliumchlorideoplossing.
  2. Postmortaal, verwijder de keel, luchtpijp, schildklier en PG.
  3. Plaats onder een zuurkast de verwijderde keel-, luchtpijp-, schildklier- en PG-monsters gedurende 24 uur in 4% paraformaldehyde-oplossing.

15. Histopathologie studies

  1. Droog de weefsels uit en integreer ze in paraffine. Snijd in 5 μm dikke stukken. Bak de secties op 37 °C in een oven een nacht en op 65 °C gedurende 1 uur.
  2. Bevlek de secties met hematoxyline en eosine (H &E) na het wassen 3 x 5 min met 75%, 95%, 100% gradiëntalcohol en water wassen op kamertemperatuur.
  3. Laat pathologen de H &E-gekleurde secties onderzoeken onder een lichtmicroscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit diermodel hebben we de nek van een SD-rat chirurgisch ingesneden om de luchtpijp, het strottenhoofd en de omliggende weefsels bloot te leggen. Vervolgens bevond de schildklier zich visueel aan beide zijden van de luchtpijp; het is vlindervormig en ongeveer 3 mm x 5 mm groot. Een paar PG bevinden zich meestal in het bovenste deel van de schildklier en hun kleur lijkt erg op die van de schildklierkwabben, waardoor het uiterst moeilijk is om ze met het blote oog te onderscheiden (figuur 1

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We demonstreren een IONPs-geleide negatieve beeldvormingstechniek van rat PG met behulp van zwarte IONPs, die lokaal in het midden van de schildklier werden geïnjecteerd en diffuus in de schildklier werden verspreid, maar niet in de PG. Het maakt een duidelijke identificatie van de PG met het blote oog mogelijk zonder de hulp van een microscoop. Hoewel transgene muizen met groen fluorescerend eiwit selectief tot expressie gebracht in de PG zijn gemeld13, is het model dat in dit artikel wordt besch...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P.G. en W.Z. zijn mede-uitvinders van een patentaanvraag ingediend door het Cancer Hospital van de University of Chinese Academy of Sciences (Zhejiang Cancer Hospital) op basis van het project. De andere auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (NSFC) (82172598), de Natural Science Foundation van de provincie Zhejiang, China (LZ22H310001), het 551 Health Talent Training Project van de Gezondheidscommissie van de provincie Zhejiang, China, en het Medical and Health Science and Technology Project van de provincie Zhejiang, China (2021KY110).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
alcoholLi feng9400820067
anesthesia machineRWD CompanyR520IEMachine number
bladeDaopianTB-JZ-10#
cylindrical pillowgemaakt door onszelf
depilatory creamNairTMG-001
electronic scaleHong xingdaCN-HXD2
eosinThermo Fisher (Waltham, USA).C0105S-2
erythromycinShuang ji (Beijing, China)200409
gauzeFulannsYY0331-2006
heating padJohon (ShenZhen,China)JH-36-2006
hematoxylinThermo Fisher (Waltham, USA).C0105S-1
insulin injection needleJiangyin NanquanMacromolecule20170702
iodophor cotton ballHOYON19-6007
iron oxide nanoparticle solutionZhongke Leiming Technology (Beijing, China)Mag9110-05
isofluraneSigma Aldrich (St Louis USA).21112801
needle holderMeijunMH0587
operation tableBioJaneBJ-P-M
paraformaldehyde solutionBiosharp21269333
rubberG-CLONE
XT41050
scanning machineOlympusSlideview VS200
surgical forcepsSupingSPHC-0676
surgical knife handleAladdinS3052-06-1EA
surgical retractorTOCYTO18-4010
surgical scissorsSupingSPHC-0795
surgical towelAlong technologyYCKJ-RJ-036205
sutureEthiconSA84G
suture with needleJinhuan (Shanghai,China)F301
vascular forcepsAlong technologyYCKJ-RJ-016218
Water Bath-Slide DrierHua su (Jinhua, China)HS-1145

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cope, O., Donaldson, G. A. Relation of thyroid and parathyroid glands to calcium and phosphorus metabolism. Study of a case with coexistent hypoparathyroidism and hyperthyroidism. The Journal of Clinical Investigation. 16 (3), 329-341 (1937).
  2. Mansberger, A. R., Wei, J. P. Surgical embryology and anatomy of the thyroid and parathyroid glands. Surgical Clinics of North America. 73 (4), 727-746 (1993).
  3. Koch, A., Hofbeck, M., Dorr, H. G., Singer, H. Hypocalcemia-induced heart failure as the initial symptom of hypoparathyroidism. Zeitschrift für Kardiologie. 88 (1), 10-13 (1999).
  4. Shoback, D. M., et al. Presentation of hypoparathyroidism: etiologies and clinical features. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (6), 2300-2312 (2016).
  5. Arneiro, A. J., et al. Self-report of psychological symptoms in hypoparathyroidism patients on conventional therapy. Archives of Endocrinology Metabolism. 62 (3), 319-324 (2018).
  6. Olson, E., Wintheiser, G., Wolfe, K. M., Droessler, J., Silberstein, P. T. Epidemiology of thyroid cancer: a review of the national cancer database, 2000-2013. Cureus. 11 (2), 4127(2019).
  7. Du, L., et al. Epidemiology of thyroid cancer: incidence and mortality in China, 2015. Frontiers in Oncology. 10, 1702(2020).
  8. Barrios, L., et al. Incidental parathyroidectomy in thyroidectomy and central neck dissection. Surgery. 169 (5), 1145-1151 (2021).
  9. Sitges-Serra, A., et al. Inadvertent parathyroidectomy during total thyroidectomy and central neck dissection for papillary thyroid carcinoma. Surgery. 161 (3), 712-719 (2017).
  10. Sakorafas, G. H., et al. Incidental parathyroidectomy during thyroid surgery: an underappreciated complication of thyroidectomy. World Journal of Surgery. 29 (12), 1539-1543 (2005).
  11. Sahyouni, G., et al. Rate of incidental parathyroidectomy in a pediatric population. OTO Open. 5 (4), (2021).
  12. Erickson, A. K., et al. Incidence, survival time, and surgical treatment of parathyroid carcinomas in dogs: 100 cases (2010-2019). Journal of the American Veterinary Medical Association. 259 (11), 1309-1317 (2021).
  13. Bi, R., Fan, Y., Luo, E., Yuan, Q., Mannstadt, M. Two techniques to create hypoparathyroid mice: parathyroidectomy using GFP glands and diphtheria-toxin-mediated parathyroid ablation. Journal of Visualized Experiments. (121), e55010(2017).
  14. Soulsby, S. N., Holland, M., Hudson, J. A., Behrend, E. N. Ultrasonographic evaluation of adrenal gland size compared to body weight in normal dogs. Veterinary Radiology & Ultrasound. 56 (3), 317-326 (2015).
  15. Zheng, W. H., et al. Biodegradable iron oxide nanoparticles for intraoperative parathyroid gland imaging in thyroidectomy. PNAS Nexus. 1 (3), 087(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

SchildklierchirurgiePG identificatieijzeroxide nanodeeltjescontrastmiddelschildkliernegatieve kleuringautofluorescentie imagingpreklinisch onderzoek

Gerelateerde artikelen