Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beoordeling van intestinale transcytose van neonatale Escherichia coli bacteriëmie-isolaten

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64241

⸱

17 februari 2023

 ,  , 
1University of Missouri-Kansas City School of Medicine, 2Pediatric Infectious Diseases, Children’s Mercy Kansas City

In dit artikel

Samenvatting

Escherichia coli veroorzaakt sepsis bij pasgeborenen die de bacteriën rond het moment van geboorte binnenkrijgen. Het proces dat betrokken is bij het vermogen van E. coli om van het enterische kanaal naar de bloedbaan te reizen, is slecht begrepen. Dit in vitro model beoordeelt het vermogen van E. coli stammen om door de darmepitheelcellen te reizen.

Samenvatting

Pasgeborenen krijgen maternale E. coli-stammen binnen die hun darmkanaal koloniseren rond het moment van de bevalling. E. coli-stammen met het vermogen om over de darm te transloceren, dringen de bloedbaan van de pasgeborene binnen en veroorzaken levensbedreigende bacteriëmie. De hier gepresenteerde methodologie maakt gebruik van gepolariseerde intestinale epitheelcellen gekweekt op semipermeabele inserts om de transcytose van neonatale E. coli-bacteriëmie-isolaten in vitro te beoordelen. Deze methode maakt gebruik van de gevestigde T84 intestinale cellijn die het vermogen heeft om te groeien tot samenvloeiing en tight junctions en desmosomen te vormen. Na het bereiken van confluence ontwikkelen volwassen T84-monolagen transepitheliale weerstand (TEER), die kan worden gekwantificeerd met behulp van een voltmeter. De TEER-waarden zijn omgekeerd gecorreleerd met de paracellulaire permeabiliteit van extracellulaire componenten, waaronder bacteriën, in de intestinale monolaag. De transcellulaire passage van bacteriën (transcytose) daarentegen verandert niet noodzakelijkerwijs de TEER-metingen. In dit model wordt de bacteriële passage door de intestinale monolaag gekwantificeerd voor maximaal 6 uur na infectie en worden herhaalde metingen van TEER uitgevoerd om de paracellulaire permeabiliteit te controleren. Bovendien vergemakkelijkt deze methode het gebruik van technieken zoals immunostaining om de structurele veranderingen in tight junctions en andere cel-naar-cel adhesie-eiwitten tijdens bacteriële transcytose over het gepolariseerde epitheel te bestuderen. Het gebruik van dit model draagt bij aan de karakterisering van de mechanismen waarmee neonatale E. coli transcytose over het darmepitheel bacteriëmie produceert.

Inleiding

Escherichia coli is de meest voorkomende oorzaak van sepsis met vroege aanvang bij pasgeborenen 1,2,3. Het sterftecijfer van neonatale E. coli-bacteriëmie kan 40% bereiken en meningitis is een mogelijke complicatie die gepaard gaat met ernstige neurologische ontwikkelingsstoornissen2. De inname van maternale E. coli-stammen door de pasgeborene kan neonatale bacteriëmie veroorzaken; dit proces is gerepliceerd in diermodellen 2,4. Eenmaal ingenomen, reizen pathogene bacteriën vanuit het neonatale darmlumen over de darmbarrière en komen in de bloedbaan terecht, waardoor bloedvergiftiging ontstaat. Neonatale invasieve E. coli-stammen die bacteriëmie produceren, variëren in hun vermogen om darmepitheelcellen binnen te dringen 1,5. Hun vermogen om het darmepitheel na een invasie te transcytose is echter niet volledig gekarakteriseerd.

Dit intestinale transcytosemodel is een nuttige in vitro methode om bacteriële passage over het darmepitheel na te bootsen. Het algemene doel van de methoden die in dit manuscript worden gepresenteerd, is om het vermogen van neonatale E. coli-isolaten te vergelijken met transcytose van het darmepitheel. Het hier beschreven model maakt gebruik van T84-cellen, die vereeuwigde menselijke intestinale adenocarcinoomcellen zijn 6,7. T84-cellen worden gekweekt tot samenvloeiing op een semipermeabel membraan met twee afzonderlijke compartimenten. De reden voor het gebruik van deze techniek is dat, zoals in vivo gebeurt, deze darmcellen polariseren en volwassen tight junctions ontwikkelen 6,8. De kant die in contact komt met het membraan wordt de basale kant. De andere kant van de cellen wordt de apicale kant, die lijkt op het darmlumen waar ingenomen pathogenen zich hechten en binnendringen. Het transwellmembraan is doorlaatbaar voor bacteriën, maar de gepolariseerde darmcellen vormen tight junctions, die bacteriële paracellulaire bewegingen aantasten9. Deze methode biedt dus het voordeel van een gecontroleerde in vitro omgeving met behulp van een menselijke cellijn om het proces van bacteriële transcytose te bestuderen, inclusief de transcellulaire route. Terwijl er andere methoden bestaan om de transcytose van bacteriën in het darmepitheel te onderzoeken, biedt de hier gepresenteerde transwell-methode meer gemak en toegankelijkheid. Alternatieve technieken, zoals die met behulp van ex vivo monsters die zijn opgezet in Ussing-kamersystemen, zijn beschikbaar. Ze gebruiken echter weefselspecimens die mogelijk niet gemakkelijk toegankelijk zijn, vooral als het onderzoek van plan is de menselijke fysiologie tebestuderen 10. Intestinale organoïden zijn een ander voorbeeld van een in vitro alternatief voor het bestuderen van gastheer-bacterie interacties11. Hoewel organoïde monolagen ook in het transwell-systeem kunnen worden gebruikt om bacteriële transcytose te bestuderen, vereisen ze de isolatie en groei van stamcellen en het gebruik van specifieke groeifactoren om differentiatie te induceren12. Het gebruik ervan is dus tijdrovender en gaat gepaard met hogere kosten in vergelijking met de transwell-methode die in dit manuscript wordt beschreven.

De beoordeling van bacteriële passage door het darmepitheel met behulp van dit in vitro transwell-systeem is met succes uitgevoerd voor verschillende pathogenen. Deze studies hebben het nut aangetoond van het transwell-systeem dat T84-cellen gebruikt om de transcytose van bacteriën over het gepolariseerde darmepitheel te karakteriseren 13,14,15. De toepassing van deze transwellmethode om het transcytosevermogen van bacteriëmieproducerende neonatale E. coli-stammen te vergelijken, is echter niet in detail beschreven. Dit manuscript biedt andere onderzoekers een standaard transwell-protocol dat betrouwbaar en gemakkelijk te gebruiken is en geen te dure middelen vereist.

Om het vermogen van neonatale invasieve E. coli-stammen om het darmepitheel te transcytose te vergelijken, kan de apicale kant van de intestinale epitheliale monolaag worden geïnfecteerd met een bekend aantal bacteriële cellen. Na incubatie kan het medium aan de basale kant van het epitheel worden verzameld en de bacteriën worden gekwantificeerd om de hoeveelheid bacteriële transcytose in de loop van de tijd te bepalen. In dit manuscript worden de gepresenteerde methoden gebruikt om het transcytosevermogen van neonatale E. coli klinische stammen te bestuderen die zijn hersteld van pasgeborenen die in het ziekenhuis zijn opgenomen met bacteriëmie. De inclusiecriteria voor de selectie van deze neonatale klinische isolaten voor transcytosestudies zijn eerder gepubliceerd 1,2,16. Wanneer deze methode wordt uitgevoerd met behulp van verschillende E. coli-stammen, kunnen hun transcytosecapaciteiten worden vergeleken. Door dit proces biedt het intestinale transcytosemodel waardevolle gegevens om de virulentiefactoren van E. coli te karakteriseren die bijdragen aan het meerstappenproces dat culmineert in de ontwikkeling van neonatale bacteriëmie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Voer alle manipulaties van de T84-cellen, bacteriën, platen en reagentia uit in een bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) veiligheidskast om besmetting te voorkomen. Gebruik aparte ruimtes en incubators voor al het werk met steriele T84-cellen, geïnfecteerde T84-cellen en E. coli. De klinische E. coli-isolaten die zijn getest met de hier beschreven methoden zijn verkregen volgens de richtlijnen van de Institutional Review Board in onze instelling 1,16.

1. Transcytose-inserts voorbereiden met T84-cellen (ongeveer 1-2 weken vóór het experiment)

  1. Kweek American Type Culture Collection (ATCC) T84-cellen in weefselkweekmedium (TCM + antibiotica) bestaande uit Dulbecco's Modified Eagle Medium: Ham's F-12 voedingsmengsel (1: 1, eindconcentratie: 50% elk), 5% foetaal runderserum en 1% (100 U / ml) penicilline / streptomycine dubbel antibioticummengsel. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2.
    OPMERKING: Een variatie van deze mediumformulering zonder penicilline/streptomycine (TCM zonder antibiotica) wordt gebruikt voor de latere stappen (rubriek 2 en verder) in de procedure. Zorg ervoor dat voor elke stap de juiste formulering wordt gebruikt.
  2. Werkend in een bioveiligheidskast (BSC), zaai de T84-cellen in polyethyleentereftalaatmembraancelkweektranswell-inserts met poriën van 3 μm gemaakt voor 24-wellplaten. Inclusief transwell insert replicaties voor elke gewenste experimentele conditie plus niet-geïnfecteerde controles om te controleren op mogelijke besmetting.
    1. In een 24-well plaat ontworpen om transwell inserts te houden, vult u het gewenste aantal verzamelputten met 1 ml TCM + antibiotica.
    2. Plaats in elke put een transwell-inzetstuk.
    3. Zaai deze inserts met 1 x 105 T84 cellen gesuspendeerd in 500 μL TCM + antibiotica. Kwantificeer het aantal cellen met behulp van een hemocytometer met trypan blauwe kleuring of een geautomatiseerde celteller17.
    4. Incubeer de transwellplaten met gezaaide inserts in dezelfde omstandigheden waarin de cellen werden gekweekt.
    5. Controleer met lichtmicroscopie of de monolagen confluent zijn geworden na het zaaien van de insert, ongeveer 48 uur na het zaaien.
  3. Meet en registreer elke 2 dagen na het zaaien de transepitheliale elektrische weerstand (TEER) met behulp van een epitheliale volt / ohm-meter (EVOM) om de volwassenheid van de monolaag te beoordelen. Zodra de inserts een TEER van ten minste 1.000 Ω·cm2 bereiken, worden ze klaar geacht voor de test18.
    OPMERKING: De inserts hebben meestal 7-10 dagen nodig om deze TEER na het zaaien te bereiken. De T84-cellen zullen 100% samenvloeiing vertonen onder lichtmicroscopie zodra deze weerstand is bereikt.
    1. Bewaar de EVOM-sonde met de elektroden ondergedompeld in 0,15 M KCl wanneer deze niet in gebruik is.
    2. Voordat u de TEER meet, ontsmet u de elektrodesonde door deze gedurende 10-15 minuten onder te dompelen in 5 ml 70% ethanol in een conische buis van 50 ml. Verwijder de sonde, schud de overtollige ethanol af en laat deze gedurende 10 minuten aan de lucht drogen in de BSC. Houd de buis ethanol vast.
    3. Test de EVOM en sonde door de droge ontsmette sonde in een steriele put met 1 ml TCM + antibiotica te plaatsen met een steriele insert erin met 500 μL TCM + antibiotica. Zorg ervoor dat de EVOM-waarde <200 Ω is. Noteer deze lege waarde om deze te gebruiken in de latere weerstandsberekeningen die in stap 1.3.6 worden beschreven.
    4. Verwijder de sonde uit de tube TCM + antibiotica. Houd deze buis vast voor de opslag van de sonde gedurende het hele experiment.
    5. Laat de sonde voorzichtig in het eerste inzetstuk zakken met de lange elektrode in de opvangput en de korte elektrode in het inzetstuk. Laat de lange elektrode de bodem van de verzamelput raken, maar duw niet naar beneden omdat dit de epitheliale monolaag kan verstoren.
    6. Herhaal dit proces om de weerstand in Ohm (Ω) voor elke insert te meten en vast te leggen. Als u klaar bent, ontsmet u de sonde in de ethanol door deze nog eens 10-15 minuten onder te dompelen. Verplaats vervolgens de ontsmette sonde terug naar de KCl-oplossing voor opslag. Trek de in stap 1.3.3 verkregen blancoweerstand af van elke waarde die wordt verkregen uit elke insert die T84-cellen bevat. Vermenigvuldig de resulterende weerstand (Ω) voor elke wisselplaat met het oppervlak van de bodem van elke wisselplaat (cm2) om de uiteindelijke TEER-meting (Ω·cm2) te verkrijgen.
    7. Zodra de TEER ten minste 1.000 Ω·cm2 bereikt, is de epitheliale monolaag volwassen en klaar voor infectietests.
  4. Naarmate de TEER rijpt, voorzie de cellen elke 1-2 dagen van vers medium.
    1. Voeg in een nieuwe plaat met 24 putten 1 ml TCM + antibiotica toe aan één putje voor elke gezaaide insert die wordt bereid.
    2. Breng met behulp van een steriele tang de inserts voorzichtig over naar de nieuw aangevulde putten.
    3. Vervang de media in de inserts.
      1. Verwijder de oude media van de inzetstukken door de plaat te kantelen en gebruik een interne vacuümaspirator om de media voorzichtig te verwijderen met een pipetpunt langs de zijkant van het inzetstuk. De aspirator maakt de regulatie van low-level zuigkracht mogelijk om de verstoring van de cellen te voorkomen. Laat de pipetpunt de onderkant van de insert niet raken, omdat dit de zich ontwikkelende epitheliale monolaag zal verstoren.
      2. Voeg 500 μL TCM + antibiotica toe aan de bijsluiters. Visualiseer de monolaag met lichtmicroscopie om te controleren of deze intact blijft.
    4. Meet elke 1-2 dagen de TEER over elke insert zoals hierboven beschreven in de stappen 1.3.2-1.3.6.

2. Voorbereiding van de T84-cellen 1 dag voor het experiment met TCM zonder antibiotica

  1. Meet en noteer de TEER de dag voor het experiment.
  2. Vervang de TCM op dezelfde manier als tijdens de eerdere celvoorbereiding en -onderhoud. In plaats daarvan wordt echter TCM zonder antibiotica gebruikt ter voorbereiding op de infectie (1 ml in de plaatput en 500 μL in de insert).

3. E. coli-culturen (gestart 1 dag voor het experiment)

LET OP: Gebruik voorzorgsmaatregelen voor bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) bij het werken met pathogene klinische E. coli-stammen .

  1. Neem een gelabelde conische buis van 15 ml met 5 ml steriele lysogene bouillon (LB) en gebruik een steriele lus om de bouillon te enten met één kolonie van één bacteriestam (E. coli). Herhaal dit proces en maak één nachtkweekbuis voor elke te testen soort.
  2. Incubeer de nachtcultuur, met de doppen van de buizen losgemaakt, in een incubator shaker (250 rpm, 37 °C).

4. Bereiding van het E. coli-entmateriaal, epitheelcellen en materialen (op de ochtend van het experiment)

OPMERKING: Gebruik vanaf dit punt TCM zonder antibiotica die zijn opgewarmd tot 37 °C.

  1. Voeg 250 μL uit elke nachtelijke LB-cultuur toe aan 25 ml TCM zonder antibiotica in een conische buis van 50 ml (één per individuele stam). Houd de doppen van de buizen los. Plaats deze nieuwe kweekbuizen in de shaker op dezelfde stand (250 rpm, 37 °C) gedurende precies 2 uur. Voer de resterende substappen uit tijdens het wachten.
  2. Meet de TEER over elke insert, zoals beschreven in stap 1.3.2-1.3.6. Noteer deze als de TEERRs op tijdstip (t) = 0 uur.
  3. Verplaats de inzetstukken naar putten in een nieuwe plaat en verander de media met behulp van de techniek die wordt beschreven in stap 1.4.3. Vul deze keer echter de nieuwe verzamelputten met 500 μL TCM zonder antibiotica en vul de inserts met 400 μL TCM zonder antibiotica. Bewaar de inserts in de weefselkweekincubator tot het moment van infectie.
  4. Zet een voldoende aantal vierkante LB-agarplaten uit om op te warmen tot kamertemperatuur (RT) voor latere beplating en bacteriële kwantificering.

5. Inenting van de cellen (start van het experiment)

  1. Verwijder na precies 2 uur de ochtendbacterieculturen uit de shaker en centrifugeer ze gedurende 10 minuten (1.900 x g, 4 °C).
    OPMERKING: Houd voor alle volgende stappen alle bacteriële suspensies op ijs om de groei te minimaliseren.
  2. Resuspend de bacterie pellet in TCM zonder antibiotica. Gebruik een spectrofotometer om de optische dichtheid (OD) aan te passen aan 0,7-0,9 en verdun verder met TCM zonder antibiotica tot een concentratie van 1 x 106 kolonievormende eenheden (CFU) / ml (ongeveer 1:100 verdunning). Gebruik deze bacteriële suspensie om elke insert te infecteren met 1 x 105 CFU per 100 μL volume.
  3. Label de transwellplaat en infecteer elke insert met 100 μL van het OD-aangepaste entmateriaal (totaal 1 x 105 CFU per insert). De test is nu begonnen. Noteer de tijd en noteer deze als t = 0 uur.
  4. Plaats de entbacteriële suspensie om de CFU/ml te kwantificeren met behulp van de spoorverdunningsmethode, waarbij 10 μL aliquots op vierkante LB-agarplaten19 worden geplateerd.

6. Transcytose kwantificeren

  1. Vul elke 30 minuten na inenting nieuwe putten met 500 μL TCM zonder antibiotica. Breng de inserts over naar deze nieuwe putten met behulp van een andere set steriele tangen voor elke verschillende bacteriestam.
  2. Verzamel de media van de gebruikte verzamelput voor elk inzetstuk in afzonderlijke gelabelde buizen. Plaats deze buisjes op ijs. Breng de transwellplaten tussen de tijdstippen terug naar de incubator.
  3. Combineer voor elke insert de verzamelde media van t = 0,5 h, t = 1 h, t = 1,5 h en t = 2 h, en vortex kort. Plaats de verzamelde media op LB-agarplaten met behulp van de trackverdunningsmethode om de hoeveelheid bacteriën te kwantificeren die in de eerste 2 uur van het experiment zijn getranscytoseerd.
    OPMERKING: Door de bacteriën elke 30 minuten op te halen en op ijs te houden, zorgt u ervoor dat de bacteriegroei in de verzamelputten wordt geminimaliseerd en dat er metingen worden gedaan aan overwegend getranscytoseerde bacteriën.
  4. Plaats de gelabelde trackverdunning LB agarplaten in de bacteriële incubator bij 37 °C zonder aanvullende CO2 en breng de T84 transwellplaat terug naar de weefselkweekincubator.
  5. Herhaal bij t = 4 uur stap 6,3 door de verzamelde media te combineren van t = 2,5 uur, t = 3 uur, t = 3,5 uur en t = 4 uur.
  6. Herhaal bij t = 6 uur stap 6,3 door de verzamelde media van t = 4,5 uur, t = 5 uur, t = 5,5 uur en t = 6 uur te combineren. Bovendien, bij t = 6 h, plaat de media uit de controleputten.

7. Einde van het experiment

  1. Meet en noteer de TEER aan het einde van het experiment, t = 6 uur. Gebruik de procedure die wordt beschreven in stap 1.3.2-1.3.6.
  2. Ontsmet de sonde door deze gedurende 10-15 minuten onder te dompelen in 70% ethanol. Gooi de inserts weg of bewaar/verwerk ze desgewenst voor extra toepassingen. Laat de LB-agarplaten een nacht incuberen en desinfecteer en/of gooi alle andere gebruikte materialen veilig weg.
  3. Tel na nachtelijke incubatie de bacteriekolonies handmatig op de verdunnings-LB-platen om de hoeveelheid entmateriaal en de hoeveelheid E. coli-transcytose te bepalen. Zorg ervoor dat de controleplaten geen bacteriegroei vertonen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

figure-results-1
Figuur 1: T84 TEER in de loop van de tijd. Naarmate de T84-cellaag op het inzetstuk rijpt, neemt de elektrische weerstand van de monolaag toe. Bij een TEER van ten minste 1.000 Ω·cm2 is de cellaag voldoende ontwikkeld om het paracellulaire bacteriële transport te verminderen en de meting van voornamelijk transcellulaire bacteriële doorvoe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze methode is afgeleid van technieken die worden gebruikt in gastro-enterologie en infectieziekten20. In vitro modellen van de intestinale epitheliale barrière zijn gebruikt om de mechanismen op te helderen waarmee de luminale inhoud interageert met deze relevante component van aangeboren immuniteit 6,8. De gastheer-pathogeen interacties van invasieve neonatale E. coli zijn ook afzonderlijk gekarakteriseerd door genetis...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door een Sarah Morrison-studiebeurs uitgegeven door de University of Missouri-Kansas City School of Medicine aan A.I.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin MixtuurFisher Scientific15-140-122
15 mL steriele conische buizenMidSciC15B
2 mL microcentrifugebuizenAvantAVSS2000
50 mL steriele polypropyleen conische buizenFalcon352070
AspiratorCorning4930
BioveiligheidskastenLabconco30441010028343Drie hiervan worden gebruikt in de methode: een voor steriele weefselwerkzaamheden, een voor besmet weefselwerk en een voor bacteriële werkzaamheden.
CentrifugeSorvallLegend RT
Wegwerp inoculatielussenFisherbrand22363605
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11965-084
Epitheliaal Volt/Ohm MeterWorld Precision InstrumentsEVOM2
Foetaal RundserumFisher Scientific10437028
Ham's F-12 NutriëntenmengselGibco11765-047
HemacytometerSigma Aldrich, Bright LineZ359629
Incubator shakerNew BrunswickInnova 4080
IncubatorsThermo Scientific51030284Drie hiervan worden gebruikt in de methode: een voor steriele weefselkweek, een voor besmette weefselkweek en een voor bacteriële incubatie.
LysogenicumbrothDifco244610
Lysogenicumbroth agarIBI ScientificIB49101
Nikon Eclipse TS2R MicroscoopNikon
SpectrofotometerUnico1100RS
T84 DarmcellenAmerican Tissue Culture CollectionCCL248
Weefselkweek inzetstukken, met polyethyleentereftalaatmembraan, 3µm poriën, 24 wel formatFalcon353096
Weefselkweekplaat, 24 wellsFalcon353504
Trypanblauw kleurstofFisher ScientificT10282

Referenties

  1. Shakir, S. M., Goldbeck, J. M., Robison, D., Eckerd, A. M., Chavez-Bueno, S. Genotypic and phenotypic characterization of invasive neonatal Escherichia coli clinical isolates. American Journal of Perinatology. 31 (11), 975-982 (2014).
  2. Cole, B. K., et al. Route of infection alters virulence of neonatal septicemia Escherichia coli clinical isolates. PloS One. 12 (12), 0189032(2017).
  3. Stoll, B. J., et al. Early-onset neonatal sepsis 2015 to 2017, the rise of Escherichia coli, and the need for novel prevention strategies. Journal of the American Medical Association Pediatrics. 174 (7), 200593(2020).
  4. Dalgakiran, F., Witcomb, L. A., McCarthy, A. J., Birchenough, G. M., Taylor, P. W. Non-invasive model of neuropathogenic Escherichia coli infection in the neonatal rat. Journal of Visualized Experiments. (92), e52018(2014).
  5. Williams, M., et al. Whole-genome sequencing-based phylogeny, antibiotic resistance, and invasive phenotype of Escherichia coli strains colonizing the cervix of women in preterm labor. BMC Microbiology. 21 (1), 330(2021).
  6. Schoultz, I., Keita, Å The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909(2020).
  7. Devriese, S., et al. T84 monolayers are superior to Caco-2 as a model system of colonocytes. Histochemistry and Cell Biology. 148 (1), 85-93 (2017).
  8. Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), 029314(2018).
  9. Awad, W. A., Hess, C., Hess, M. Enteric pathogens and their toxin-induced disruption of the intestinal barrier through alteration of tight junctions in chickens. Toxins. 9 (2), 60(2017).
  10. Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: A fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
  11. Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology - A review of methods. Experimental and Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
  12. Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiology Spectrum. 9 (1), 0000321(2021).
  13. Gavin, H. E., Beubier, N. T., Satchell, K. J. The effector domain region of the Vibrio vulnificus MARTX toxin confers biphasic epithelial barrier disruption and is essential for systemic spread from the intestine. PLoS Pathogens. 13 (1), 1006119(2017).
  14. Kobayashi, H., et al. Aeromonas sobria serine protease decreases epithelial barrier function in T84 cells and accelerates bacterial translocation across the T84 monolayer in vitro. PloS One. 14 (8), 0221344(2019).
  15. Kalischuk, L. D., Inglis, G. D., Buret, A. G. Campylobacter jejuni induces transcellular translocation of commensal bacteria via lipid rafts. Gut Pathogens. 1 (1), 2(2009).
  16. Cole, B. K., Ilikj, M., McCloskey, C. B., Chavez-Bueno, S. Antibiotic resistance and molecular characterization of bacteremia Escherichia coli isolates from newborns in the United States. PloS One. 14 (7), 0219352(2019).
  17. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
  18. den Hartog, G., et al. Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 restricts the internalization of bacteria into human intestinal epithelial cells through the inhibition of Rac1. Frontiers in Immunology. 11, 553994(2020).
  19. Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
  20. Lievin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: Lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (3), 380-439 (2013).
  21. Kaczmarek, A., Budzynska, A., Gospodarek, E. Detection of K1 antigen of Escherichia coli rods isolated from pregnant women and neonates. Folia Microbiologica. 59 (5), 419-422 (2014).
  22. Kalita, A., Hu, J., Torres, A. G. Recent advances in adherence and invasion of pathogenic Escherichia coli. Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (5), 459-464 (2014).
  23. McCool, D. J., Marcon, M. A., Forstner, J. F., Forstner, G. G. The T84 human colonic adenocarcinoma cell line produces mucin in culture and releases it in response to various secretagogues. Biochemical Journal. 267 (2), 491-500 (1990).
  24. Resta-Lenert, S., Barrett, K. E. Enteroinvasive bacteria alter barrier and transport properties of human intestinal epithelium: Role of iNOS and COX-2. Gastroenterology. 122 (4), 1070-1087 (2002).
  25. Elatrech, I., et al. Escherichia coli LF82 differentially regulates ROS production and mucin expression in intestinal epithelial T84 cells: Implication of NOX1. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (5), 1018-1026 (2015).
  26. El-Aouar Filho, R. A., et al. Heterogeneous family of cyclomodulins: Smart weapons that allow bacteria to hijack the eukaryotic cell cycle and promote infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 208(2017).
  27. Hopkins, A. M., Walsh, S. V., Verkade, P., Boquet, P., Nusrat, A. Constitutive activation of Rho proteins by CNF-1 influences tight junction structure and epithelial barrier function. Journal of Cell Science. 116, 725-742 (2003).
  28. Shiou, S. R., et al. Erythropoietin protects intestinal epithelial barrier function and lowers the incidence of experimental neonatal necrotizing enterocolitis. Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12123-12132 (2011).
  29. Newburg, D. S., Ko, J. S., Leone, S., Nanthakumar, N. N. Human milk oligosaccharides and synthetic galactosyloligosaccharides contain 3’-, 4-, and 6'-galactosyllactose and attenuate inflammation in human T84, NCM-460, and H4 cells and intestinal tissue ex vivo. Journal of Nutrition. 146 (2), 358-367 (2016).
  30. Burns, J. L., Griffith, A., Barry, J. J., Jonas, M., Chi, E. Y. Transcytosis of gastrointestinal epithelial cells by Escherichia coli K1. Pediatric Research. 49 (1), 30-37 (2001).
  31. Raut, B., Chen, L. J., Hori, T., Kaji, H. An open-source add-on EVOM((R)) device for real-time transepithelial/endothelial electrical resistance measurements in multiple transwell samples. Micromachines. 12 (3), 282(2021).
  32. McCarthy, A. J., Stabler, R. A., Taylor, P. W. Genome-wide identification by transposon insertion sequencing of Escherichia coli K1 genes essential for in vitro growth, gastrointestinal colonizing capacity, and survival in serum. Journal of Bacteriology. 200 (7), 00698(2018).
  33. Sayoc-Becerra, A., et al. The JAK-inhibitor tofacitinib rescues human intestinal epithelial cells and colonoids from cytokine-induced barrier dysfunction. Inflammatory Bowel Diseases. 26 (3), 407-422 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Neonatale E. ColiGepolariseerde EpitheelcellenT84-cellijnTransepitheliale WeerstandTEER-metingTranswell-insertsBacteriële TranslocatieTight JunctionsParacellulaire Permeabiliteit
Beoordeling van intestinale transcytose van neonatale Escherichia coli bacteriëmie-isolaten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.