Methodenartikel

ATAC-Seq Optimalisatie voor Kanker Epigenetica Onderzoek

DOI:

10.3791/64242

⸱

30 juni 2022

 ,  ,  ,  , 
1University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, 2Dana-Farber Cancer Institute

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATAC-seq is een DNA-sequencingmethode die de hyperactieve mutant transposase, Tn5, gebruikt om veranderingen in chromatinetoegankelijkheid in kaart te brengen, gemedieerd door transcriptiefactoren. ATAC-seq maakt de ontdekking mogelijk van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan fenotypische veranderingen in kankercellen. Dit protocol schetst optimalisatieprocedures voor ATAC-seq in epitheelceltypen, waaronder kankercellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De test voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing (ATAC-seq) onderzoekt de toegankelijkheid van desoxyribonucleïnezuur (DNA) met behulp van het hyperactieve Tn5-transposase. Tn5 snijdt en ligeert adapters voor high-throughput sequencing binnen toegankelijke chromatinegebieden. In eukaryote cellen is genomisch DNA verpakt in chromatine, een complex van DNA, histonen en andere eiwitten, dat fungeert als een fysieke barrière voor de transcriptionele machinerie. Als reactie op extrinsieke signalen rekruteren transcriptiefactoren chromatineremodelleringscomplexen om toegang tot de transcriptionele machinerie mogelijk te maken voor genactivering. Daarom is het identificeren van open chromatinegebieden nuttig bij het monitoren van versterker- en genpromotoractiviteiten tijdens biologische gebeurtenissen zoals kankerprogressie. Omdat dit protocol gemakkelijk te gebruiken is en een lage celinvoervereiste heeft, is ATAC-seq op grote schaal gebruikt om open chromatinegebieden in verschillende celtypen, waaronder kankercellen, te definiëren. Voor succesvolle data-acquisitie moeten verschillende parameters worden overwogen bij het voorbereiden van ATAC-seq-bibliotheken. Onder hen zijn de keuze van de cellysebuffer, de titratie van het Tn5-enzym en het startvolume van cellen cruciaal voor de atac-seq-bibliotheekvoorbereiding in kankercellen. Optimalisatie is essentieel voor het genereren van hoogwaardige gegevens. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van de ATAC-seq-optimalisatiemethoden voor epitheelceltypen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chromatine toegankelijkheid is een belangrijke vereiste voor de regulatie van genexpressie op een genoombrede schaal1. Veranderingen in de toegankelijkheid van chromatine worden vaak geassocieerd met verschillende ziektetoestanden, waaronder kanker 2,3,4. In de loop der jaren zijn tal van technieken ontwikkeld om onderzoekers in staat te stellen het chromatinelandschap te onderzoeken door gebieden van chromatinetoegankelijkheid in kaart te brengen. Sommigen van hen omvatten DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements)6, MAPit (methyltransferase accessibility protocol for individual templates)7, en de focus van dit artikel, ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin)8. DNase-seq brengt toegankelijke gebieden in kaart door gebruik te maken van een belangrijk kenmerk van DNase, namelijk de preferentiële vertering van naakt DNA vrij van histonen en andere eiwitten zoals transcriptiefactoren5. FAIRE-seq, vergelijkbaar met ChIP-seq, maakt gebruik van formaldehyde crosslinking en sonicatie, behalve dat er geen immunoprecipitatie bij betrokken is en de nucleosoomvrije regio's worden geïsoleerd door fenol-chloroformextractie6. De MAPit-methode maakt gebruik van een GC-methyltransferase om de chromatinestructuur te testen met een resolutie van één molecuul7. ATAC-seq vertrouwt op de hyperactieve transposase, Tn58. De Tn5 transposase bindt bij voorkeur aan open chromatinegebieden en plaatst sequencingadapters in toegankelijke gebieden. Tn5 werkt via een DNA-gemedieerd "knip en plak" mechanisme, waarbij de transposase vooraf geladen met adapters bindt aan open chromatine sites, knipt DNA en ligeert de adapters8. Tn5-gebonden gebieden worden hersteld door PCR-versterking met behulp van primers die naar deze adapters gloeien. FAIRE-seq en DNase-seq vereisen een grote hoeveelheid uitgangsmateriaal (~ 100.000 cellen tot 225.000 cellen) en een afzonderlijke bibliotheekvoorbereidingsstap voordat9 wordt gesequenceerd. Aan de andere kant is het ATAC-seq-protocol relatief eenvoudig en vereist het een klein aantal cellen (<50.000 cellen)10. In tegenstelling tot de FAIRE-seq- en DNase-seq-technieken is de sequencingbibliotheekvoorbereiding van ATAC-seq relatief eenvoudig, omdat het geïsoleerde DNA-monster al door Tn5 wordt getagd met de sequencingadapters. Daarom is alleen de PCR-versterkingsstap met de juiste primers nodig om de bibliotheekvoorbereiding te voltooien en hoeven de voorafgaande verwerkingsstappen zoals eindreparatie en adapterligatie niet te worden uitgevoerd, waardoor tijd wordt bespaard11. Ten tweede vermijdt ATAC-seq de noodzaak van bisulfietconversie, klonen en versterking met regiospecifieke primers die vereist zijn voor MAPit7. Vanwege deze voordelen is ATAC-seq een enorm populaire methode geworden voor het definiëren van open chromatinegebieden. Hoewel de ATAC-seq-methode eenvoudig is, vereisen meerdere stappen optimalisatie om hoogwaardige en reproduceerbare gegevens te verkrijgen. Dit manuscript bespreekt optimalisatieprocedures voor standaard ATAC-seq bibliotheekvoorbereiding, met name drie parameters: (1) lysisbuffersamenstelling, (2) Tn5-transposaseconcentratie en (3) celnummer. Daarnaast biedt dit artikel voorbeeldgegevens van de optimalisatieomstandigheden met behulp van zowel kankerachtige als niet-kankerachtige aanhangende epitheelcellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereidingen voordat het experiment begint

  1. Bereid lysis buffervoorraad voor.
    OPMERKING: De optimale nucleaire isolatiebuffer kan voor elk celtype anders zijn. We raden aan om zowel de hypotone buffer die in het originele artikel8 is gebruikt als een CSK-buffer12,13 voor elk celtype te testen met behulp van trypanblauwe kleuring.
    1. Om hypotone buffer (Greenleaf buffer) te bereiden, mengt u 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 en 0,1% NP-40.
    2. Om CSK-buffer te bereiden, mengt u 10 mM PIPES pH 6,8, 100 mM NaCl, 300 mM sucrose, 3 mM MgCl2 en 0,1% Triton X-100.
  2. Zorg ervoor dat de celkweekcondities optimaal zijn; onderzoek de cellen onder een lichtmicroscoop om er zeker van te zijn dat er geen verhoogde niveaus van apoptose zijn.
  3. Zet de centrifuge aan om deze op 4 °C te laten komen.

2. Celoogst

  1. Aspirate media uit een celcultuur met <80% samenvloeiing. Cellen worden meestal gekweekt in een schaal van 35 mm of 60 mm, op basis van het aantal benodigde cellen, behandelingen, enz.
  2. Was de cellen met 1 ml of 3 ml PBS.
  3. Voeg 0,5 ml of 1 ml trypsine toe en incubeer gedurende 2-3 minuten (afhankelijk van de celtypen). Gebruik voorzichtig een pipet van 1 ml om goed te mengen.
  4. Voeg 1 ml of 2 ml media toe aan het bord en meng goed. Breng over naar een conische buis van 15 ml. Centrifugeer de cellen in een buis van 15 ml gedurende 3 minuten bij 300 x g.
    OPMERKING: Een zwenkbakrotor wordt aanbevolen om celverlies te minimaliseren.
  5. Aspirateer de media en resuspendeer de cellen in 1 ml of 2 ml medium.
    OPMERKING: Het is van cruciaal belang om een homogene eencellige oplossing te bereiden. Voor weefsels kan een Dounce-homogenisator worden gebruikt om weefsels te homogeniseren en grote celklompen of aggregaten te minimaliseren. Sommige weefsels vereisen filtratie (bijv. Celzeefmachines) en/of FACS-celsortering om levensvatbare cellen te isoleren en een oplossing met één cel te verkrijgen.
  6. Tel de cellen met behulp van een celteller.
    OPMERKING: In deze studie werd een geautomatiseerde celteller (Tabel van Materialen) gebruikt.
  7. Centrifugeer het vereiste celvolume (bijvoorbeeld een volume met 1 x 106 cellen op basis van het celgetal) bij 300 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  8. Resuspendeer de celpellet met 1 x 106 cellen in 1 ml koude PBS.
    OPMERKING: Als het aantal cellen kleiner is dan 1 x 106 cellen, verlaagt u het koude PBS-volume om de celoplossing in dezelfde concentratie te bereiden (1 x 106 cellen/ml).

3. Cellyse

  1. Breng 25 μL (= 2,5 x 104 cellen) over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,7 ml. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g bij 4 °C en gooi het supernatant voorzichtig weg
    OPMERKING: Een zwenkbakrotor wordt aanbevolen om celverlies te minimaliseren. Laat ongeveer 3 μL supernatant achter om ervoor te zorgen dat de cellen niet worden weggegooid.
  2. Voeg 25 μL lysisbuffer toe en resuspensieer de cellen door voorzichtig op en neer te pipetteren. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten
  3. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g bij 4 °C en gooi het supernatant voorzichtig weg.
    OPMERKING: Een zwenkbakrotor wordt aanbevolen om celverlies te minimaliseren. Laat ongeveer 3 μL supernatant achter om ervoor te zorgen dat de cellen niet worden weggegooid.

4. Tn5 tagmentatie

  1. Resuspenseer de pellet onmiddellijk in 25 μL Tn5-reactiemengsel. Het Tn5-reactiemengsel is als volgt: 12,5 μL 2x Tagmentation DNA-buffer (TD-buffer), 1,25-5 μL Tn5 transposase en 11,25-7,5 μL nucleasevrij water.
    OPMERKING: De standaardconcentratie van Tn5 is 2,5 μL voor 2,5 x 104 cellen.
  2. Incubeer gedurende 30 min bij 37 °C.
    OPMERKING: Meng de oplossing elke 10 min.

5. DNA-zuivering

OPMERKING: Zuivering is vereist voor versterking. DNA-zuivering gebeurt met behulp van de MinElute PCR-zuiveringskit (Materiaaltabel).

  1. Voeg 5 μL natriumacetaat van 3 M (pH 5,2) toe.
  2. Voeg onmiddellijk 125 μL Buffer PB toe en meng goed.
  3. Volg het PCR-zuiveringskitprotocol vanaf stap 2.
    1. Plaats de spinkolom in een opvangbuis van 2 ml.
    2. Breng het monster aan op de spinkolom en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 17.900 x g bij RT.
    3. Gooi de doorstroom weg en plaats de spinkolom terug in dezelfde opvangbuis.
    4. Voeg 750 μL buffer PE toe aan de spinkolom en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 17.900 x g bij RT.
    5. Gooi de doorstroom weg en plaats de spinkolom terug in dezelfde opvangbuis.
    6. Centrifugeer de spinkolom gedurende 5 minuten om het membraan volledig te drogen.
    7. Gooi de doorstroom weg en plaats de spinkolom in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,7 ml.
    8. Eluteer de DNA-fragmenten met 10 μL buffer EB.
    9. Laat de kolom 1 min staan bij RT.
    10. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 17.900 x g bij RT om het DNA te elueren.

6. PCR-versterking

OPMERKING: PCR-versterking van getransponeerde (tagmented) DNA's is noodzakelijk voor sequencing. In dit voorbeeld zijn nextera kitadapters (Materiaaltabel) gebruikt. De in dit onderzoek gebruikte primers zijn opgenomen in tabel 1.

  1. Stel de volgende PCR-reactie in 200 μL PCR-buizen in (50 μL voor elk monster). Het PCR-reactiemengsel is als volgt: 10 μL geëlueerd DNA (stap 5.), 2,5 μL van 25 mM Adapter 1, 2,5 μL van 25 mM Adapter 2, 25 μL van 2x PCR-mastermix en 10 μL nucleasevrij water
  2. Voer pcr-versterkingsprogramma deel 1 uit (tabel 2).
    OPMERKING: Voor initiële versterking worden dezelfde voorwaarden gebruikt voor alle monsters die een standaard thermische cycler gebruiken.
  3. Real-time qPCR (totaal 14,5 μL per monster)
    1. Stel met behulp van 5 μL van het product uit het PCR-versterkingsdeel 1 (stap 6.2.) de volgende reactie in, dit keer inclusief SYBR-goud en detectie in een real-time PCR-machine.
    2. Bereid het PCR-reactiemengsel als volgt: 5 μL PCR-product uit stap 6.2., 0,75 μL SYBR-goud (1000x verdund), 5 μL 2x PCR-mastermix en 3,75 μL nucleasevrij water.
      OPMERKING: De precieze cyclusnummers voor bibliotheekversterking voordat de verzadiging voor elk monster wordt bereikt, worden bepaald door qPCR (tabel 3) om de GC- en groottebias in PCR10 te verminderen. SYBR Gold werd verdund met nucleasevrij water. Om de verdunde oplossing te maken, werd 1 μL SYBR Gold (voorraadconcentratie 10.000x) toegevoegd aan 999 μL nucleasevrij water. De looptijd van RT-qPCR vermeld in tabel 3 is ongeveer 60 min.
  4. Bepaal het vereiste aantal extra PCR-cycli met behulp van de uitvoeringsparameters uit stap 6.3.
    1. Aantal cycli = 1/4 maximale (verzadigde) fluorescentie-intensiteit (typisch 3 of 4 PCR-cycli)
  5. PCR-versterkingsprogramma deel 2 (volume = 45 μL; Tabel 4): Nadat u het cyclusnummer hebt bepaald, stelt u PCR's in met extra cycli berekend in stap 6.4.1. Als het berekende cyclusgetal bijvoorbeeld 3 is, stelt u 3 cycli in het onderstaande programma in. De totale cycli zouden 8 zijn (5 in stap 6.2., plus 3 extra cycli in stap 6.5.)

7. Kralen zuivering

OPMERKING: Hier werden AMPure XP (Table of Materials) kralen gebruikt.

  1. Voeg aan de PCR-producten die in de vorige stap zijn versterkt 150 μL kralen toe bij RT.
    OPMERKING: Zelfgemaakte AMPure kralen14 kunnen in dit proces worden gebruikt.
  2. Incubeer gedurende 15 minuten bij RT.
  3. Plaats de buizen gedurende 5 minuten op een magnetische standaard.
  4. Verwijder het supernatant voorzichtig.
  5. Was de kralen met 200 μL 80% ethanol.
    OPMERKING: 80% ethanol moet vers worden bereid.
  6. Herhaal stap 7.4.
  7. Verwijder de ethanol volledig.
  8. Droog de monsters gedurende 10 minuten aan de lucht bij RT.
  9. Resuspend met 50 μL el elutiebuffer (10 mM Tris-HCL pH 8,0).
  10. Herhaal de kralenzuivering (stappen 7.1.-7.9.) om de primerbesmetting verder te minimaliseren.

8. DNA-concentratie en kwaliteitscontrole

  1. Meet de DNA-concentratie met behulp van een nucleïnezuurkwantificatiekit (Tabel van materialen).
  2. Controleer de versterkte DNA-fragmenten door gel-elektroforese met SYBR Gold (0,5x TBE, 1,5% agarosegel) of een geautomatiseerd elektroforesesysteem (bijv. TapeStation, bioanalyzer).

9. Volgorde

  1. Voer high-throughput sequencing uit met behulp van de versterkte DNA-monsters12,13.
    OPMERKING: Versterkte DNA-monsters zijn klaar voor high-throughput sequencing. Om nucleosomale DNA-fragmentinformatie te behouden, wordt paired-end sequencing aanbevolen boven single-end sequencing. Beide uiteinden van de DNA-fragmenten geven aan waar de transposase bindt. Voor het in kaart brengen van open chromatinegebieden is 30 miljoen reads/sample doorgaans voldoende.

10. Data-analyse

  1. Gegevensfiltratie op basis van de kwaliteit van de basisoproep: stel de minimale gemiddelde basiskwaliteitsscore in op 20 (99% nauwkeurigheid).
  2. Adapter bijsnijden: verwijder de adapterreeksen met een geschikt gereedschap.
    OPMERKING: Het trim galore wrapper tool (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) werd gebruikt om adaptersequenties te verwijderen. Voor ATAC-seq bibliotheken die door Illumina Tn5 zijn voorbereid, wordt de volgende reeks gebruikt als adaptersequentie: CTGTCTCTTATACACATCT. De minimale volgordelengte om adapterverontreiniging te herkennen is ingesteld op 5.
  3. Genoomkartering: Breng de metingen in kaart aan het juiste genoom met Bowtie met behulp van de volgende parameters "-I 0 -X 2000 -m 1"15. Een voorbeeld van het in kaart brengen van kwaliteit van MDA-MB-231 basale borstkankercellen is hieronder:
    Leest met ten minste één gerapporteerde uitlijning: 52,79%
    Leeswaarden die niet uitlijnd zijn: 13,10%
    Leest met uitlijningen onderdrukt als gevolg van -m: 34,11%
  4. Ontdubbeling: Markeer de PCR-duplicaten door Picard tools16.
  5. Een genoomdekkingsbestand genereren voor gegevensvisualisatie: converteer de ontdubbelde paired-end reads naar single-end leesfragmenten. Genoomdekkingssporen worden verkregen met behulp van genomeCoverageBed van bedtools17.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om succesvolle en hoogwaardige ATAC-seq-gegevens te verkrijgen, is het belangrijk om de experimentele omstandigheden te optimaliseren. ATAC-seq bibliotheekvoorbereiding kan worden onderverdeeld in de vijf belangrijkste stappen (figuur 1), namelijk cellyse, tagmentatie (fragmentatie en adapterinbrenging door Tn5), genomische DNA-zuivering, PCR-amplificatie en gegevensanalyse. Als eerste proces moet de cellysisbuffer (nucleaire isolatie) eerst voor elk celtype worden geoptimaliseerd. Ofwel de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATAC-seq is op grote schaal gebruikt voor het in kaart brengen van open en actieve chromatinegebieden. De progressie van kankercellen wordt vaak aangedreven door genetische veranderingen en epigenetische herprogrammering, wat resulteert in veranderde chromatinetoegankelijkheid en genexpressie. Een voorbeeld van deze herprogrammering wordt gezien tijdens de epitheliale naar mesenchymale overgang (EMT) en het omgekeerde proces, mesenchymale naar epitheliale overgang (MET), waarvan bekend is dat het belangrijke cellulaire h...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen relevante of materiële financiële belangen zijn die verband houden met het onderzoek dat in dit artikel wordt beschreven.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn dankbaar voor de UND Genomics Core-faciliteit voor uitstekende technische assistentie.

Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health [P20GM104360 tot M.T., P20 GM104360 tot A.D.] en start-upfondsen verstrekt door de University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, Department of Biomedical Sciences [tot M.T.].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL microcentrifuge tubesUSA Scientific1615-5500Natural
10 µL XL TipOne tipsUSA Scientific1120-3810Gefilterd en met lage retentie
100 µL XL TipOne RPT tipsUSA Scientific1182-1830Gefilterd en met lage retentie
100 µL XL TipOne tipsUSA Scientific1120-1840Gefilterd en met lage retentie. Bevelled Grade
15 mL Conical Centrifuge TubesCorning352096
20 µL TipOne RPT tipsUSA Scientific1183-1810Gefilterd en met lage retentie
200 µL TipOne RPT tipsUSA Scientific1180-8810Gefilterd en met lage retentie
50 mL Centrifuge TubesFisherbrand06-443-19
AgaroseThermoFisher ScientificYBP136010Genetic Analysis Grade
All the cell lines used in this study are obtained from ATCCATCC
Allegra X-30R CentrifugeBeckman Coulter364658SX2415
AMPure XP beadsBeckman CoulterA63881Bead purification kit
CellDrop Cell CounterDeNovixCellDrop FLCell counter
EDTAMilliporeSigmaEDSBioUltra, watervrij, ≥99% (titratie)
EGTAMilliporeSigmaE3889
Ethanol 100%ThermoFisher ScientificAC615100020Watervrij; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products
Fetal Bovine Serum - TET TestedR&D SystemsS10350Drievoudig 0,1 µm gefilterd
Gibco DMEM 1xThermoFisher Scientific11965092[+] 4,5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate
Gibco PBS 1xThermoFisher Scientific10010023pH 7,4
Gibco Trypsin-EDTA 1xThermoFisher Scientific25200056(0,25%), fenolrood
GlycerolIBI Scientific56-81-5
GlycineMilliporeSigmaG8898
HClMilliporeSigmaH1758
HEPESMilliporeSigmaH3375
Invitrogen Qubit FluorometerThermoFisher ScientificQ32857
MgCl2MilliporeSigmaM3634
MinElute PCR Purification kitQiagen28004DNA-zuiveringskit
NaClIBI Scientific7647-14-5
NaOHMilliporeSigmaS8045BioXtra, ≥98% (acidimetrisch), pellets (watervrij)
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master MixNew England BiolabsM0541
Nextera DNA Sample Preparation KitIlluminaFC-121-10302x TD en Tn5 Transposase
NP - 40 (IGEPAL CA-630)MilliporeSigmaI8896voor moleculaire biologie
PCR Detection SystemBioRad1855484CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler
PIPESMilliporeSigmaP1851BioPerformance Certified, geschikt voor celcultuur
Qubit dsDNA HS Assay kitThermoFisher ScientificQ32854Invitrogen; Nucleïnezuurkwantitatiekkit
Quibit Assay TubesThermoFisher ScientificQ32856Invitrogen
SDSMilliporeSigmaL3771
Sodium AcetateHomemade-pH 5,2
SucroseIBI Scientific57-50-1
SYBR GoldThermoFisher ScientificS11494
SYBR Green Supermix, 1,25 mLBioRad1708882
T100 Thermal CyclerBioRad1861096
TempAssure 0,2 mL PCR 8-Tube StripsUSA Scientific1402-4700Flex-free, natuurlijk, polypropyleen
TempPlate 384-WELL PCR PLATEUSA Scientific1438-4700Single notch. Natuurlijk polypropyleen
Tris BaseMilliporeSigma648311ULTROL Grade
Triton x-100IBI Scientific9002-93-1
TrueSeq Dual Index Sequencing Primer KitIlluminaPE-121-1003paired-end
Trypan Blue StainThermoFisher ScientificQ32851
Tween-20MilliporeSigmaP7949BioXtra, stroperige vloeistof
WaterMilliporeSigmaW3500sterieel gefilterd, BioReagent, geschikt voor celcultuur

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
  2. Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).
  3. Sanghi, A., et al. Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer. Nature Communications. 12 (1), 5732(2021).
  4. Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), (2018).
  5. Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
  6. Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
  7. Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution. Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).
  8. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  9. Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
  10. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. , 1(2015).
  11. Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. A comparative overview of epigenomic profiling methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687(2021).
  12. Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue. Scientific Reports. 9 (1), 516(2019).
  13. Takaku, M., et al. GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler. Genome Biology. 17, 36(2016).
  14. Rohland, N., Reich, D. C. ost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
  15. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25(2009).
  16. Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository. , Available from: https://broadinstitute.github.io/picard/ (2022).
  17. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  18. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
  19. Zhou, B., et al. INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma. Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).
  20. Takaku, M., et al. GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network. Nature Communications. 9 (1), 1059(2018).
  21. Oldfield, A. J., et al. NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region. Nature Communications. 10 (1), 3072(2019).
  22. Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination. Elife. 8, 45672(2019).
  23. Elrod, N. D., et al. The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes. Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).
  24. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  25. Porter, J. R., et al. Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response. Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).
  26. Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha. Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).
  27. McCarthy, M. T., O'Callaghan, C. A. PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data. Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).
  28. Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).
  29. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  30. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  31. Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance. Nature Communications. 12 (1), 1786(2021).
  32. Bhattacharya, A., et al. The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression. Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).
  33. Schep, A. N., et al. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Chromatin toegankelijkheidTn5 transposaselibrary preparatieopen chromatinregio scellysebufferPCR amplificatienucleosoomvrije fragmentenpiekannotatie

Gerelateerde artikelen