Single-Molecule Diffusie en assemblage op polymeer-crowded lipide membranen

Summary

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de binding, mobiliteit en assemblage van afzonderlijke moleculen op kunstmatige overvolle lipidemembranen uit te voeren en te analyseren met behulp van single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopie.

Abstract

Cellulaire membranen zijn zeer drukke omgevingen voor biomoleculaire reacties en signalering. Toch gebruiken de meeste in vitro experimenten die de eiwitinteractie met lipiden onderzoeken naakte dubbellaagse membranen. Dergelijke systemen missen de complexiteit van verdringing door membraan-ingebedde eiwitten en glycanen en sluiten de bijbehorende volume-effecten uit die worden aangetroffen op cellulaire membraanoppervlakken. Ook voorkomt het negatief geladen glasoppervlak waarop de lipide bilayers worden gevormd de vrije diffusie van transmembraanbiomoleculen. Hier presenteren we een goed gekarakteriseerd polymeer-lipidemembraan als een nabootsing voor drukke lipidemembranen. Dit protocol maakt gebruik van polyethyleenglycol (PEG) -geconjugeerde lipiden als een gegeneraliseerde benadering voor het opnemen van crowders in de ondersteunde lipide bilayer (SLB). Eerst wordt een reinigingsprocedure van de microscopische dia's en coverslips gepresenteerd voor het uitvoeren van experimenten met één molecuul. Vervolgens worden methoden besproken voor het karakteriseren van de PEG-SLBs en het uitvoeren van experimenten met één molecuul van de binding, diffusie en assemblage van biomoleculen met behulp van single-molecule tracking en fotobleaching. Ten slotte laat dit protocol zien hoe de nanoporiënassemblage van bacterieel porievormend toxine Cytolysine A (ClyA) op overvolle lipidemembranen kan worden gevolgd met fotobleachingsanalyse met één molecuul. MATLAB-codes met voorbeeldgegevenssets zijn ook opgenomen om enkele van de gemeenschappelijke analyses uit te voeren, zoals het volgen van deeltjes, het extraheren van diffusief gedrag en het tellen van subeenheden.

Introduction

Celmembranen zijn zeer drukke en complexe systemen¹. Moleculaire verdringing kan een aanzienlijke impact hebben op de diffusie van membraangebonden entiteiten zoals eiwitten en lipiden ^2,3,4. Evenzo worden bimoleculaire reacties op lipidembranen zoals receptordimerisatie of de oligomerisatie van membraancomplexen beïnvloed door verdringing ^5,6,7. De aard, configuratie en concentratie van crowders kunnen de membraanbinding, diffusiviteit en eiwit-eiwitinteractie op verschillende manieren regelen ^8,9. Omdat het beheersen van membraanverdringing op cellulaire membranen en het interpreteren van de invloed ervan op ingebedde biomoleculen een uitdaging is, hebben onderzoekers geprobeerd alternatieve in vitro systemen op te zetten¹⁰.

Een populaire benadering voor kunstmatige overvolle membranen is het dopen van de dubbellaagse membranen met polymeer (zoals polyethyleenglycol, PEG)-getransplanteerde lipiden^11,12. Tijdens de visualisatie van eiwit- en lipidedynamiek op ondersteunde lipide bilayers (SLB's), beschermen deze polymeren bovendien de in het membraan ingebedde componenten van het onderliggende negatief geladen substraat (zoals glas) door de bilayer effectief weg te tillen van de onderliggende ondersteuning. Door de grootte en concentratie van het polymeer te variëren, kan men de mate van moleculaire verdringing regelen, evenals de scheiding van de onderliggende vaste steun^13,14. Dit is duidelijk een voordeel ten opzichte van lipide bilayers ondersteund op vaste substraten zonder polymeerkussens ^15,16, waar transmembraanbiomoleculen hun activiteit kunnen verliezen 17,18,19. Wat nog belangrijker is, het stelt ons in staat om de drukke omgeving van het celmembraan in vitro samen te vatten, wat van cruciaal belang is voor veel membraanprocessen.

Oppervlakte-geënte polymeren op membranen ondergaan ook veranderingen in hun configuratie, afhankelijk van hun entdichtheid¹². Bij lage concentraties blijven ze in een entropisch opgerolde configuratie, bekend als een paddenstoel, boven het membraanoppervlak. Met toenemende concentratie beginnen ze te interageren en hebben ze de neiging om zich los te maken en uit te breiden, wat uiteindelijk een dichte borstelachtige formatie op het membraan oplevert²¹. Omdat de overgang van de paddenstoel naar het borstelregime zeer heterogeen is en zich manifesteert in slecht gekarakteriseerde omstandigheden van het polymeer, is het belangrijk om goed gekarakteriseerde omstandigheden te gebruiken voor verdringing op polymeergeënte membranen. Vergeleken met een recente studie²⁰, identificeren en rapporteren we drukke membraansamenstellingen die het diffusieve transport en de activiteit van transmembraanbiomoleculen handhaven.

In dit protocol bespreken we hoe we PEGylated lipidemembranen kunnen genereren en geven we aanbevelingen voor PEG-dichtheden die verdringing nabootsen in twee verschillende regimes van polymeerconfiguratie (namelijk paddenstoel en borstel). Het protocol beschrijft ook single-molecule binding, particle tracking en photobleaching data-acquisitie en -analyse voor moleculen ingebed in deze overvolle membranen. Eerst beschrijven we de grondige reinigingsstappen, de assemblage van de beeldkamer en de generatie PEG-SB's. Ten tweede geven we details voor de single-molecule binding, deeltjes tracking en fotobleaching experimenten. Ten derde bespreken we i) het extraheren van de relatieve bindingsaffiniteiten, ii) het karakteriseren van moleculaire diffusie en iii) het tellen van subeenheden in een eiwitassemblage uit films van afzonderlijke moleculen op het membraan.

Hoewel we dit systeem hebben gekarakteriseerd met beeldvorming met één molecuul, is het protocol nuttig voor alle membraanbiofysici die geïnteresseerd zijn in het begrijpen van het effect van drukte op biomoleculaire reacties op lipidembranen. Over het algemeen presenteren we een robuuste pijplijn voor het maken van drukke en ondersteunde lipide bilayers, samen met verschillende single-molecule assays die op hen zijn uitgevoerd en de bijbehorende analyseroutines.

Protocol

1. Reiniging van de dia en coverslip voor experimenten met één molecuul

1. Maak vóór de montage van de beeldkamer zowel de coverslips als de dia's schoon en bereid ze voor. Boor meerdere paar gaten op de glasglijbanen met behulp van een boormachine met diamantgecoate boren (0,5-1 mm in diameter). Als acrylplaten worden gebruikt, gebruik dan een lasersnijder om precieze gaten (0,5 mm) te maken, zoals weergegeven in figuur 1.
   OPMERKING: Elk paar gaten zal fungeren als een in- en uitlaat voor stroomuitwisseling voor een individuele microfluïdische kamer. Een representatief CAD-bestand voor gaten in een acrylplaat is beschikbaar in Aanvullend coderingsbestand 1. Gaten geboord op glazen platen zijn meestal 1,5x-2x groter dan de boorgrootte.
2. Reinig de dia's en coverslips met afwasmiddel. Spoel ze grondig af met gedeïoniseerd water. Plaats de dia's en coverslips in een aparte pot met water (Slide Staining) (Coplin) en soniceer gedurende 30 minuten in een bad sonicator. Gebruik voor alle ultrasoonapparaatstappen een vermogensinstelling van 70 W.
3. Verwijder het water en vul de Coplin-pot met de glazen dia's en coverslips met aceton tot de rand (50-100 ml afhankelijk van het potvolume). Gebruik in het geval van acrylplaten hetzelfde volume voorgemengde 50% (v / v) acetonoplossing, anders worden de dia's ijzig. Schud de Coplin-pot om ervoor te zorgen dat alle dia's en coverslips volledig in de oplossing zijn ondergedompeld en soniceer gedurende 30 minuten in een badsonicator.
4. Verwijder de aceton en gooi het weg in een afvalcontainer, giet methanol in de Coplin-potten (50%, v / v voor acrylglaasjes) en soniceer gedurende 30 minuten. Zowel aceton als methanol worden gebruikt om organische deeltjes op de dia's te verwijderen.
5. Spoel de dia's en coverslips af met overvloedige hoeveelheden type 1 water en plaats ze in een glazen Coplin-pot. Giet 1 M KOH-oplossing in de pot en soniceer gedurende 1 uur. Gebruik voor de acrylplaten 0,5 M KOH.
6. Gooi de KOH weg in een anorganische afvalcontainer. Spoel de pot af met veel water en plaats de Coplin potten in een zuurkast voor piranha behandeling. Voer geen piranha-behandeling uit voor acrylglaasjes; ga direct verder met stap 1.9.
   LET OP: Piranha-behandeling moet worden uitgevoerd in een zuurkast met de juiste handschoenen, een veiligheidsbril en een schort voor het hanteren van zuren. Piranha-oplossing is een sterk oxidatiemiddel en verwijdert alle overgebleven organische deeltjes van de dia's en coverslips.
7. Giet voor het bereiden van de piranha-oplossing voorzichtig een 2/3 volume zwavelzuur (98%, v/v) in een glazen bekerglas en vul de rest met waterstofperoxide (30%, v/v). Meng de oplossing voorzichtig met een glazen staaf, giet deze in de Coplin-pot en laat de Coplin-pot minstens 1 uur in de zuurkast staan.
8. Decanteer de piranha-oplossing uit de Coplin-pot in een weggooicontainer voor zuur afval dat in de zuurkast wordt bewaard. Spoel de Coplin pot af met een overvloedige hoeveelheid type 1 water.
9. Droog de dia's en deklagen in een zachte stroom stikstofgas en plaats ze in een schone Coplin-pot. De gedroogde dia's en coverslips zijn nu klaar voor plasmabehandeling. Neem een paar dia's en coverslips en plaats ze in de plasmamachine.
10. Creëer een vacuüm in de kamer. Draai de knop naar de radiofrequentie van 8-12 MHz voor het genereren van plasma in de kamer. Een paarse gloed in de kamer geeft de vorming van een plasma in de kamer aan.
11. Voer de plasmabehandeling uit gedurende 8-10 minuten. Laat het vacuüm voorzichtig los na het uitschakelen van het plasma en ga verder met stap 2 voor het assembleren van de microfluïdische beeldvormingskamer.

2. Montage van de microfluïdische kamer

OPMERKING: De beeldkamer wordt gemaakt door dubbelzijdige tape tussen een vooraf gereinigde coverslip en schuif van de vorige stap te plaatsen, zoals hieronder beschreven.

1. Monteer de dia's en coverslip na de plasmabehandeling zoals weergegeven in figuur 1. Plaats de glasschuif op een schoon vloeipapier. Snijd de dubbelzijdige tape in ~2-3 mm brede stroken en plaats ze aan elke kant van een paar gaten op de glazen glijbaan. Gebruik een pipetpunt om de tape af te vlakken, anders veroorzaakt deze lekkage van het ene kanaal naar het andere.
   OPMERKING: U kunt de tape ook voor de hele dia knippen met behulp van een laser of geautomatiseerde plottersnijder (figuur 1).
2. Plaats de met plasma behandelde coverslip op de afgeplakte schuif om de kamer te sluiten. Gebruik een pipetpunt om de coverslip voorzichtig op de getapete gebieden te drukken om het kanaal waterdicht te maken.
3. Als u glasglijbanen gebruikt, sluit u de randen af met epoxyhars. Ten slotte heeft elke beeldkamer gemaakt van een dia en coverslip een afmeting van 10 mm x 2 mm x 0,1 mm (lengte x breedte x diepte). Bewaar de voorbereide microfluïdische beeldvormingskamers gedurende 1-2 weken in uitgedroogde omstandigheden (bij voorkeur tussen 10-25 °C).
   OPMERKING: Voor de lasergesneden tapes die worden gebruikt met acrylplaten, is het niet nodig om epoxy te gebruiken, omdat de taperanden een strakke lekvrije afdichting vormen.

3. Het maken van ondersteunde dubbellagen op glassubstraat door blaasjesfusie

OPMERKING: Overvolle ondersteunde lipide bilayers worden gegenereerd op de wanden van de beeldvormingskamer door de fusie van lipide blaasjes bereid met gedopeerde PEG-lipiden.

1. Neem een schone glazen injectieflacon, bij voorkeur voorgezuiverd met piranha-oplossing. Voeg chloroformoplossing van 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholine (POPC) en 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[amino(polyethyleenglycol)-2000] (DOPE-PEG2000) toe aan de gewenste molfractie van PEG2000-lipiden, zodat de uiteindelijke concentratie na toevoeging van buffer 3 mM lipiden in stap 3.4 zal zijn. Bereid andere membraansamenstellingen van lipiden op dezelfde manier voor.
2. Droog de chloroform uit de injectieflacon met behulp van een zachte stroom stikstof met een kleine werveling, zodat de gedroogde lipiden gelijkmatig op het oppervlak van de injectieflacon worden gecoat. Plaats de injectieflacon gedurende 1 uur in een vacuümdesiccator. Dit verwijdert eventuele resterende chloroform in de glazen injectieflacon. Voeg 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe en incubeer een nacht bij 37 °C.
3. Bereid kleine unilamellaire blaasjes (SUV's) zoals hieronder beschreven.
   1. Vortex voorzichtig gedurende 1-2 minuten na nachtelijke incubatie totdat de oplossing troebel en melkachtig wordt.
   2. Neem 100 μL van deze oplossing in een kleine centrifugebuis van 500 μL en soniceer gedurende ongeveer 1 uur in een badsonicator (ingesteld op een vermogensinstelling van 70 W). De oplossing zal duidelijk worden; zo niet, soniceer dan nog eens 30 minuten. Deze stap genereert SUV's met een diameter van 50-100 nm.
      OPMERKING: Als u zich voor de eerste keer voorbereidt, karakteriseert u de SUV's met behulp van dynamic light scattering ^22,23 (DLS) of een gelijkwaardige methode.
4. Voeg calciumchloride (CaCl_2, 3 M bouillon) toe aan de gesonificeerde blaasjes, zodat de uiteindelijke concentratie 30 mM in de lipideoplossing is.
5. Snijd een micropipettetip voor het injecteren van de monsteroplossing, zodat deze goed in het gat past. Meng de lipideoplossing en injecteer door een van de gaten in de beeldkamer die in stap 2 zijn gemaakt. Veeg de overtollige oplossing die uit de kamer uit de uitlaat komt met een schone tissue om de vervuiling van aangrenzende kanalen te voorkomen.
6. Laat deze assemblage gedurende 90 minuten in een bevochtigde kamer staan. Bereid een bevochtigingskamer voor door een nat weefsel aan het einde van een centrifugebuis van 50 ml te plaatsen. Plaats de schuif zijwaarts in de buis met gesloten buisdoppen. De blaasjes zullen fuseren en een uniforme dubbellaag op het glasoppervlak genereren.
7. Was de kamer grondig met een overvloedige hoeveelheid PBS-buffer (ongeveer 5 keer het volume van de beeldkamer). Voorkom het binnendringen van luchtbellen in de kamer tijdens het wassen, omdat dit defecten in het membraan kan veroorzaken.

4. Microscoopopstelling en beeldvormingsmetingen met één deeltjes

OPMERKING: Experimenten met één molecuul worden uitgevoerd op een objectieve totale interne reflectiefluorescentie ^24,25,26 (TIRF) microscoopopopstelling (figuur 2). TIRF-beeldvorming biedt een betere signaal-ruisverhouding voor beeldvorming met één molecuul, hoewel epifluorescentiemicroscopen ook onder bepaalde omstandigheden kunnen worden gebruikt (vooral wanneer de fluorescerende biomoleculen uit de bulkoplossing kunnen worden verwijderd door te wassen). Het prisma-type TIRF kan worden gebruikt, maar het objectieve type heeft de voorkeur voor het gemak van het opzetten van microfluïdica²⁷. Voor objectief-type TIRF wordt een hoog numeriek diafragmaobjectief (100x vergroting, meestal in de handel verkrijgbaar als TIRF-objectief) aanbevolen.

1. Voordat u een experiment op het gebied van mobiliteit en assemblage uitvoert, moet u de TIRF-microscoop uitlijnen om een optimale signaal-ruisverhouding te garanderen als gevolg van verlichting door het evanescente veld. Houd tijdens de uitlijning het laservermogen laag, tussen 100 μW en 1 mW.
   LET OP: Laserveiligheidsbrillen moeten worden gebruikt tijdens het uitlijnen van de laserstraal.
   1. Om de microscoop uit te lijnen, bereidt u een fluorescerend kraalmonster door ze in het microfluïdische kanaal toe te voegen bij lage concentraties (bij ~ 100 pM), zodat fluorescerende vlekken van enkele kralen elkaar niet overlappen in de afbeeldingen.
   2. Visualiseer eerst de kralen in de epifluorescentiemodus. Terwijl de verlichting in epifluorescentiemodus is, verplaatst u de M5-spiegelvertalingsfase (de spiegel die de laser naar de dichroïsche reflecteert) zodanig dat de straal die uit het objectief komt, buigt totdat deze zich uiteindelijk in een totale interne reflectieconfiguratie bevindt.
   3. Controleer of de TIR-verlichting is bereikt. Wanneer het TIR-evanescentveld het kraalmonster verlicht, controleer dan of alleen de kralen op het oppervlak zichtbaar zijn en of vrij zwevende kralen weg van het oppervlak niet worden waargenomen.
2. Stel aan het begin van het experiment het laservermogen op het objectief achterste brandpuntsvlak in op 5-10 mW om fotovernietiging (fotobleaching) van de fluoroforen te voorkomen.
3. Houd de dia op het microscoopstadium en focus eerst op het kale membraan (zonder fluoroforen). Meestal zijn kleine sporen van onzuiverheden in lipidembranen voldoende om dit te doen. Optioneel: Neem tijdens stap 3.1 een klein aantal fluorescerende kralen of quantum dots (sub picomolair bereik) op, zodat er slechts twee tot vijf fluorescerende deeltjes in het gezichtsveld aanwezig zijn om het identificeren van de juiste focus te vergemakkelijken.
4. Injecteer het monster (membraaneiwitten, enz.) met behulp van een micropipette in de PEG-SLB-gecoate beeldkamer gemaakt in stap 3.7.
5. Voor het meten van de bindingskinetiek met één molecuul gebruikt u een spuitpomp om de gelabelde biomoleculen door de inlaatgaten naar de microfluïdische kamer te laten stromen (figuur 3). Gebruik een debiet van 50-500 μL/min.
   1. Start de filmacquisitie voordat u de oplossing aan de beeldkamer toevoegt. Verkrijg >5.000 frames met een framesnelheid van 25-50 frames/s onder continue stroom totdat er geen verdere toename is in het verschijnen van nieuwe vlekken op het membraanoppervlak (video 1). Voor de analyse van bindingskinetiek volgt u de stappen uit 6.1.
6. Voor het volgen van enkele deeltjes voegt u de gelabelde biomoleculen in lage concentraties (vergeleken met de bindingsconstante) toe aan het kanaal met behulp van een micropipette. Optimaliseer de concentratie tot een dichtheid van <0,1 deeltjes/μm² , zodat individuele deeltjes elkaar zelden kruisen (video 2). Dit zorgt voor de hoge betrouwbaarheid van tracks die uit de datasets worden hersteld. Incubeer indien nodig (in geval van slechte membraanbinding door biomoleculen, ~ 10 min) in een bevochtigingsomgeving en was de kamer met de buffer.
   OPMERKING: Wassen is nodig als de binding slecht is op het membraan en de meeste fluorescerende moleculen in de oplossing blijven. Anders kan dit de beeldvorming verstoren en resulteren in een slechte signaal-ruisverhouding.
7. Voor trajectanalyse met één deeltjes verwerft u 200-500 frames met 10-100 frames / s. Houd de objectieflens scherp op het dubbellaagse vlak met minimale podiumdrift tijdens het acquisitie-interval.

5. Beeldacquisitie voor het tellen van subeenheden in een eiwitassemblage

OPMERKING: Beeldacquisitie voor het schatten van stoichiometrie vereist continu bleken van fluoroforen en het detecteren van het aantal stappen totdat er geen fluoroforen meer fluorescentie uitzenden.

1. Voeg voor het meten van subeenheden de relevante concentratie van gelabelde biomoleculen toe (voorbeeld: zie resultaten; ClyA werd toegevoegd met een concentratie van 25 nM) aan de microfluïdische beeldvormingskamer en incubeerde (indien nodig wassen). Incubeer de glijbaan in een bevochtigingskamer op de gewenste temperatuur gedurende de vereiste hoeveelheid tijd (bijvoorbeeld: 37 °C en 60 minuten voor de assemblage van ClyA).
2. Voer beeldacquisitie uit voor fotobleaching met één molecuul zoals hieronder beschreven.
   1. Was de beeldkamer met een buffer voordat u gaat beeldvormen (indien nodig). Plaats de dia op de microscoop en pas de focus aan om de gelabelde moleculen te visualiseren.
   2. Stel het laservermogen in op een niveau waarop het bleken van de fluorofoor geleidelijk optreedt (~ 1-5 min). Idealiter, voor elk geassembleerd biomolecuul, houd de fotobleachingstapsnelheid >10-20 beeldvormende frames uit elkaar. Verkrijg de beelden totdat alle moleculen volledig fotobleached zijn (video 3).
      OPMERKING: Om de totale duur van het vereiste fotobleachingstraject te bepalen, plott u de gemiddelde intensiteit van individuele vlekken met het aantal beeldframes en bepaalt u de tijdconstante door een exponentiële vervalfunctie aan te passen. De totale duur van de overname kan worden ingesteld op 5-10 keer de tijdconstante.
3. Voer een tijdsafhankelijke assemblagemeting uit door filmacquisitie te starten zodra het monster in de kamer wordt geïntroduceerd en nieuwe fotobleachingfilms te verkrijgen met vaste tijdsintervallen na membraanbinding van verschillende segmenten van de PEG-SLB.

6. Beeld- en data-analyse

1. Voer binding en tracking van één deeltje uit zoals hieronder beschreven.
   1. Extraheer trajecten met één deeltje uit de hierboven verkregen films, zoals weergegeven in figuur 4. Voor het detecteren van afzonderlijke deeltjes en het volgen ervan, gebruikt u het MATLAB-pakket, u-track²⁸, of de Trackmate²⁹, een plug-in in ImageJ, die ook een robuust algoritme voor het volgen van enkele deeltjes biedt. Volg de stappen voor het instellen van u-track analyse zoals weergegeven in Aanvullend Bestand 1.
      OPMERKING: De kritische parameters voor het volgen van enkele deeltjes zijn de standaarddeviatie van de deeltjesgrootte (in pixels) en de lengte van de openingsluiting. Gebruik respectievelijk 1 en 0 voor deze parameters als de strengste criteria voor tracking.
   2. Om de bindingssnelheidsconstanten te berekenen, moet u eerst het aantal deeltjes schatten dat zich in de loop van de tijd aan het membraanoppervlak bindt. Gebruik het MATLAB-bestand binding_SPT (Supplementary Coding File 2) met de u-track uitvoermap om het aantal deeltjes dat op het membraan verschijnt te identificeren en te plotten, verkregen uit stap 6.1. Pas de waargenomen kinetiek aan de juiste kinetische modellen aan (bijvoorbeeld: enkele exponentiële fit om de tijdconstante te bepalen, waarvan de inverse kan worden toegewezen aan de schijnbare snelheidsconstante)³⁰ om de snelheidsconstanten te extraheren (zie resultaten, figuur 5).
   3. De mean-squared displacement (MSD) van de diffuserende deeltjes (zoals DNA-tracer in PEG-SLBs, figuur 6) geeft de aard van diffusie aan. Gebruik het MATLAB-pakket MSD_ISD (Supplementary Coding File 2) met de u-track uitvoermap om de MSD-plot te verkrijgen als functie van de vertragingstijd (figuur 6B).
   4. Om heterogene diffuserende soorten te identificeren, berekent u de isd-verdelingen (instantane squared displacement) zoals weergegeven in figuur 6C. ISD2, gedefinieerd als (X_t+τ - X_t)² + (Y_t+τ− Y_t)², waarbij vertragingstijd, τ = 2, de voorkeur heeft omdat het geluid vermindert. Filter korte trajecten uit met minder dan drie frames om ruis te verminderen.
   5. Gebruik ISD_analyzer (Supplementary Coding File 2) in MATLAB met de u-track output om de ISD's van de gevolgde deeltjes te plotten (figuur 6C).
2. Voer fotobleachinganalyses met één molecuul uit zoals hieronder beschreven.
   1. Om de stoichiometrie van de membraancomplexen te schatten, voert u een fotobleachinganalyse uit op de tijdsafhankelijke intensiteiten van de fluorescerende complexen (video 3). Pas hiervoor een driftcorrectiealgoritme (drift_correct_images, Supplementary Coding File 2) toe op basis van de autocorrelatie van filmframes om de vertaaldrift te extraheren. Dit veronderstelt dat de geassembleerde structuren grotendeels immobiel zijn tijdens beeldacquisitie. Voer het MATLAB-pakket uit Extract_traces_1C (Supplementary Coding File 2) om tijdsporen van deeltjesintensiteit uit de films te detecteren.
   2. Gebruik de MATLAB-code Stepcount_immobile (Supplementary Coding File 2) om de stapdetectie voor de intensiteitstijdsporen uit te voeren. Als de deeltjes niet onbeweeglijk zijn, gebruik dan het u-track pakket om de locatie van bewegende deeltjes te extraheren. Deze set xy-coördinaten kan worden toegewezen aan de onbewerkte films om de intensiteitswaarden van het bewegende deeltje te extraheren terwijl het zijdelings op het membraan diffundeert. Gebruik het MATLAB-pakket utrack_Int (Supplementary Coding File 2) met de uitvoer van u-track analyse voor deze optie.
   3. Voer een correctie uit voor onvolledige etikettering van de biomoleculen met fluorofoortags om de juiste eiwitcomplexstoichiometrie te schatten. Bepaal de etiketteringsefficiëntie met een UV-VIS-spectrofotometer door de absorptie van kleurstof en eiwit te meten om de concentratie te schatten. Bereken de etiketteringsefficiëntie als de molaire verhouding van de kleurstof tot het eiwit.
      OPMERKING: Sommige kleurstoffen absorberen ook bij golflengten in de buurt van 280 nm, en daarom moet deze absorptiebijdrage van de kleurstof worden meegenomen bij de berekening van de concentratie.
   4. Voer een binomiale correctie uit om rekening te houden met de onvolledige etiketteringsefficiëntie van de fluorofoor op de volgende manier door de MATLAB-code Step_correction (Supplementary Coding File 2) te gebruiken met de gegevens die zijn verkregen uit staptelling in stap 6.2.2. Bijvoorbeeld, voor een porievormend toxine zoals Cytolysine A, dat een dodecamerische ringachtige structuur vormt, past u een binomiale correctie toe met behulp van de volgende formule:
      n_k
      waarbij = etiketteringsefficiëntie, n = aantal fotobleachingstappen en s = werkelijke tellingen. Gebruik de MATLAB-routine Stepcount_immobile om de gecorrigeerde oligomere soorten te herstellen. De frequentie van oligomeren (s_i) omzetten in massafracties (figuur 7C; Aanvullend coderingsbestand 2).
      OPMERKING: Een set van u-track geanalyseerde bestanden zijn opgenomen in Aanvullende codering Bestand 3. De MATLAB-codes in Supplementary Coding File 2 kunnen met deze datasets worden uitgevoerd.

Results

Monitoring van de binding van ClyA-eiwit op PEGylated membranen
Na stap 4.5 wordt de bindingskinetiek geschat door het aantal deeltjes dat in de loop van de tijd aan het membraanoppervlak bindt uit te zetten (video 1). Naarmate ClyA-eiwit zich bindt aan een membraan met 5 mol% PEG2000-lipiden, neemt de deeltjesdichtheid toe en bereikt verzadiging (figuur 5). Een exponentieel verval dat past bij de gebonden deeltjes (cyaancirkels) geeft de tijdconstante (τ...

Discussion

Hier demonstreren we experimenten met één molecuul op ondersteunde lipide bilayers (SLB's) die een drukke omgeving manifesteren voor membraan-ingebedde biomoleculen. De drukke omgeving genereert een uitgesloten volume-effect, wat leidt tot de versterking van biomoleculaire reacties 1,2,39,40. Voor het PEG-lipidensysteem, waarbij het polymeer voornamelijk het volume buiten de dubbellaag inneemt,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5 ml Syringes	HMD Healthcare	Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin	Kunststof injectiespuit
Aceton	Finar Chemicals	10020LL025
Acrylplaat			2 mm dik
Acrylplaat	BigiMall		2 mm, helder
Bath Sonicator	Branson	CPX-1800
Calciumchloride
Chloroform	Sigma	528730	HPLC-kwaliteit
Cholesterol	Avanti	700100
Coplinpot	Duran Wheaton Kimble	S6016	8-schuifpot met glazen deksel
Dekglasjes	VWR	631-1574	24 mm X 50 mm
Cy3-DNA-streng	IDT		GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine kleurstof (Cy3)	Cytiva Life Sciences	PA23001
DiI	Invitrogen	D3911	Dil-kleuring (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanineperchloraat ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA-connectorstreng 1	Sigma Aldrich		GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC T
DNA-connectorstreng 2	Sigma Aldrich		CGGACGCAATAGCAGCTCACAG TCGGTCACAT
DNA-tocoferolsteng	Biomers		Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000	Avanti	880130	1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleenglycol)-2000] (ammoniumzout)
Dubbelzijdige tape	3M	LF93010LE
Boorbits (met diamantcoating)			0,5 - 1 mm
Boormachine	Dremel	220	Werkstation
EMCCD	Andor	DU-897U-CS0-#BV
Fluorescentiekralen	Invitrogen	F10720
Glasplaatjes	Blue Star		Micro Slides, PIC-1
Glazen flesjes	Sigma	854190
Waterstofperoxide	Lobachemie	00182	30%-oplossing, AR-kwaliteit
Labolene	Thermo-Fischer Scientific		Detergent
Laser 532 nm	Coherent	Sapphire
Lasersnijder	Universal Laser Systems	ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE	Avanti	810150	1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammoniumzout)
Methanol	Finar Chemicals	30932LL025
Microscoop	Olympus	IX81
Fosfaatbufferoplossing (PBS)			1X
Plasmareiniger	Harrick Plasma Inc	PDC-002
POPC	Avanti	850457	1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholine
Programmeerbare injectiepomp	New Era Pump Systems	NE1010	Hogedrukinjectiepomp
PTFE-doppen	Sigma	27141
PTFE-slangen	Cole-Parmer	WW-06417-21	Masterflex, 0,022" ID x 0,042" OD
Zwavelzuur	SD Fine Chemicals		98%, AR-kwaliteit
TIRF-objectief	Olympus	UPLAPO100XOHR
Vacuumdroger	Tarsons
Vortexmixer	Tarsons