Het huidige protocol beschrijft het gebruik van isotherme titratiecalorimetrie (ITC) om de associatie en dissociatiekinetiek van de binding tussen een DNA-aptamer en tetracycline te analyseren, inclusief monstervoorbereiding, lopende normen en monsters, en het interpreteren van de resulterende gegevens.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het bepalen van de thermodynamische en kinetische associatie van een DNA-aptamer en tetracycline met behulp van isothermische titratiecalorimetrie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De bepaling van bindingsaffiniteit en gedrag tussen een aptamer en zijn doel is de meest cruciale stap bij het selecteren en gebruiken van een aptamer voor toepassing. Vanwege de drastische verschillen tussen het aptamer en kleine moleculen, moeten wetenschappers veel moeite doen om hun bindende eigenschappen te karakteriseren. Isothermische titratiecalorimetrie (ITC) is hiervoor een krachtige aanpak. ITC gaat verder dan het bepalen van disassociatieconstanten (Kd) en kan de enthalpieveranderingen en bindende stoichiometrie van de interactie tussen twee moleculen in de oplossingsfase leveren. Deze benadering voert continue titratie uit met behulp van labelvrije moleculen en registreert de vrijgekomen warmte in de loop van de tijd bij de bindingsgebeurtenissen die door elke titratie worden geproduceerd, zodat het proces de binding tussen macromoleculen en hun kleine doelen gevoelig kan meten. Hierin introduceert het artikel een stapsgewijze procedure van de ITC-meting van een geselecteerde aptamer met een klein doelwit, tetracycline. Dit voorbeeld bewijst de veelzijdigheid van de techniek en het potentieel ervan voor andere toepassingen.
Inleiding
Aptameren zijn ssDNA- of RNA-fragmenten geselecteerd via een evolutieproces met een hoge bindingsaffiniteit en specificiteit voor de gewenste doelen 1,2, die kunnen werken als geavanceerde herkenningselementen of chemische antilichamen 3,4,5. De bindingsaffiniteit en specificiteit van aptameren aan hun doelen spelen dus een cruciale rol bij de selectie en toepassing van een aptamer, en isotherme titratiecalorimetrie (ITC) is op grote schaal gebruikt voor deze karakteriseringsdoeleinden. Veel benaderingen zijn gebruikt....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Figuur 2 toont de belangrijkste stappen van het ITC-experiment voor het bepalen van de thermodynamische en kinetische associatie van een DNA-aptamer en tetracycline.
1. Bereiding van monsters
OPMERKING: Monsters voor ITC moeten in dezelfde buffer worden bereid voor zowel het aptamer als het ligand om warmteafgifte te voorkomen die wordt veroorzaakt door het mengen van verschillende buffers uit de monstercel en spuit. Dit wordt meestal bereikt door dialyse van alle materialen in dezelfde buffer. De buffer wordt uitgewisseld met behulp van een protocol dat is ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
ITC biedt een nauwkeurige disassociatieconstante (Kd), de bindingsstoichiometrie en de thermodynamische parameters van interacties met twee moleculen6. In dit voorbeeld bindt de aptamer geselecteerd door Kim et al.9,11 aan tetracycline met bindingsaffiniteiten van Kd 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM. Interessant is dat deze binding werd bepaald met behulp van de evenwichtsfiltratiemethode .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De hier gepresenteerde methode is aangepast volgens de instructies van TA Instruments en is voldoende om de bindingsaffiniteit en thermodynamica van veel geselecteerde aptameren en doelen in ons centrum te bepalen. Cruciale stappen uit deze procedure zijn onder meer het uitwisselen van de buffer om een doel te hebben dat overeenkomt met het ligand, het uitvoeren van monsters met de juiste parameters en het vinden van het juiste bindingsmodel om de gegevens te analyseren. Continue registratie van warmteafgifte vereist het.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door de Research and Development Funding van Aptagen LLC.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' | Integrated DNA Technologies, Inc | De sequentie is overgenomen uit Gu's onderzoek, dat Kd niet heeft geïdentificeerd met behulp van ITC (zie verwijzingen 8 en 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermische titratiecalorimetrie systeem |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calciumchloride 1 M in waterige oplossing, biotechnologie kwaliteit, sterieel |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | De Eppendorf 5417R is onovertroffen in veiligheid, betrouwbaarheid en gebruiksgemak. Zeer gemakkelijk te onderhouden met een borstelloze motor die tot 16.400 RPM draait met een maximale RCF tot 25.000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | Deze degasser biedt een zelfstandig roerplatform, vacuümkamer, vacuümpoort, temperatuurregeling en elektronische timer voor de juiste monstervoorbereiding. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrofotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis spectrofotometer |
| Nanosep, Nanosep MF en NAB Centrifugale Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecuulgewicht afsluiting concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer met natriumfosfaat, natriumchloride, kaliumfosfaat en kaliumchloride Ultra-Pure Grade Sterile gefilterd met 0.2 µm filter. Autoclaved bij 121 °C voor meer dan 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifugebuizen | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochloride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
Referenties
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
