Methodenartikel

Het bepalen van de thermodynamische en kinetische associatie van een DNA-aptamer en tetracycline met behulp van isothermische titratiecalorimetrie

3.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64247

⸱

23 augustus 2022

 ,  , 
1Aptagen LLC

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft het gebruik van isotherme titratiecalorimetrie (ITC) om de associatie en dissociatiekinetiek van de binding tussen een DNA-aptamer en tetracycline te analyseren, inclusief monstervoorbereiding, lopende normen en monsters, en het interpreteren van de resulterende gegevens.

Samenvatting

De bepaling van bindingsaffiniteit en gedrag tussen een aptamer en zijn doel is de meest cruciale stap bij het selecteren en gebruiken van een aptamer voor toepassing. Vanwege de drastische verschillen tussen het aptamer en kleine moleculen, moeten wetenschappers veel moeite doen om hun bindende eigenschappen te karakteriseren. Isothermische titratiecalorimetrie (ITC) is hiervoor een krachtige aanpak. ITC gaat verder dan het bepalen van disassociatieconstanten (Kd) en kan de enthalpieveranderingen en bindende stoichiometrie van de interactie tussen twee moleculen in de oplossingsfase leveren. Deze benadering voert continue titratie uit met behulp van labelvrije moleculen en registreert de vrijgekomen warmte in de loop van de tijd bij de bindingsgebeurtenissen die door elke titratie worden geproduceerd, zodat het proces de binding tussen macromoleculen en hun kleine doelen gevoelig kan meten. Hierin introduceert het artikel een stapsgewijze procedure van de ITC-meting van een geselecteerde aptamer met een klein doelwit, tetracycline. Dit voorbeeld bewijst de veelzijdigheid van de techniek en het potentieel ervan voor andere toepassingen.

Inleiding

Aptameren zijn ssDNA- of RNA-fragmenten geselecteerd via een evolutieproces met een hoge bindingsaffiniteit en specificiteit voor de gewenste doelen 1,2, die kunnen werken als geavanceerde herkenningselementen of chemische antilichamen 3,4,5. De bindingsaffiniteit en specificiteit van aptameren aan hun doelen spelen dus een cruciale rol bij de selectie en toepassing van een aptamer, en isotherme titratiecalorimetrie (ITC) is op grote schaal gebruikt voor deze karakteriseringsdoeleinden. Veel benaderingen zijn gebruikt om de affiniteit van aptameren te bepalen, waaronder ITC, oppervlakteplasmonresonantie (SPR), colorimetrische titratie, thermoforese op microschaal (MST) en Bio-Layer Interferometry (BLI). Onder hen is ITC een van de nieuwste technieken om de thermodynamische en kinetische associatie van twee moleculen in de oplossingsfase te bepalen. Deze benadering voert continue titratie uit met behulp van labelvrije moleculen en registreert de vrijgekomen warmte in de loop van de tijd bij de bindingsgebeurtenissen die door elke titratie worden geproduceerd 6,7. In tegenstelling tot andere methoden kan ITC bindingsaffiniteit, verschillende bindingsplaatsen en thermodynamische en kinetische associatie bieden (figuur 1A). Op basis van deze initiële parameters worden de Gibbs vrije energieveranderingen en entropieveranderingen bepaald met behulp van de volgende relatie:

ΔG = ΔH-TΔS

Dat betekent dat ITC een compleet thermodynamisch profiel van de moleculaire interactie biedt om de bindingsmechanismen op te helderen (figuur 1B). Het bepalen van de bindingsaffiniteit voor kleine moleculen met een aptamer is moeilijk vanwege de drastisch verschillende groottes tussen aptamer en target. Ondertussen kan ITC gevoelige metingen uitvoeren zonder moleculen te labelen en te immobiliseren, wat een middel biedt om de natuurlijke structuur van het aptamer en het doel tijdens de meting te behouden. Met de genoemde attributen kan ITC worden gebruikt als de standaardmethode voor de karakterisering van binding tussen een aptamer en kleine doelen.

Na selectie door de Gu-groep werd deze aptamer geïntegreerd met verschillende platforms, waaronder elektrochemische op aptamer gebaseerde biosensoren, een competitieve enzymgebonden aptamer-assay en een microtiterplaat, die detectie met hoge doorvoer van tetracycline 8,9,10 kan bereiken. De bindingseigenschappen zijn echter niet goed genoeg opgehelderd om het juiste platform te kiezen8; het is de moeite waard om de binding van het aptamer aan het tetracycline te karakteriseren met behulp van ITC.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Figuur 2 toont de belangrijkste stappen van het ITC-experiment voor het bepalen van de thermodynamische en kinetische associatie van een DNA-aptamer en tetracycline.

1. Bereiding van monsters

OPMERKING: Monsters voor ITC moeten in dezelfde buffer worden bereid voor zowel het aptamer als het ligand om warmteafgifte te voorkomen die wordt veroorzaakt door het mengen van verschillende buffers uit de monstercel en spuit. Dit wordt meestal bereikt door dialyse van alle materialen in dezelfde buffer. De buffer wordt uitgewisseld met behulp van een protocol dat is aangepast aan het protocol van een 3 kDa molecular weight cutoff (MWC) concentrator met enkele wijzigingen, zoals hieronder:

  1. Activeer het membraan van de dialysekolom (3 kDa MWC) met 1x PBS, pH 7,4, gekocht bij de fabrikant, met behulp van de volgende stappen: vul met 1x buffer (PBS), equilibraat gedurende 10 minuten bij RT en centrifugeer bij 5.000 x g gedurende 15 minuten.
  2. Verwijder de buffer en laad 500 μL aptamermonsters in de kolom, centrifugeer bij 5.000 x g en herhaal deze 4x om de oorspronkelijke buffer te vervangen door 1x PBS. Wanneer de buffer door het membraan gaat, zullen alle moleculen met een massa van minder dan 3 kDa door het membraan gaan en zal het aptamer aan de bovenzijde van het membraan blijven.
  3. Verzamel de gedialyseerde DNA-aptamer met behulp van een pipet en breng deze over naar de nieuwe buis (en) van 1,5 ml.
  4. Verzamel de laatste flowthrough buffer om tetracycline op te lossen. Tetracycline poeder is puur en klein, dus dialyse is niet nodig. Gebruik echter de vorige gedialyseerde buffer voor DNA voor het doelwit om ervoor te zorgen dat de buffer voor het experiment in de spuit overeenkomt met de buffer in de referentiecel.
  5. Bepaal de aptamerconcentratie opnieuw met behulp van een UV-zichtbare spectrometer. Gebruik de laatste uitwisselingsbuffer om de concentratie aan te passen aan 40 μM tetracycline en 2 μM aptamer.
  6. Vouw het DNA-aptamer door gedurende 10 minuten te verwarmen op 90 °C, gedurende 10 minuten af te koelen bij 4 °C en vervolgens gedurende 20 minuten terug te keren naar RT.
  7. Ontgas het gevouwen aptamer en het gedialyseerde tetracycline met behulp van een ontgassingsstation of vacuümpomp ingesteld op 600 mmHg bij 25 °C gedurende 25 minuten om opgeloste gassen te elimineren.

2. Het instrument wassen en de testkit uitvoeren

  1. Reinig de oplosmiddelpoorten om ervoor te zorgen dat het volledige monsterpad vrij is. Reinig door de afvaloplossing weg te gooien en te laden met pure methanol, water en buffer. Elke poort bevat meer dan 250 ml om voldoende oplossing voor reiniging te garanderen.
    OPMERKING: Het reinigingsproces wordt automatisch voltooid door door de gebruiker programmeerbare ITC-besturingssoftware.
  2. Test de reinheid van de machine door ITC met behulp van buffer in een buffer uit te voeren (d.w.z. 1x PBS in 1x PBS).
    OPMERKING: Een normale ruisbasislijn is zichtbaar tussen de kleine buffer in bufferinjectiepieken. Wanneer de titratiespuit en canules voldoende zijn gereinigd en volledig droog, zal de basislijn stabiel zijn; een toename of afname van de basislijn weerspiegelt vuile instrumentatie of bellen in het instrument, die moeten worden gecorrigeerd voordat de werkelijke monsters worden uitgevoerd.
  3. Test de nauwkeurigheid van de machine met een standaardkit met EDTA en CaCl2 (figuur 3), met behulp van het standaardprogramma en volgens de instructies van de fabrikant.

3. Het monster uitvoeren om de binding tussen aptamer en tetracycline te bepalen

  1. Stel de loopparameters in: een roersnelheid van 200 tpm, draaiend op 25 °C, 2 μM aptamer en 40 μM tetracycline, 30 injecties met elk 2,0 μL, een vertragingstijd van 180 s.
  2. Controleer de vereiste volumes met behulp van een actieve programmacalculator. Voer met deze lopende parameter ITC-metingen uit met 230 μL 40 μM tetracycline in de ITC-spuit en 485 μL 2 μM aptamer in de ITC-monstercel met behulp van de ITC.
  3. Laad de gedialyseerde tetracycline spuitplaten en het gevouwen aptamer in de monstercel en vermijd bubbels met behulp van een pipet.
  4. Begin met het uitvoeren van het ITC-instrument door op de startknop in de software te klikken.
    OPMERKING: Het ITC-instrumentproces is volledig geautomatiseerd na het handmatig vullen van de referentiecel- en titrantmonsterplaten.

4. Gegevens analyseren met behulp van software

  1. Open de data-analysesoftware door te dubbelklikken om te beginnen met het analyseren van de gegevens.
  2. Open het pad van de opgeslagen onbewerkte gegevens om de neiging tot binding te kennen.
  3. Open het tabblad Modellering en gebruik verschillende bindingsmodellen om de beste pasvorm voor de gegevenscurve te vinden. Vervolgens berekent de software automatisch het ITC-thermogram en verschillende thermodynamische parameters, waaronder enthalpie (ΔH), entropie (ΔS), vrije energie (ΔG), evenwichtsbindingsconstante (Ka) en stoichiometrie.
  4. Verzamel de thermodynamische parameters die worden bepaald op basis van de gegevens en de informatie over het montagemodel.
  5. Maak een rapport, inclusief afbeeldingen van het ITC-thermogram en verschillende thermodynamische parameters, zoals weergegeven in figuur 4 en tabel 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

ITC biedt een nauwkeurige disassociatieconstante (Kd), de bindingsstoichiometrie en de thermodynamische parameters van interacties met twee moleculen6. In dit voorbeeld bindt de aptamer geselecteerd door Kim et al.9,11 aan tetracycline met bindingsaffiniteiten van Kd 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM. Interessant is dat deze binding werd bepaald met behulp van de evenwichtsfiltratiemethode ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hier gepresenteerde methode is aangepast volgens de instructies van TA Instruments en is voldoende om de bindingsaffiniteit en thermodynamica van veel geselecteerde aptameren en doelen in ons centrum te bepalen. Cruciale stappen uit deze procedure zijn onder meer het uitwisselen van de buffer om een doel te hebben dat overeenkomt met het ligand, het uitvoeren van monsters met de juiste parameters en het vinden van het juiste bindingsmodel om de gegevens te analyseren. Continue registratie van warmteafgifte vereist het...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door de Research and Development Funding van Aptagen LLC.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG
C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG
TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'		Integrated DNA Technologies, IncDe sequentie is overgenomen uit Gu's onderzoek, dat Kd niet heeft geïdentificeerd met behulp van ITC (zie verwijzingen 8 en 9)
Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold CellsTA Instruments61000.901Isothermische titratiecalorimetrie systeem
CaCl2Avantor (VWR)E506-100MLCalciumchloride 1 M in waterige oplossing, biotechnologie kwaliteit, sterieel
CentrifugeEppendorf5417RDe Eppendorf 5417R is onovertroffen in veiligheid, betrouwbaarheid en gebruiksgemak. Zeer gemakkelijk te onderhouden met een borstelloze motor die tot 16.400 RPM draait met een maximale RCF tot 25.000 x g.
Complete Degassing Station (110/230V)TA Instruments6326Deze degasser biedt een zelfstandig roerplatform, vacuümkamer, vacuümpoort, temperatuurregeling en elektronische timer voor de juiste monstervoorbereiding.
EDTATekNovaE0375EDTA 500 mM, pH 7.5
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrofotometerThermoFisherND-ONE-WUV-Vis spectrofotometer
Nanosep, Nanosep MF en NAB Centrifugale DevicesPall LaboratoryOD030C343 kDa molecuulgewicht afsluiting concentrator
PBS pH 7.4IBI ScientificIB70165Buffer met natriumfosfaat, natriumchloride, kaliumfosfaat en kaliumchloride Ultra-Pure Grade Sterile gefilterd met 0.2 µm filter. Autoclaved bij 121 °C voor meer dan 20 min.
Posi-Click 1.7 mL Large Cap MicrocentrifugebuizenlabForce (a Thomas Scientific Brand)1149K01
Tetracycline, HydrochlorideEMD Millipore CorperationCAS64-75-5

Referenties

  1. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  2. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  3. Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil. Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).
  4. Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1, 0076(2017).
  5. Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
  6. Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826(2020).
  7. Velazquez-Campoy, A., Freire, E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).
  8. Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).
  9. Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. Electrochemical aptasensor for tetracycline detection. Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).
  10. Wang, S., et al. Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey. Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).
  11. Kim, Y. S., et al. A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline. Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).
  12. Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer. Scientific Reports. 7, 43272(2017).
  13. Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation. Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).
  14. Sigurskjold, B. W. Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry. Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).
  15. Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer. Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).
  16. Turnbull, W. B., Daranas, A. H. On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).
  17. Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

DNA aptameerbindingtetracycline interactiebindingsaffiniteitthermodynamische parametersaptameervouwingbufferuitwisselingsequentieel bindingsmodelmicroscale thermophoresis

Gerelateerde artikelen