Methodenartikel

Flowcytometrie-analyse van hematopoëtische stam- en voorlopercellen van muizenbeenmerg en stromale nichecellen

DOI:

10.3791/64248

⸱

28 september 2022

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3S), Universidade do Porto, 2Department of Onco-Hematology, Instituto Português de Oncologia (IPO)-Porto, 3Unit of Biochemistry, Department of Biomedicine, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, 4Porto Comprehensive Cancer Center (P.CCC)

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de isolatie en kleuring van muriene beenmergcellen tot fenotype hemopoietische stam- en voorlopercellen, samen met de ondersteunende niche endotheel- en mesenchymale stamcellen. Een methode om cellen in endosteale en centrale beenmerggebieden te verrijken, is ook inbegrepen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het beenmerg (BM) is het zachte weefsel in botten waar voornamelijk hematopoiese, het proces waarbij nieuwe bloedcellen worden gegenereerd, optreedt. Als zodanig bevat het hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's), evenals ondersteunende stromale cellen die bijdragen aan het onderhoud en de regulatie van HSPC's. Hematologische en andere BM-aandoeningen verstoren de hematopoëse door hematopoietische cellen rechtstreeks en / of door de verandering van de BM-niche te beïnvloeden. Hier beschrijven we een methode om hematopoiese in gezondheid en maligniteit te bestuderen door middel van de fenotypische analyse van murine BM HSPCs en stromale nichepopulaties door flowcytometrie. Onze methode beschrijft de vereiste stappen om BM-cellen te verrijken in endosteale en centrale BM-fracties, evenals de juiste gatingstrategieën om de twee belangrijkste nicheceltypen te identificeren die betrokken zijn bij HSPC-regulatie, endotheelcellen en mesenchymale stamcellen. De fenotypische analyse die hier wordt voorgesteld, kan worden gecombineerd met muismutanten, ziektemodellen en functionele testen om het HSPC-compartiment en zijn niche te karakteriseren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Flowcytometrie is een methode van onschatbare waarde om immuun- en hematopoëtische cellen te karakteriseren en prospectief te isoleren. Het wordt ook steeds vaker gebruikt om stromale en epitheliale populaties van verschillende weefsels te analyseren. De hematopoëtische stamcel (HSC) heeft unieke eigenschappen van zelfvernieuwing en multipotentie. Bij volwassen zoogdieren bevinden HSC's zich voornamelijk in het beenmerg (BM), waar ze rust- en overlevingssignalen ontvangen van de omringende micro-omgeving of niche1. HSC's worden formeel gedefinieerd volgens functionele assays2. Niettemin hebben verschillende baanbrekende artikelen het nut van flowcytometrie aangetoond om HSC's te identificeren. Door het gebruik van markers met een beperkt celoppervlak is het mogelijk om hematopoëtische populaties te onderscheiden die sterk verrijkt zijn in HSC's3. Flowcytometrie is daarom een centrale methode in het stamcelveld. Het is uitgebreid gebruikt om de impact van vermeende nicheceltypen en nichefactoren op HSC's te evalueren. Door flowcytometrie te combineren met beeldvorming en functionele assays, is aangetoond dat HSC's kritisch worden ondersteund door perivasculaire mesenchymale stamcellen (MSC's) en endotheelcellen (EC's). BM MSC's zijn een heterogene groep en hebben verschillende cytokinebijdragen4, maar het is algemeen bekend dat leptinereceptor (LepR)+ MSC's belangrijke nichecellen zijn1. BM EC's zijn ook zeer heterogeen en kunnen deel uitmaken van sinusoïden, arteriolen en type H / overgangsvaten5. Verschillende studies hebben de genuanceerde bijdrage van deze verschillende EC's aangetoond. Endosteale sinusoïdale EC's liggen bijvoorbeeld ruimtelijk dichter bij rustige HSC's6, terwijl niet-migrerende HSC's met lagere niveaus van reactieve zuurstofsoorten zich in de buurt van arteriolar ECs7 bevinden. De endosteal versus centrale locatie van niches is ook erg belangrijk. Endosteale type H-vaten worden geassocieerd met perivasculaire stromale cellen die verloren gaan met veroudering, wat leidt tot het verlies van HSC's8. Bij acute myeloïde leukemie worden centrale EC's uitgebreid, terwijl endosteale vaten en endosteale HSC's verloren gaan9.

De meeste studies in het veld hebben zich gericht op hematopoëse zelf en op de extrinsieke regulatie van HSC's door de cel. Het is echter steeds meer erkend dat er behoefte is aan een betere karakterisering van de niches die andere voorlopers reguleren, namelijk multipotente voorlopers (MPP's), vooral gezien het feit dat zij de belangrijkste aanjagers zijn van hematopoiese in steady state10. In tegenstelling tot een vaste hiërarchische structuur, hebben recente studies aangetoond dat hematopoiese een continuüm is waarin HSC's in een vroeg stadium differentiëren in bevooroordeelde MPP's11. MPP's zijn vernoemd naar verschillende classificatieschema's12, maar een recent consensusdocument van de International Society for Experimental Hematology (ISEH) stelde voor dat MPP's worden gediscrimineerd als vroege MPP's en volgens hun lymfoïde (MPP-Ly), megakaryocytische en erytroïde (MPP-Mk / E) en myeloïde (MPP-G / M) bias13. Het gebruik van flowcytometrie zal van cruciaal belang zijn bij het verder bestuderen van het belang van BM-niches in de regulatie van deze populaties. Huidige flowcytometriemethoden gebruiken variabele gatingstrategieën om HSPC's te onderscheiden en stromale cellen, namelijk EC's, te identificeren met behulp van inconsistente markers. Het doel van de huidige methode is om een eenvoudige en reproduceerbare workflow van BM-kleuring te presenteren om HSPC-subpopulaties, heterogene groepen EC's en LepR + MSC's te identificeren. Wij geloven dat deze techniek, hoewel vergelijkbaar met eerder gerapporteerde methoden (zie bijvoorbeeld referentie 14), een bijgewerkt en eenvoudig te implementeren protocol biedt voor de fenotypische analyse van hematopoietische cellen in de twee functionele merggebieden, endosteal en centraal BM 8,15, evenals BM stromale nichecellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De dieren die in dit protocol werden gebruikt, werden gehuisvest in de i3S-dierenfaciliteit onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden in een licht-donkercyclus van 12 uur en een temperatuurgecontroleerde omgeving. Gratis toegang tot standaard knaagdier chow en water werd verstrekt. Alle dieren kregen humane zorg volgens de criteria van de Federation of European Laboratory Animal Science Associations voor de verzorging en behandeling van proefdieren (EU-richtlijn 2010/63/EU). De experimentele procedure uitgevoerd op de dieren (euthanasie) werd goedgekeurd door de i3S Animal Ethics Committee (ref. DD_2019_15) en de Direção-Geral de Alimentação e Veterinária. Details van de materialen die in dit protocol worden gebruikt, zijn te vinden in de Materiaaltabel.

1. Bereiding van oplossingen en kleuringscocktails

  1. Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS): Los vijf PBS-tabletten op in 1 l gedestilleerd water. Bewaren bij kamertemperatuur (RT).
  2. PBS 2% foetaal runderserum (FBS): Voeg 10 ml FBS toe aan 500 ml PBS. Bewaren bij 4 °C.
  3. Rode bloedcel (RBC) lysisbuffer (1x): Voeg 50 ml 10x RBC lysisbuffer toe aan 450 ml gedeïoniseerd water. Bewaren bij 4 °C.
  4. Collagenase IV en dispase II-oplossing: Los 30 mg collagenase IV en 60 mg dispase II op in 30 ml HBSS voor een collagenase IV-oplossing van 1 mg/ml en 2 mg/ml dispase II. Vers bereiden voor gebruik.
  5. Fc receptoren blokkerende oplossing: Voeg 10 μL gezuiverd anti-muis CD16/32 antilichaam toe aan 490 μL PBS 2% FBS. Bereid vers of op de vorige dag. Bewaren bij 4 °C tot gebruik.
  6. Fluorescerende cel levensvatbaarheid kleurstof kleuringsoplossing: Voeg 2 μL fluorescerende cel levensvatbaarheid kleurstof toe aan 1 ml PBS. Vers bereiden voor gebruik.
  7. Biotine afstammingscocktail: Meng 100 μL van elk van de volgende antilichamen: biotine anti-muis CD3ε, biotine anti-muis CD4, biotine anti-muis CD8a, biotine anti-muis/humaan CD11b, biotine anti-muis/humaan CD45R/B220, biotine anti-muis Ly-6G/Ly-6C (Gr-1), en biotine anti-muis TER-119/erytroïde cellen. Bewaren bij 4 °C tot gebruik.
  8. HSC's primaire kleuringscocktail: Voeg 10 μL biotinelijncocktail, 10 μL immunofluorescent gelabeld 510 antimuis CD150 (SLAM), 10 μL fycoerythrin (PE) antimuis Flk2 (CD135), 10 μL peridinine-chlorofyl-eiwit (PerCP) anti-muis Ly-6A/E (Sca-1), 10 μL PE/Cyanine7 antimuis CD48 en 10 μL allophycocyanine (APC)/Cyanine7 antimuis CD117 (c-kit) toe aan 940 μL PBS 2% FBS. Bereid vers of op de vorige dag. Bewaren bij 4 °C beschermd tegen licht tot gebruik.
  9. Stromale primaire kleuringscocktail: Voeg 5 μl muis leptine R gebiotinyleerd antilichaam, 6,7 μl PE antimuis endomucine antilichaam, 10 μl PerCP anti-muis Ly-6A/E (Sca-1), 4 μL PE/Cyanine7 antimuis CD31, 10 μL APC/Cyanine7 anti-muis CD45 en 10 μL APC/Cyanine7 anti-muis TER-119/erytroïde cellen toe aan 954 μL PBS 2% FBS. Bereid vers of op de vorige dag. Bewaren bij 4 °C beschermd tegen licht tot gebruik.
  10. HSC's/stromale secundaire kleuringsoplossing: Voeg 1 μL APC streptavidin toe aan 1 ml PBS 2% FBS. Bereid vers of op de vorige dag. Bewaren bij 4 °C beschermd tegen licht tot gebruik.
  11. ECs-kleuringscocktail: Voeg 10 μL PE antimuis-endomucine-antilichaam, 10 μL PerCP-antimuis Ly-6A / E (Sca-1), 10 μL PE / Cyanine7 antimuis CD31, 10 μL Alexa Fluor 647 antimuis CD54 / ICAM-1, 10 μL APC / Cyanine7 antimuis CD45 en 10 μL APC / Cyanine7 anti-muis TER-119 / erytroïde cellen toe aan 940 μL PBS 2% FBS. Bereid vers of op de vorige dag. Bewaren bij 4 °C beschermd tegen licht tot gebruik.
  12. DAPI-kleuringsoplossing: Voeg 1 druppel DAPI-reagens toe aan 500 μL PBS. Vers bereiden voor gebruik.

2. Monsterextractie

  1. Euthanaseer het dier door cervicale dislocatie (details van de dieren die zijn gebruikt om de in dit onderzoek gepresenteerde gegevens te produceren, zijn te vinden in aanvullende tabel 1). Leg het dier met de buik omhoog op een petrischaaltje en spuit met 70% ethanol. Maak een snee boven de buik met een schaar en trek de huid helemaal weg tot aan de enkels.
  2. Pak een poot en knip met een schaar aan de onderkant (waar het gewricht tussen het been en de heup is) om het van het dier te scheiden. Deze stap zal ook dienen als secundaire bevestigingsmethode van euthanasie. Verwijder de voet van het been door bij de enkel te snijden. Plaats het been in ijskoude PBS 2% FBS. Herhaal indien nodig de stap met het andere been.
  3. Pak het heupbeen vast en knip er met een schaar achter om het van het dier te scheiden. Plaats het heupbeen in ijskoude PBS 2% FBS. Herhaal indien nodig de stap met het andere heupbeen.
  4. Plaats de poot(en) en heupbot(en) in een petrischaaltje en reinig met een steriel scalpel de botten. Scheid het scheenbeen en het dijbeen door met het scalpel bij de knie te snijden. Leg de schone botten in ijskoud PBS 2% FBS.

3. Monsterverwerking voor analyse van hematopoëtische celpopulaties in totaal beenmerg

  1. Plaats een dijbeen of scheenbeen in een vijzel met ijskoude PBS 2% FBS en plet het bot door het zachtjes tegen de wand van de mortel te drukken met behulp van de stamper. BM-cellen worden vrijgegeven in de oplossing in de mortel.
  2. Pipetteer de resulterende celsuspensie op en neer met behulp van een pipet van 10 ml om te homogeniseren en over te brengen in een buis van 50 ml via een celzeef van 40 μm die bovenop de buis is geplaatst.
  3. Als de verbrijzelde botten er op dit punt niet wit uitzien, voeg dan meer PBS 2% FBS toe aan de mortel en herhaal het verpletteren, en pipetteer vervolgens op en neer en breng de oplossing over in dezelfde buis van 50 ml door dezelfde 40 μm celzeef.
  4. Spoel de mortel af met wat meer PBS 2% FBS en breng de oplossing over in dezelfde buis van 50 ml door dezelfde 40 μm celzeef. Centrifugeer de buis van 50 ml bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  5. Gooi het supernatant weg en resuspensie de celkorrel in 5 ml RBC-lysisbuffer (1x) bij RT door meerdere keren op en neer te pipetteren. Voeg na een incubatie van 2 minuten bij RT 15 ml PBS 2% FBS toe.
  6. Centrifugeer de buis van 50 ml bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Als de celkorrel er nog steeds roodachtig uitziet, gaat u terug naar stap 3.5. Zo niet, gooi het supernatant dan weg, resuspensie van de pellet in 200 μL PBS en breng de celsuspensie over in een put van een 96-well V-bodemplaat voor kleuring.
  7. Centrifugeer de plaat op 500 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg door de plaat op absorberend papier te draaien en resuspensie van de pellet in 200 μL fluorescerende kleurstofkleuringsoplossing. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij RT in het donker.
  8. Centrifugeplaat bij 500 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg door de plaat op absorberend papier te draaien en resuspensie van de pellet in 200 μL PBS 2% FBS om te wassen.
  9. Centrifugeer de plaat gedurende 3 minuten bij 4 °C op 500 x g , gooi het supernatant weg door de plaat op absorberend papier te draaien en resuspendien de pellet in 100 μL Fc-receptoren blokkerende oplossing. Incubeer de plaat gedurende 10 minuten bij 4 °C beschermd tegen licht.
  10. Voeg 100 μL PBS 2% FBS toe en pipetteer een paar keer op en neer om te wassen. Centrifugeer de plaat gedurende 3 minuten bij 4 °C op 500 x g , gooi het supernatant weg door de plaat op absorberend papier te draaien en resuspensie van de pellet in 100 μL primaire kleuringscocktail van HSC's. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij RT in het donker.
  11. Voeg 100 μL PBS 2% FBS toe en pipetteer een paar keer op en neer om te wassen. Centrifugeer de plaat gedurende 3 minuten bij 4 °C bij 500 x g , gooi het supernatant weg door de plaat op absorberend papier te draaien en resuspensie van de pellet in 100 μL secundaire kleuringsoplossing HSC's. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij RT in het donker.
  12. Voeg 100 μL PBS 2% FBS toe en pipetteer een paar keer op en neer om te wassen. Centrifugeer de plaat gedurende 3 minuten bij 4 °C op 500 x g en gooi het supernatant weg door de plaat op absorberend papier te draaien.
  13. Resuspensie van de pellet in 250 μL PBS 2% FBS en breng de celsuspensie over in een 5 ml polystyreen buis met ronde bodem door een 40 μm celzeef. Blijf op ijs beschermd tegen licht tot flowcytometrie-analyse.
    OPMERKING: Als u geïnteresseerd bent in het bepalen van de absolute aantallen hematopoëtische celpopulaties, voeg dan Calibrite Beads toe aan de polystyreenbuizen vóór analyse in de cytometer16.

4. Monsterverwerking voor de analyse van stromale celpopulaties in totaal beenmerg

  1. Plaats een dijbeen of scheenbeen in een vijzel met ijskoude PBS 2% FBS en plet het bot door het zachtjes tegen de wand van de mortel te drukken met behulp van de stamper. Knip de punt van een P1000-punt met een schaar en gebruik deze om alle inhoud van de mortel over te brengen in een buis van 50 ml (ga niet door een celzeef).
  2. Centrifugeer de buis van 50 ml bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, gooi het supernatant weg en resuspensie de pellet in 3 ml collagenase IV en dispase II-oplossing. Incubeer de buis bij 37 °C gedurende 40 min.
  3. Vul de buis aan tot 25 ml met PBS 2% FBS en vortex om te mengen. Breng de inhoud van de buis van 50 ml over naar een nieuwe buis van 50 ml door een celzeef van 100 μm. Voeg 15 ml PBS 2% FBS toe aan de oude buis van 50 ml en breng de oplossing over in dezelfde nieuwe buis van 50 ml door dezelfde celzeef. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  4. Gooi het supernatant weg en resuspensie de celkorrel in 5 ml RBC-lysisbuffer (1x) bij RT door meerdere keren op en neer te pipetteren. Voeg na een incubatie van 2 minuten bij RT 15 ml PBS 2% FBS toe.
  5. Centrifugeer de buis van 50 ml bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Als de celkorrel er nog steeds roodachtig uitziet, gaat u terug naar stap 4.4. Zo niet, gooi het supernatant dan weg, resuspensie van de pellet in 200 μL PBS 2% FBS en breng de celsuspensie over in een put van een 96-well V-bodemplaat voor kleuring. Centrifugeer de plaat op 500 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
  6. Als u stromale kleuring uitvoert, gaat u verder met stap 4.7. Als u EC-kleuring uitvoert, gaat u verder met stap 4.12.
  7. Gooi het supernatant weg door de plaat op absorberend papier te draaien en resuspensie van de pellet in 100 μL stromale primaire kleuringscocktail. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij RT in het donker.
  8. Voeg 100 μL PBS 2% FBS toe en pipetteer een paar keer op en neer om te wassen. Centrifugeer de plaat gedurende 3 minuten bij 4 °C op 500 x g , gooi het supernatant weg door de plaat op absorberend papier te draaien en resuspensie van de pellet in 100 μL stromale secundaire kleuringsoplossing. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij RT in het donker.
  9. Voeg 100 μL PBS 2% FBS toe en pipetteer een paar keer op en neer om te wassen. Centrifugeer de plaat op 500 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg door de plaat om te draaien op absorberend papier.
  10. Resuspensie van de pellet in 250 μL PBS 2% FBS en breng de celsuspensie over in een 5 ml polystyreen buis met ronde bodem door een 40 μm celzeef. Blijf op ijs beschermd tegen licht.
  11. Voeg vlak voordat u naar de cytometer gaat 35 μL DAPI-kleuringsoplossing toe aan de buis met de celsuspensie voor flowcytometrie-analyse en incuber de buis bij RT gedurende 5 minuten in het donker. Na deze incubatie op ijs houden beschermd tegen licht tot flowcytometrie-analyse.
  12. Gooi het supernatant weg door de plaat op absorberend papier te draaien en resuspensie van de pellet in 100 μL ECs-kleuringscocktail. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij RT in het donker.
  13. Voeg 100 μL PBS 2% FBS toe en pipetteer een paar keer op en neer om te wassen. Centrifugeer de plaat op 500 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
  14. Gooi het supernatant weg door de plaat om te draaien op absorberend papier. Resuspensie van de pellet in 250 μL PBS 2% FBS en breng de celsuspensie over in een 5 ml polystyreen buis met ronde bodem door een 40 μm celzeef. Blijf op ijs beschermd tegen licht.
  15. Voeg vlak voordat u naar de cytometer gaat 35 μL DAPI-kleuringsoplossing toe aan de buis met de celsuspensie voor flowcytometrie-analyse en incuber de buis bij RT gedurende 5 minuten in het donker. Na deze incubatie op ijs houden beschermd tegen licht tot flowcytometrie-analyse.
    OPMERKING: Als u geïnteresseerd bent in het bepalen van de absolute aantallen stromale en endotheelcelpopulaties, voeg dan Calibrite Beads toe aan de polystyreenbuizen vóór analyse in de cytometer16.

5. Monsterverwerking voor de analyse van hematopoëtische celpopulaties in gemalen en gespoelde BM

  1. Plaats een dijbeen op een petrischaaltje en snijd de uiteinden van het bot af met een steriel scalpel.
  2. Spoel het centrale deel van het bot (diafyse) door 100 μL PBS 2% FBS eenmaal van elke kant door de binnenkant van het bot te laten lopen met behulp van een insulinespuit zonder dood volume 0,5 ml en de oplossing te verzamelen in een microcentrifugebuis met 1 ml PBS 2% FBS. Breng vervolgens de celsuspensie over in een buis van 50 ml met het label gespoelde BM met 4 ml PBS 2% FBS. Blijf op ijs.
  3. Plaats de uiteinden van het bot in een vijzel met ijskoude PBS 2% FBS en plet door het zachtjes tegen de mortelwand te drukken met behulp van de stamper. Pipetteer de resulterende celsuspensie op en neer met behulp van een pipet van 10 ml om te homogeniseren en over te brengen in een buis van 50 ml met het label geplet BM door een celzeef van 40 μm.
  4. Als het verbrijzelde bot er op dit punt niet wit uitziet, voeg dan meer PBS 2% FBS toe aan de mortel en herhaal het verpletteren. Pipet vervolgens op en neer en breng de oplossing over in dezelfde buis van 50 ml (gemalen BM) door dezelfde 40 μm celzeef.
  5. Spoel de mortel af met wat meer PBS 2% FBS en breng de oplossing over in dezelfde buis van 50 ml (gemalen BM) door dezelfde 40 μm celzeef.
  6. Centrifugeer de buizen van 50 ml die overeenkomen met de gespoelde en gemalen monsters bij 500 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
  7. Volg stap 3.5 tot en met 3.13 (rubriek 3) met de gespoelde en gemalen BM-monsters.

6. Voorbereiding van single-color controls (SCC's) voor flowcytometrie-analyse

  1. Volg de stappen 3.1 tot en met 3.6 (rubriek 3) met een extra bot van een van de dieren die niet voor de hoofdanalyse zijn gebruikt, waarbij de uiteindelijke celsuspensie wordt overgebracht in een microcentrifugebuis met 1 ml PBS 2% FBS in plaats van een put van een 96-well V-bodemplaat.
  2. Breng 100 μL van de celsuspensie over in 8 putjes van een 96-well V-bodemplaat, 100 μL in een 5 ml polystyreen rondbodembuis met 100 μL PBS 2% FBS gelabeld als DAPI SCC, en de resterende celsuspensie in een 5 ml polystyreen rondbodembuis met 100 μL PBS 2% FBS gelabeld als onbevlekt. Houd de buizen op ijs beschermd tegen licht.
  3. Centrifugeer de plaat gedurende 3 minuten bij 4 °C op 500 x g en gooi de supernatanten weg door de plaat op absorberend papier te draaien.
  4. Resuspendeer één pellet in 100 μL fluorescerende kleurstofkleuringsoplossing en de resterende in 100 μL PBS 2% FBS.
  5. Voeg 0,5 μl van de volgende antilichamen toe, afgezien van de afstammingscocktail van antilichamen waarvoor 2 μl en het PECy7 CD31-antilichaam waarvoor 0,3 μl wordt toegevoegd, aan elk van de putjes met celsuspensie in PBS 2% FBS (één antilichaam per put, dezelfde antilichamen die worden gebruikt in de hoofdanalysepanelen of dezelfde fluorofoorantilichamen met vergelijkbare fluorescentie-intensiteit en epitoop-abundantie): biotine afstammingscocktail, immunofluorescent gelabeld 510 anti-muis CD150 (SLAM), PE anti-muis Flk2 (CD135), PerCP anti-muis Ly-6A/E (Sca-1), immunofluorescent gelabeld 647 anti-muis CD54/ICAM-1, PE/Cyanine7 anti-muis CD48, en APC/Cyanine7 anti-muis CD117 (c-kit). Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij RT in het donker.
  6. Voeg 100 μL PBS 2% FBS toe aan elke put en pipet een paar keer op en neer om te wassen. Centrifugeer de plaat gedurende 3 minuten bij 4 °C op 500 x g en gooi de supernatanten weg door de plaat op absorberend papier te draaien.
  7. Resuspendeer alle pellets, behalve die welke overeenkomt met de cellen die zijn geïncubeerd met de afstammingscocktail van antilichamen in 180 μL PBS 2% FBS en breng de celsuspensies over in 5 ml polystyreen buisjes met ronde bodem door 40 μm celzeven. Blijf op ijs beschermd tegen licht tot flowcytometrie-analyse.
  8. Resuspendeer de cellen geïncubeerd met de afstammingscocktail van antilichamen in 100 μL HSC's / stromale secundaire kleuringsoplossing. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij RT in het donker.
  9. Voeg 100 μL PBS 2% FBS toe en pipetteer een paar keer op en neer om te wassen. Centrifugeer de plaat op 500 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
  10. Resuspendeer de pellet in 180 μL PBS 2% FBS en breng de celsuspensie over in een 5 ml polystyreen buis met ronde bodem door een 40 μm celzeef. Blijf op ijs beschermd tegen licht tot flowcytometrie-analyse.
  11. Voeg vlak voordat u naar de cytometer gaat 35 μL DAPI-kleuringsoplossing toe aan de DAPI SCC-buis en incuber de buis bij RT gedurende 5 minuten in het donker. Na deze incubatie op ijs houden beschermd tegen licht tot flowcytometrie-analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Representatieve plots van flowcytometrie-analyse van HSC's en MPP's in een gezonde jongvolwassen C57Bl/6-muis zijn weergegeven in figuur 1. De gating-strategie volgt de meest recente harmonisatienomenclatuur die door de ISEH13 is voorgesteld. Bij het analyseren van de impact van een verstoring, zoals infectie of kanker, is het belangrijk om een controlemuis te gebruiken als referentie voor normale poorten. Fluorescentie-minus-één (FMO) controles kunnen bijzonder nutti...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel het beschreven protocol eenvoudig en gemakkelijk uit te voeren is, moet speciale aandacht worden besteed aan specifieke stappen. Bij het verkrijgen van gespoelde BM (stap 5.2) mag bijvoorbeeld het volume of het aantal keren dat is aangegeven om PBS 2% FBS door de binnenkant van het centrale deel van het bot te passeren, niet worden overschreden, omdat dit kan leiden tot aanzienlijke verontreiniging van het gespoelde monster door endosteale celpopulaties.

Wijzigingen in het protocol kunn...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LM werd ondersteund door een subsidie van de Lady Tata Memorial Trust. JR werd ondersteund door een PhD fellowship van Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; FCT fellowship UI/BD/150833/2021). ML werd ondersteund door een PhD fellowship van FCT (FCT fellowship 2021.04773.BD). DD werd ondersteund door subsidies van de American Society of Hematology, de Pablove Foundation, FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) en de Portugese Vereniging voor Hematologie. We danken de steun van Dr. Catarina Meireles en Emilia Cardoso van TRACY faciliteit op i3s.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibodyBioLegend116114
APC StreptavidinBioLegend405207
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibodyBioLegend105826
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibodyBioLegend103116
APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibodyBioLegend116223
Biotin anti-mouse CD3ε antibodyBioLegend100304
Biotin anti-mouse CD4 antibodyBioLegend100404
Biotin anti-mouse CD8a antibodyBioLegend100704
Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibodyBioLegend108404
Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibodyBioLegend116204
Biotin anti-mouse/human CD11b antibodyBioLegend101204
Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibodyBioLegend103204
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibodyBioLegend115929
Calibrite 2 Color BeadsBD Biosciences349502
Collagenase IVMerck Life ScienceC1889
Dispase IIMerck Life ScienceD4693
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America OriginThermoFisher Scientific10500064
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)ThermoFisher Scientific14175095
Mouse Leptin R Biotinylated AntibodyR&D systemsBAF497
NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI)ThermoFisher ScientificR37606DAPI reagent
PE anti-mouse endomucin antibodyThermoFisher Scientific12-5851-82
PE anti-mouse Flk2 (CD135)ThermoFisher Scientific12-1351-82
PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibodyBioLegend102524
PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibodyBioLegend103424
PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibodyBioLegend108122
Phosphate-buffered saline (PBS) tabletsMerck Life ScienceP4417
Purified anti-mouse CD16/32 antibodyBioLegend101302
RBC lysis buffer 10xBioLegend420302
Zombie Violet Fixable Viability DyeBioLegend423114fluorescent dye

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
  2. Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
  3. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  4. Asada, N., et al. Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches. Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).
  5. Mosteo, L., et al. The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189(2021).
  6. Christodoulou, C., et al. Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells. Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).
  7. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  8. Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
  9. Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
  10. Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
  11. Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  12. Pietras, E. M., et al. Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
  13. Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification. Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).
  14. Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
  15. Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
  16. Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).
  17. Akinduro, O., et al. Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space. Nature Communications. 9 (1), 519(2018).
  18. Beerman, I., et al. Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).
  19. Gomariz, A., et al. Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2532(2018).
  20. Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nature Communications. 9 (1), 2449(2018).
  21. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936(2016).
  22. Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
  23. DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).
  24. Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).
  25. Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells. PLoS One. 10 (4), 0124661(2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Beenmergcellenhematopo tische stamcellenendosteaal beenmergcentraal beenmergmesenchymale stamcellenendotheelcellenfenotypische analyse

Gerelateerde artikelen