Experimentele kwantificering van interacties tussen medicijnafgiftesystemen en cellen in vitro: een gids voor preklinische nanogeneeskunde-evaluatie

Summary

Een workflow wordt gedemonstreerd voor de absolute kwantificering van geneesmiddeldrager-celinteracties met behulp van flowcytometrie om een betere rationele evaluatie van nieuwe medicijnafgiftesystemen mogelijk te maken. Deze workflow is van toepassing op drugsdragers van elk type.

Abstract

Een belangrijk onderdeel van het ontwerpen van medicijnafgiftesystemen betreft het versterken of verzwakken van interacties met specifieke celtypen. Een chemotherapeuticum kan bijvoorbeeld worden gefunctionaliseerd met een antilichaam om de binding aan kankercellen te verbeteren ("targeting") of gefunctionaliseerd met polyethyleenglycol om immuuncelherkenning te helpen ontwijken ("stealth"). Zelfs op cellulair niveau is het optimaliseren van de binding en opname van een medicijndrager een complex biologisch ontwerpprobleem. Het is dus waardevol om te scheiden hoe sterk een nieuwe drager interageert met een cel en de functionele effectiviteit van de lading van een vervoerder zodra deze in die cel is afgeleverd.

Om het chemotherapeutische voorbeeld voort te zetten, "hoe goed het bindt aan een kankercel" is een ander probleem dan "hoe goed het een kankercel doodt". Kwantitatieve in vitro assays voor de laatste zijn goed ingeburgerd en zijn meestal afhankelijk van het meten van de levensvatbaarheid. Het meeste gepubliceerde onderzoek naar cel-dragerinteracties is echter kwalitatief of semikwantitatief. Over het algemeen zijn deze metingen afhankelijk van fluorescerende etikettering van de drager en rapporteren bijgevolg interacties met cellen in relatieve of willekeurige eenheden. Dit werk kan echter worden gestandaardiseerd en absoluut kwantitatief worden gemaakt met een klein aantal karakteriseringsexperimenten. Een dergelijke absolute kwantificering is waardevol, omdat het rationele, inter- en intra-class vergelijkingen van verschillende medicijnafgiftesystemen - nanodeeltjes, microdeeltjes, virussen, antilichaam-geneesmiddelconjugaten, gemanipuleerde therapeutische cellen of extracellulaire blaasjes - vergemakkelijkt.

Bovendien is kwantificering een voorwaarde voor latere meta-analyses of in silico-modelleringsbenaderingen. In dit artikel worden videogidsen gepresenteerd, evenals een beslisboom voor het bereiken van in vitro kwantificering voor carrier drug delivery-systemen, die rekening houden met verschillen in dragergrootte en etiketteringsmodaliteit. Daarnaast worden verdere overwegingen voor de kwantitatieve beoordeling van geavanceerde toedieningssystemen voor geneesmiddelen besproken. Dit is bedoeld als een waardevolle bron om rationele evaluatie en ontwerp voor de volgende generatie geneeskunde te verbeteren.

Introduction

Het ontwerp van medicijnafgifteconstructies die specifiek, ontworpen gedrag vertonen, afhankelijk van welk celtype ze tegenkomen, heeft aanzienlijke onderzoeksinteresse getrokken. Potentiële medicijnafgifteconstructies of "dragers" omvatten lipideformuleringen, nanogekweekte anorganische, polymere assemblages, extracellulaire blaasjes, gefunctionaliseerde bacteriële cellen of gemodificeerde virussen. Al deze kunnen orgaan-, weefsel- of celspecificiteit vertonen als gevolg van fysische eigenschappen, oppervlakte-eigenschappen of gemanipuleerde chemische functionalisaties zoals antilichaamaanhechting ^1,2.

Protocol

1. De juiste stream kiezen

1. Volg de beslisboom in figuur 1 om de beste workflow (stream) (figuur 2) te bepalen voor de gebruikte experimentele opstelling. Raadpleeg de discussie voor meer commentaar op deze streamkeuze.
2. Als u de cytometerstroom volgt, gaat u verder met stap 2.1.1-2.2.7. Als u de bulkstream volgt, gaat u verder met stappen 3.1.1.1-3.1.5.7.

Figu....

Results

Zoals eerder besproken, vereisen verschillende soorten medicijndragers het gebruik van verschillende technieken voor de absolute kwantificering van celdragerassociatie. Bijvoorbeeld, 633 nm disulfide-gestabiliseerde poly (methacrylzuur) (PMA_SH) kern-schil deeltjes zijn groot en dicht genoeg voor detectie met behulp van een gevoelige flowcytometer. Als zodanig werden deze deeltjes fluorescerend gelabeld, vervolgens omheind en geteld met behulp van zijhoeklichtverstrooiing (SALS, analoog aan SSC), evenals het ju.......

Discussion

Het karakteriseren van de interacties tussen medicijndragers en cellen wordt steeds belangrijker bij de ontwikkeling van nieuwe medicijnafgiftesystemen. Specifiek, om de rationele evaluatie en vergelijking van verschillende dragerconstructies mogelijk te maken, is absolute kwantificering van de prestaties van die drager om te interageren met doel- en off-target cellen van cruciaal belang. Dit protocol beschrijft een tweestromenmethodologie waarmee elke onderzoeker die met een medicijndrager werkt, relatieve, semikwantifi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Invitrogen	A20347	pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies
Apogee A50 Microflow	Apogee		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting
CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments
FCS Express	De Novo Software		Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PRO	Tecan Lifesciences		Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Biosciences		Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment
NanoSight NS300	Malvern Panalytical		Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis
Prism 8	GraphPad		Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others
Quantum MESF kits Alexa Fluor 647	Bangs Laboratories	647	Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard