Experimentele kwantificering van interacties tussen medicijnafgiftesystemen en cellen in vitro: een gids voor preklinische nanogeneeskunde-evaluatie

Summary

Een workflow wordt gedemonstreerd voor de absolute kwantificering van geneesmiddeldrager-celinteracties met behulp van flowcytometrie om een betere rationele evaluatie van nieuwe medicijnafgiftesystemen mogelijk te maken. Deze workflow is van toepassing op drugsdragers van elk type.

Abstract

Een belangrijk onderdeel van het ontwerpen van medicijnafgiftesystemen betreft het versterken of verzwakken van interacties met specifieke celtypen. Een chemotherapeuticum kan bijvoorbeeld worden gefunctionaliseerd met een antilichaam om de binding aan kankercellen te verbeteren ("targeting") of gefunctionaliseerd met polyethyleenglycol om immuuncelherkenning te helpen ontwijken ("stealth"). Zelfs op cellulair niveau is het optimaliseren van de binding en opname van een medicijndrager een complex biologisch ontwerpprobleem. Het is dus waardevol om te scheiden hoe sterk een nieuwe drager interageert met een cel en de functionele effectiviteit van de lading van een vervoerder zodra deze in die cel is afgeleverd.

Om het chemotherapeutische voorbeeld voort te zetten, "hoe goed het bindt aan een kankercel" is een ander probleem dan "hoe goed het een kankercel doodt". Kwantitatieve in vitro assays voor de laatste zijn goed ingeburgerd en zijn meestal afhankelijk van het meten van de levensvatbaarheid. Het meeste gepubliceerde onderzoek naar cel-dragerinteracties is echter kwalitatief of semikwantitatief. Over het algemeen zijn deze metingen afhankelijk van fluorescerende etikettering van de drager en rapporteren bijgevolg interacties met cellen in relatieve of willekeurige eenheden. Dit werk kan echter worden gestandaardiseerd en absoluut kwantitatief worden gemaakt met een klein aantal karakteriseringsexperimenten. Een dergelijke absolute kwantificering is waardevol, omdat het rationele, inter- en intra-class vergelijkingen van verschillende medicijnafgiftesystemen - nanodeeltjes, microdeeltjes, virussen, antilichaam-geneesmiddelconjugaten, gemanipuleerde therapeutische cellen of extracellulaire blaasjes - vergemakkelijkt.

Bovendien is kwantificering een voorwaarde voor latere meta-analyses of in silico-modelleringsbenaderingen. In dit artikel worden videogidsen gepresenteerd, evenals een beslisboom voor het bereiken van in vitro kwantificering voor carrier drug delivery-systemen, die rekening houden met verschillen in dragergrootte en etiketteringsmodaliteit. Daarnaast worden verdere overwegingen voor de kwantitatieve beoordeling van geavanceerde toedieningssystemen voor geneesmiddelen besproken. Dit is bedoeld als een waardevolle bron om rationele evaluatie en ontwerp voor de volgende generatie geneeskunde te verbeteren.

Introduction

Het ontwerp van medicijnafgifteconstructies die specifiek, ontworpen gedrag vertonen, afhankelijk van welk celtype ze tegenkomen, heeft aanzienlijke onderzoeksinteresse getrokken. Potentiële medicijnafgifteconstructies of "dragers" omvatten lipideformuleringen, nanogekweekte anorganische, polymere assemblages, extracellulaire blaasjes, gefunctionaliseerde bacteriële cellen of gemodificeerde virussen. Al deze kunnen orgaan-, weefsel- of celspecificiteit vertonen als gevolg van fysische eigenschappen, oppervlakte-eigenschappen of gemanipuleerde chemische functionalisaties zoals antilichaamaanhechting ^1,2.

Een bijna alomtegenwoordige stap in in vitro dragerschapsevaluatie is het incuberen van cellen met een suspensie die de met geneesmiddelen geladen drager bevat. Na incubatie worden de prestaties van de drager gemeten via een functionele uitlezing van de prestaties van de medicijnlading, bijvoorbeeld transfectie-efficiëntie of toxiciteit. Functionele uitlezingen zijn nuttig, omdat ze een downstream-maat zijn voor de effectiviteit van de drager. Voor complexere medicijnafgifteconstructies wordt het echter steeds belangrijker om verder te gaan dan functionele uitlezingen en afzonderlijk de mate van dragerinteractie met de cel van belang te kwantificeren. Daar zijn een paar redenen voor.

Ten eerste is er een toenemende interesse in het ontdekken (en iteratief verbeteren) van "platform" carrier-technologieën, die een verscheidenheid aan lading kunnen vervoeren. Lipide nanodeeltjes (LNP's) die zijn ontworpen om RNA in te kapselen, kunnen bijvoorbeeld de ene RNA-sequentie inruilen voor de andere met enkele kanttekeningen³. Om de carriertechnologie iteratief te verbeteren, is het dus van cruciaal belang om de prestaties ervan onafhankelijk van de vrachtfunctionaliteit te kwantificeren. Ten tweede zijn functionele uitlezingen mogelijk niet eenvoudig voor de lading van belang, waardoor het vermogen om vervoerdersformuleringen snel te herhalen en te evalueren in gevaar komt. Hoewel men in vitro optimalisatie zou kunnen uitvoeren met behulp van een modellading met een eenvoudige functionele uitlezing (bijvoorbeeld fluorescentie), kan het veranderen van de lading de biologische reactie op een drager⁴ veranderen en dus geen representatieve resultaten opleveren. Ten derde zijn veel dragers ontworpen om te interageren met en te worden opgenomen door een specifiek celtype. Een dergelijke targetingcapaciteit van een vervoerder kan en moet worden onderscheiden van de prestaties van zijn therapeutische vrachtposttargeting. Om het LNP-voorbeeld voort te zetten, kan een RNA-lading extreem krachtig zijn, maar als de LNP niet in staat is om aan de cel te binden, geïnternaliseerd te worden en het RNA vrij te geven, zal er geen downstream functioneel effect worden waargenomen. Dit kan met name een probleem zijn voor dragers die bedoeld zijn om zich te richten op moeilijk te transfecteren celtypen, zoals T-cellen⁵. Omgekeerd kan een LNP extreem effectief targeten, maar de RNA-lading functioneert mogelijk niet. Een downstream-test die alleen de vrachtfunctionaliteit meet, zal geen onderscheid kunnen maken tussen deze twee situaties, waardoor de ontwikkeling en optimalisatie van carrier-medicijnafgiftesystemen wordt bemoeilijkt.

In dit werk wordt besproken hoe de associatie van dragers absoluut kan worden gekwantificeerd. Associatie is een term die verwijst naar de experimenteel gemeten mate van interactie tussen een drager en een cel. Associatie maakt geen onderscheid tussen membraanbinding en internalisatie - een drager kan worden geassocieerd omdat deze gebonden is aan het celoppervlak of omdat de cel het heeft geïnternaliseerd. Associatie wordt vaak gemeten als onderdeel van celdrager-incubatie-experimenten. Historisch gezien is associatie gemeld in willekeurige fluorescerende eenheden (meestal "mediane fluorescentie-intensiteit" of MFI) of als "procentassociatie", statistieken waarvan de beperkingen eerder zijn besproken⁶. Kortom, deze metingen zijn niet vergelijkbaar tussen experimenten, laboratoria en medicijndragers vanwege verschillen in experimentele protocollen, flowcytometerinstellingen en de etiketteringsintensiteiten van verschillende dragers. Er zijn pogingen gedaan om de eerste te overwinnen door de cytometer te kalibreren, waardoor de relatieve maat van MFI wordt omgezet in een absoluut kwantitatieve maat voor fluorescentie⁷. Deze methode houdt echter geen rekening met de variabiliteit in de etiketteringsintensiteit van verschillende dragers en maakt dus geen rationele vergelijking van verschillende dragerprestaties in een doelcel van keuze^{mogelijk 8}.

Hier wordt het praktisch converteren van relatieve, willekeurige fluorescerende eenheden naar de absolute kwantitatieve metriek van het "aantal dragers per cel" aangetoond door een klein aantal aanvullende karakteriseringsexperimenten uit te voeren. Als een andere metriek van dragerconcentratie gewenst is (bijvoorbeeld dragermassa per cel of dragervolume per cel), is het eenvoudig om te converteren van dragers per cel, op voorwaarde dat carrierkarakterisering is uitgevoerd. Kortheidshalve en om jargon te vermijden, wordt het woord "drager" in dit werk gebruikt om te verwijzen naar het enorme assortiment van medicijnafgifteconstructies. Deze kwantificeringstechnieken zijn even toepasbaar, of ze nu worden toegepast op een nano-gemanipuleerd gouddeeltje of een bio-engineered bacteriën.

Enkele feiten maken de omzetting van willekeurige fluorescerende eenheden naar dragers per cel mogelijk. Ten eerste is de gemeten fluorescentie-intensiteit evenredig met de concentratie van een fluorofoor⁹ (of een fluorescerend gelabelde drager), ervan uitgaande dat de fluorescentie binnen de detectiegrenzen van het instrument valt en de instrumentatie-instellingen hetzelfde zijn. Als de fluorescentie van een drager en de fluorescentie van een monster bekend zijn, kan men dus bepalen hoeveel dragers er in dat monster aanwezig zijn als alle metingen onder dezelfde instellingen en omstandigheden zijn uitgevoerd. Vooral voor kleinere dragers is het echter mogelijk niet mogelijk om dragerfluorescentie, celautofluorescentie en cel-geassocieerde fluorescentie te meten op hetzelfde instrument met dezelfde instellingen. In dit geval is er een tweede vereiste om het mogelijk te maken om te converteren tussen gemeten fluorescentie op het ene instrument en gemeten fluorescentie op een ander instrument. Om dit te doen, kan een standaardcurve van fluorofoorconcentratie worden vastgesteld om de fluorescentie-intensiteit op beide instrumenten te meten, gebruikmakend van de moleculen van equivalent oplosbaar fluorochroom (MESF) standaard⁹. Dit maakt het vervolgens mogelijk om de dragerfluorescentie in bulk te meten op een niet-cytometer, een meting die kan worden uitgevoerd op dragers van elke grootte of eigenschap. Wanneer een dergelijke bulkkwantificering wordt uitgevoerd op een dragersuspensie van bekende concentratie, kan het aantal dragers per cel van een monster opnieuw worden berekend.

Hoewel dit werk het proces demonstreert voor het meten van dragerassociatie (zoals bepaald door gemeten fluorescentie-intensiteit), kan een analoog protocol worden uitgevoerd voor andere metingen van cel-dragerinteractie (bijvoorbeeld een experimenteel protocol dat geïnternaliseerde en membraangebonden dragers differentieert). Bovendien zou dit protocol grotendeels hetzelfde zijn als de associatie werd gemeten door middel van een niet-fluorescerende test (bijvoorbeeld door massacytometrie).

Protocol

1. De juiste stream kiezen

1. Volg de beslisboom in figuur 1 om de beste workflow (stream) (figuur 2) te bepalen voor de gebruikte experimentele opstelling. Raadpleeg de discussie voor meer commentaar op deze streamkeuze.
2. Als u de cytometerstroom volgt, gaat u verder met stap 2.1.1-2.2.7. Als u de bulkstream volgt, gaat u verder met stappen 3.1.1.1-3.1.5.7.

Figuur 1: Workstream beslisboom. De beslissing welke Stream te gebruiken hangt voornamelijk af van het type carrier-interesse. Grotere dragers en dragers met hoge verstrooiingseigenschappen kunnen gemakkelijker individueel op cytometers worden gedetecteerd, waardoor ze geschikt zijn voor kwantificering met behulp van de Cytometer Stream. De Bulk Stream is geschikt voor alle andere vervoerders. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Overzicht van werkstromen. Dit protocol is opgesplitst in twee verschillende streams. De Cytometer Stream gebruikt een gevoelige cytometer om de dragers in suspensie te tellen, hun individuele fluorescentie te meten en vervolgens de fluorescentie van cellen geïncubeerd met dragers te bepalen. De Bulk Stream maakt gebruik van niet-cytometrie-gebaseerde technieken, zoals Nanoparticle Tracking Analysis, om de dragers in suspensie te tellen. De fluorescentie van de individuele drager wordt vervolgens gekwantificeerd met behulp van een microplaatlezer of spectrofluorometer. Het gebruik van de flowcytometer is daarom beperkt tot het meten van de uiteindelijke fluorescentie van cellen geïncubeerd met dragers, een meting die kan worden uitgevoerd op een breder scala aan cytometers en die onafhankelijk is van het gebruikte dragertype. Afkortingen: MESF = Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome; MFI = mediane fluorescentie-intensiteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. De cytometerstroom

1. Dragers tellen
   OPMERKING: Elke flowcytometer kan voor deze meting worden gebruikt, op voorwaarde dat het debiet (μL/s) bekend is. Als het debiet onbekend is en niet kan worden bepaald, ga dan niet verder met deze stap. Ga in plaats daarvan verder met stap 3.1. Het tellen van de dragers in suspensie maakt een nauwkeurige en reproduceerbare bepaling mogelijk van het aantal dragers dat in elk celexperiment wordt geïncubeerd.
   1. Stel de cytometer in om dragers te detecteren, zowel via een optisch verstrooiingskanaal (meestal side scatter [SSC]) als fluorescentie. Zorg ervoor dat u de drempel aanpast om detectie van de dragers mogelijk te maken.
      OPMERKING: Iteratie via verschillende optische verstrooiingskanalen kan nodig zijn als SSC geen duidelijk signaal geeft (bijv. Forward Scatter [FSC]).
   2. Voer een alleen verdunningsmonster uit om het aantal achtergrondgebeurtenissen in zowel het SSC- als het fluorescerende kanaal te kwantificeren.
      OPMERKING: Het aantal ideale achtergrondgebeurtenissen is <100 gebeurtenissen/en.
   3. Bereid de dragers voor op flowcytometrie.
      1. Zorg ervoor dat de dragers goed zijn opgehangen door vortexing of ultrasoonapparaat, afhankelijk van het betrokken dragersysteem.
      2. Zorg er indien mogelijk voor dat de dragerconcentratie tussen 1.000 dragers/μL en 10.000 dragers/μL ligt. Een gebeurtenistelling van één tot twee ordes van grootte hoger dan de achtergrond is een goed begin. Als de orde van grootte van de dragerconcentratie onbekend is, is een goed begin om een verdunning van 1:1.000 uit voorraad voor te bereiden. Gebruik de eerste resultaten als feedback om toekomstige monsterverdunningen te informeren.
         OPMERKING: Een troebele suspensie is over het algemeen te geconcentreerd.
   4. Laad het eerste dragermonster op de cytometer en begin met opnemen.
   5. Vergelijk het aantal gebeurtenissen dat voortvloeit uit zowel het SSC- als het fluorescentiekanaal; deze moeten ongeveer gelijk zijn (<10% verschil). Zo niet, controleer dan de cytometerinstellingen, bijvoorbeeld fotomultiplicatorbuis (PMT) instellingen en laserintensiteit voor het fluorescerende kanaal. U kunt ook andere methoden gebruiken, zoals confocale microscopie, om te valideren dat de fluorescerende etikettering van de dragers aanwezig en uniform is.
   6. Herhaal stap 2.1.3-2.1.5 twee of meer extra keren met verschillende verdunningen van de voorraad. Zorg ervoor dat het aantal gebeurtenissen in elk monster ten minste één orde van grootte hoger is dan het aantal achtergrondgebeurtenissen.
   7. Controleer of drie of meer monsters een lineaire trend vertonen, dat wil zeggen dat een tweevoudige monsterverdunning moet resulteren in een overeenkomstige tweevoudige verlaging van de gemeten dragerconcentratie.
   8. Gebruik de monsters binnen het lineaire bereik, de overeenkomstige verdunningsfactoren en het bekende cytometerdebiet om de voorraaddragerconcentratie te berekenen volgens vergelijking (1):
      (1)
      waarbij C de voorraaddragerconcentratie in dragers/ml is. Het wordt aanbevolen om het aantal gebeurtenissen te gebruiken dat is afgeleid van optische verstrooiingsdetectie in plaats van fluorescentie.
2. Flowcytometrie-uitlezing van het dragercelexperiment, inclusief bepaling van de fluorescentie-intensiteit per drager
   OPMERKING: Idealiter wordt de fluorescerende intensiteit per drager zo dicht mogelijk bij het drager-celexperiment bepaald. Dit is om ervoor te zorgen dat de MFI's die voor individuele dragers worden verkregen, rechtstreeks kunnen worden vergeleken met de MFI's van cellen die aan de dragers zijn gekoppeld. In de praktijk zal een cytometer meestal vergelijkbare resultaten genereren bij gebruik op opeenvolgende dagen met dezelfde PMT-spanningen, maar dit kan niet worden gegarandeerd.
   1. Ontwerp het drager-celexperiment. Gebruik de in stap 2.1 bepaalde dragerconcentratie om de gewenste dosis dragers toe te dienen.
   2. Stel de flowcytometer in voor het uiteindelijke dragercelexperiment door optimale PMT-spanningsinstellingen in de relevante kanalen te bepalen. Stel de drempelwaarden in om carrierdetectie mogelijk te maken.
   3. Voer de dragers in suspensie uit om de fluorescentie-intensiteit per drager te bepalen onder de huidige PMT-instellingen.
   4. Verander indien nodig de cytometerdrempels om de cellen te detecteren en niet de dragers.
   5. Voer een negatief controlemonster uit - cellen die niet zijn geïncubeerd met dragers - om de achtergrondfluorescentie (autofluorescentie) van de cellen te bepalen.
   6. Voer de dragercelmonsters uit om de fluorescentie-intensiteit per cel te bepalen. Deze fluorescentie is een lineaire combinatie van cellulaire autofluorescentie en de aanwezigheid van fluorescerende dragers.
   7. Bereken het aantal dragers per cel met behulp van de volgende vergelijking (2):
      (2)
      waarbij P_assoc het aantal geassocieerde dragers per cel is, _FI-cel de MFI is van cellen geïncubeerd met dragers, _{FI-achtergrond} de MFI van cellen die niet geïncubeerd zijn met dragers, en _FI-drager de MFI van dragers in suspensie is.

3. De bulkstroom

1. Dragertellingen: analyse van het volgen van nanodeeltjes
   OPMERKING: In de bulkstroom is het tellen van dragers een noodzakelijke stap om de absolute fluorescentie-intensiteit per drager te kwantificeren (zie stap 3.1.4). Bovendien maakt het tellen van de dragers in suspensie de nauwkeurige en reproduceerbare bepaling mogelijk van het aantal dragers dat in elk celexperiment wordt geïncubeerd.
   1. Voorbereiding
      1. Monteer de flowcel op de lasermodule en vergrendel de volledige lasermodule op zijn plaats in het instrument.
      2. Spoel de stroomcel langzaam (niet sneller dan 0,1 ml / s) met ~ 1 ml gedestilleerd water. Als er bellen ontstaan in de stroomcel, trekt u de suspensie gedeeltelijk in om de bel samen te voegen met de lucht-vloeistofinterface voordat u verder gaat.
      3. Start de camera ongeveer halverwege het spoelen; zorg ervoor dat u bevestigt dat het dragerpuin is weggespoeld. Selecteer Vastleggen om het tabblad Opname-instellingen te openen en klik op Camera starten.
      4. Droog het systeem met 1 ml lucht. Als er statische dragers zichtbaar zijn op het scherm, reinigt u de stroomcel volgens de instructies van de fabrikant.
      5. Bereid de dragers voor op Nanoparticle Tracking Analysis door ervoor te zorgen dat de dragers goed zijn gesuspendeerd via vortexing of ultrasoonapparaat, afhankelijk van het betrokken dragersysteem. Als de orde van grootte van de voorraadconcentratie onbekend is, bereidt u een verdunning van 1:100 uit de voorraad voor en gebruikt u de eerste resultaten als feedback om toekomstige monsterverdunningen te informeren. Verdun de dragers in water en niet in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) om ten minste ~ 0,6-1 ml van elk monster te bereiden met een dragerconcentratie tussen 1 × 10⁷ dragers / ml en 1 × 10⁹ dragers / ml.
         OPMERKING: Een troebele suspensie is over het algemeen te geconcentreerd. Buffers en zouten kunnen veel achtergrondgeluid genereren.
   2. Meting
      1. Haal de lasermodule eruit en plaats deze rechtop.
      2. Neem het eerste draagmonster op in een spuit van 1 ml. Bevestig de spuit aan de buisinlaat en laad het monster voorzichtig in de stroomcel. Als er bellen ontstaan in de stroomcel, trekt u de suspensie gedeeltelijk in om de bel samen te voegen met de lucht-vloeistofinterface voordat u verder gaat. Zorg ervoor dat de hele stroomcel gevuld is met vloeistof en pauzeer vervolgens.
      3. Pas indien nodig de camerafocus aan om individuele dragers te visualiseren. Maak grove scherpstellingsaanpassingen met de draaiknop aan de rechterkant van het instrument. Breng fijnere aanpassingen aan door het tabblad Hardware | Pompen/Stage. Wijzig de focus door de schuifregelaar Focus aan te passen.
      4. Pas het cameraniveau aan om ervoor te zorgen dat er geen oververzadiging is. Selecteer op het tabblad Vastleggen het optimale cameraniveau door de schuifregelaar aan te passen.
      5. Als het instrument met dit accessoire is uitgerust, laadt u de spuit met het dragermonster in de spuitpomp om een continue monsterstroom tijdens de metingen te garanderen.
      6. Selecteer op het tabblad SOP de optie Standaardmeting om vijf opnamen van elk 30 s te maken. Voer de basisbestandsnaam in en voeg desgewenst aanvullende voorbeeldinformatie toe door op de knop Geavanceerd te klikken (waarmee een modaal dialoogvenster met verschillende keuzes wordt geopend).
         OPMERKING: Als een verdunningsfactor wordt ingevoerd, wordt de uiteindelijke dragerconcentratiemeting automatisch door de software aangepast. Het invoeren van deze factor wordt afgeraden. Voer in plaats daarvan de afstelling handmatig uit, waardoor de analyse wordt vergemakkelijkt en kan worden beoordeeld of elke verdunning binnen het dynamische bereik van het instrument valt (stap 3.1.3.4).
      7. Druk op Script maken en uitvoeren en wacht tot er een pop-up verschijnt waarin wordt gevraagd om een voorbeeld vooraf te nemen.
      8. Als u de spuitpomp gebruikt, selecteert u het tabblad Hardware | Syringe Pump tab stel de infusiesnelheid in op 30-80 en druk op Infuse. Als u de spuitpomp niet gebruikt, dient u het monster handmatig te verplaatsen.
      9. Selecteer in het pop-upvenster OK om te beginnen met vastleggen. Controleer na elk van de vijf vangsten, wanneer de pop-up Please advance sample opnieuw verschijnt, of het monster nog steeds door de stroomcel beweegt, handmatig of via de spuitpomp. Selecteer vervolgens OK om door te gaan met de volgende opname.
         OPMERKING: Na vijf opnames opent de software automatisch het tabblad Proces en opent een pop-up waarin wordt gevraagd de procesinstellingen aan te passen.
   3. Analyse
      1. Pas op het tabblad Proces de schuifregelaar Detectiedrempel (tussen 4 en 8) aan om de verschillende vervoerders die zichtbaar zijn op het scherm correct te identificeren. Pas ook de schermversterking aan om visualisatie te ondersteunen; het heeft geen invloed op de downstreamanalyse. Gebruik de schuifregelaar onder het opnamescherm om door meerdere frames van de video te bladeren om de detectiedrempelinstelling te vergemakkelijken.
         OPMERKING: De detectiedrempel moet eenmaal worden ingesteld en mag vervolgens niet worden gewijzigd tussen metingen of monsters.
      2. Druk in de pop-up (opmerking na stap 3.1.2.9) op OK om de trackinganalyse te starten. Volg de voortgang van de analyse door op het tabblad Analyse te klikken | Tabblad Eén analyse .
      3. Zodra de analyse is voltooid, zoekt u naar de prompt Exportinstellingen waarin PDF opnemen en Experimentoverzicht opnemen standaard moeten worden geselecteerd. Selecteer naar wens andere exportindelingen.
      4. Controleer in het gedeelte Resultaten van de PDF-gegevensexport of de gemeten concentratie betrouwbaar is om ervoor te zorgen dat de gemeten dragerconcentratie tussen 1 × 10⁷ dragers/ml en 1 × 10⁹ dragers/ml ligt - het dynamische bereik van het instrument - en controleer op foutmeldingen of waarschuwingsberichten onder het concentratiemeetresultaat.
      5. Herhaal stap 3.1.2.1-3.1.3.4 twee of meer keer met verschillende verdunningen van de voorraad. Zorg ervoor dat de concentratie van elk monster binnen het lineaire bereik van het instrument valt.
      6. Selecteer drie of meer monsters die een lineaire trend vertonen, dat wil zeggen dat een tweevoudige monsterverdunning moet resulteren in een overeenkomstige tweevoudige verlaging van de gemeten dragerconcentratie. Gebruik de geselecteerde monsters en bijbehorende verdunningsfactoren om de voorraaddragerconcentratie te berekenen.
   4. Bepaling van de absolute fluorescentie-intensiteit per drager
      OPMERKING: Aangezien de fluorescentie van individuele dragers in deze stroom niet direct kan worden gekarakteriseerd, wordt de fluorescentie-intensiteit in bulk gekwantificeerd. Deze methode is gebaseerd op het feit dat de fluorescentie-intensiteit lineair gerelateerd is aan de fluorochroomconcentratie volgens de wet van Lambert-Beer. Wanneer een dergelijke bulkkwantificering van dragers in suspensie wordt uitgevoerd op basis van een suspensie van de bekende dragerconcentratie (zie stap 3.1), kan de fluorescentie per drager worden afgeleid. Deze stap kan worden uitgevoerd op een fluorescentieplaatlezer of een spectrofluorometer. De fluorescentie-intensiteit wordt vergeleken met een standaardcurve van monsters met bekende absolute fluorescentie, gegeven in aantal MESF's.
      1. Gebruik een oplossing van het vrije fluorochroom om de drager te labelen: resuspenseer de kleurstof in de juiste buffer (bijv. DMSO) en voer verdere verdunningen uit in dezelfde buffer als het dragerverdunningsmiddel. U kunt ook een oplossing van een antilichaam gebruiken dat is geconjugeerd aan het fluorochroom. Bereken de concentratie van de stamoplossing (MESF/ml) uit de concentratie in mg/ml, het molecuulgewicht in mg/mol en het getal van Avogadro met behulp van vergelijking (3). Voer een seriële verdunning uit in het dragerverdunningsmiddel om standaardcurvemonsters te genereren.
         (3)
         OPMERKING: Gebruik een fluorochroom-geconjugeerd antilichaam alleen als de mate van etikettering, d.w.z. de molaire verhouding tussen het fluorochroom en het antilichaam in de oplossing, bekend is. Genereer in eerste instantie een standaardcurve met een breed bereik, omdat de fluorescentie-intensiteit van het dragermonster nog onbekend is. Vanaf hier kunt u het beperken tot het vereiste bereik.
      2. Bereid de dragermonsters voor.
         OPMERKING: De beste praktijk is om twee of meer dragerverdunningen te testen om te valideren dat de metingen lineair zijn en binnen het bereik van de standaardcurve vallen.
      3. Meet de fluorescentie van gelijke volumes van elk monster, d.w.z. zowel drager- als standaardcurven.
      4. Genereer een standaardcurve en trek de bulk absolute fluorescentie-intensiteit in MESF/ml af voor de gemeten dragermonsters.
      5. Bereken de absolute fluorescentie-intensiteit per drager (MESF/drager) door de bulkfluorescentie (MESF/ml) te delen door de dragerconcentratie (dragers/ml) zoals in vergelijking (4):
         (4)
   5. Celexperiment (inclusief de bepaling van de equivalente fluorescentie-intensiteit per drager)
      OPMERKING: In deze stap worden flowcytometrie kwantificeringsparels gebruikt om een standaardcurve van de relatie tussen MESF en MFI te genereren. Deze kwantificeringsparels bestaan uit meerdere kralenpopulaties met een bekend aantal MESF per kraal, en deze individuele kralen kunnen door elke cytometer worden gedetecteerd. Idealiter wordt de MESF-standaardcurve bepaald op hetzelfde moment als de uitlezing van de dragercelexperimenten. Dit is om ervoor te zorgen dat de MFI-waarden die voor individuele dragers zijn berekend, rechtstreeks kunnen worden vergeleken met de MFI van cellen die zijn gekoppeld aan dragers. In de praktijk zal een cytometer meestal vergelijkbare resultaten genereren bij gebruik op opeenvolgende dagen met dezelfde PMT-spanningen, maar dit kan niet worden gegarandeerd.
      1. Ontwerp het drager-celexperiment. Gebruik de in rubriek 3.1.3 bepaalde dragerconcentratie om de gewenste dosis dragers toe te dienen.
      2. Stel de flowcytometer in voor het uiteindelijke dragercelexperiment door optimale PMT-spanningsinstellingen in de relevante kanalen te bepalen.
      3. Voer een negatief controlemonster uit, dat wil zeggen cellen die niet zijn geïncubeerd met dragers, om de achtergrondfluorescentie te bepalen.
      4. Bereid en resuspendeer de flowcytometrie kwantificeringsparels. Gebruik dezelfde buffer als gebruikt voor de celmonsters (bijvoorbeeld PBS). Als de kralenpopulaties afzonderlijk worden verstrekt, bundel ze dan samen.
      5. Voer het flowcytometrie kwantificeringskraalmonster uit.
      6. Voer de dragercelmonsters uit om de fluorescentie-intensiteit per cel te bepalen.
      7. Gebruik het quantitatiekraalmonster om een standaardcurve te genereren die de absolute fluorescentie-intensiteit (MESF) omzet in MFI. Gebruik deze standaardcurve en de resultaten van stap 3.1.4 om de theoretische MFI van de dragers te berekenen. Bereken het aantal dragers per cel met behulp van vergelijking (5):
         (5)
         Waarbij _P-assoc het aantal geassocieerde dragers per cel is, _FI-cel de MFI is van cellen geïncubeerd met dragers, _{FI-achtergrond} de MFI is van cellen die niet geïncubeerd zijn met dragers, en _FI-drager de berekende MFI van dragers in suspensie (stap 3.1.4).

Results

Zoals eerder besproken, vereisen verschillende soorten medicijndragers het gebruik van verschillende technieken voor de absolute kwantificering van celdragerassociatie. Bijvoorbeeld, 633 nm disulfide-gestabiliseerde poly (methacrylzuur) (PMA_SH) kern-schil deeltjes zijn groot en dicht genoeg voor detectie met behulp van een gevoelige flowcytometer. Als zodanig werden deze deeltjes fluorescerend gelabeld, vervolgens omheind en geteld met behulp van zijhoeklichtverstrooiing (SALS, analoog aan SSC), evenals het ju...

Discussion

Het karakteriseren van de interacties tussen medicijndragers en cellen wordt steeds belangrijker bij de ontwikkeling van nieuwe medicijnafgiftesystemen. Specifiek, om de rationele evaluatie en vergelijking van verschillende dragerconstructies mogelijk te maken, is absolute kwantificering van de prestaties van die drager om te interageren met doel- en off-target cellen van cruciaal belang. Dit protocol beschrijft een tweestromenmethodologie waarmee elke onderzoeker die met een medicijndrager werkt, relatieve, semikwantifi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Invitrogen	A20347	pH-stabiele kleurstof gebruikt om 150 nm, 235 nm of 633 nm PMASH dragers te labelen; voorbeeld van een goede kleurstof voor gebruik in cel-drager associatie studies
Apogee A50 Microflow	Apogee		Gevoelige flowcytometer die in staat is kleine dragers te detecteren voor telling
CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter		Gevoelige flowcytometer die in staat is kleine dragers te detecteren voor telling en uitlezing voor uiteindelijke cel-barrière experimenten
FCS Express	De Novo Software		Software gebruikt om flowcytometrie data te analyseren, d.w.z. gating uitvoeren en mediane fluorescentie intensiviteitswaarden afleiden van populaties naar keuze. Alternatieven omvatten FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PRO	Tecan Lifesciences		Standaard microplaat leesapparaat gebruikt voor bulk fluorescentie metingen van dragers in oplossing
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Biosciences		Minder gevoelige flowcytometer, maar één die meestal beschikbaar is voor onderzoekers. Kan worden gebruikt om uiteindelijke cel-drager experiment uit te lezen
NanoSight NS300	Malvern Panalytical		Instrument gebruikt voor Nanoparticle Tracking Analyse
Prism 8	GraphPad		Software gebruikt om grafieken te maken en standaardcurves te berekenen. Alternatieven omvatten Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python onder vele anderen
Quantum MESF kits Alexa Fluor 647	Bangs Laboratories	647	Absolute kwantificeringskralen voor flowcytometrie. Gebruikt om fluorescentie intensiteiten gemeten in bulk op een microplaat leesapparaat om te zetten naar fluorescentie intensiteiten gemeten op een flowcytometer met behulp van de MESF standaard