Methodenartikel

Isolatie en kwantificering van epstein-barrvirus uit de P3HR1-cellijn

DOI:

10.3791/64279

⸱

28 september 2022

 ,  , 
1Department of Experimental Pathology, Immunology and Microbiology, Faculty of Medicine, American University of Beirut, 2Center for Infectious Diseases Research (CIDR), Faculty of Medicine, American University of Beirut

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol maakt de isolatie van Epstein-Barr-virusdeeltjes uit de menselijke P3HR1-cellijn mogelijk bij het induceren van de virale lytische cyclus met phorbol 12-myristate 13-acetaat. DNA wordt vervolgens geëxtraheerd uit het virale preparaat en onderworpen aan real-time PCR om de virale deeltjesconcentratie te kwantificeren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het Epstein-Barr-virus (EBV), formeel aangeduid als Humaan herpesvirus 4 (HHV-4), is het eerste geïsoleerde menselijke tumorvirus. Bijna 90-95% van de volwassen wereldbevolking is besmet met EBV. Met de recente vooruitgang in moleculaire biologie en immunologie heeft de toepassing van zowel in vitro als in vivo experimentele modellen diep en betekenisvol inzicht gegeven in de pathogenese van EBV bij veel ziekten en in EBV-geassocieerde tumorigenese. Het doel van dit gevisualiseerde experimenteerartikel is om een overzicht te geven van de isolatie van EBV-virale deeltjes uit cellen van de P3HR1-cellijn, gevolgd door kwantificering van het virale preparaat. P3HR1-cellen, oorspronkelijk geïsoleerd uit een humaan Burkitt-lymfoom, kunnen een P3HR1-virus produceren, een EBV-stam van type 2. De EBV-lytische cyclus kan in deze P3HR1-cellen worden geïnduceerd door behandeling met phorbol 12-myristate 13-acetaat (PMA), waardoor EBV-virale deeltjes ontstaan.

Met behulp van dit protocol voor de isolatie van EBV-deeltjes worden P3HR1-cellen gedurende 5 dagen gekweekt bij 37 °C en 5% CO2 in volledig RPMI-1640-medium met 35 ng / ml PMA. Vervolgens wordt het kweekmedium gedurende 8 minuten met een snelheid van 120 x g gecentrifugeerd om de cellen te pelleteren. Het virusbevattende supernatant wordt vervolgens verzameld en met een snelheid van 16.000 x g gedurende 90 minuten afgesponnen om de EBV-deeltjes te pelleteren. De virale pellet wordt vervolgens geresuspendeerd in een volledig RPMI-1640-medium. Dit wordt gevolgd door DNA-extractie en kwantitatieve real-time PCR om de concentratie van EBV-deeltjes in het preparaat te beoordelen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het Epstein-Barr-virus (EBV) is het eerste menselijke tumorvirus dat is geïsoleerd1. EBV, formeel aangeduid als Humaan herpesvirus 4 (HHV-4)2, maakt deel uit van de gamma herpesvirus subfamilie van de herpesvirusfamilie en is het prototype van het lymfocryptovirus geslacht. Bijna 90-95% van de volwassen wereldbevolking is besmet met het virus3. In de meeste gevallen treedt de eerste infectie op binnen de eerste 3 jaar van het leven en is asymptomatisch, maar als de infectie later tijdens de adolescentie optreedt, kan dit aanleiding geven tot een ziekte die infectieuze mononucleosis4 wordt genoemd. EBV is in staat om rustende B-cellen te infecteren, waardoor ze proliferatieve B-lymfoblasten worden waarin het virus een latent geïnfecteerde toestand vestigt en handhaaft5. EBV kan op elk moment reactiveren en zo leiden tot terugkerende infecties6.

In de afgelopen 50 jaar is de associatie tussen sommige virussen en de ontwikkeling van menselijke maligniteiten steeds duidelijker geworden, en vandaag wordt geschat dat 15% tot 20% van alle menselijke kankers gerelateerd zijn aan virale infecties7. De herpesvirussen, waaronder EBV, zijn enkele van de best bestudeerde voorbeelden van dit soort tumorvirussen8. In feite kan EBV vele soorten menselijke maligniteiten veroorzaken, zoals Burkitt-lymfoom (BL), Hodgkin-lymfoom (HL), diffuus grootcellig B-cellymfoom en lymfoproliferatieve ziekten bij immuungecompromitteerde gastheren 9,10. Ebv is ook aangetoond geassocieerd te zijn met de ontwikkeling van systemische auto-immuunziekten. Enkele voorbeelden van deze auto-immuunziekten zijn reumatoïde artritis (RA), polymyositis-dermatomyositis (PM-DM), systemische lupus erythematosus (SLE), gemengde bindweefselziekte (MCTD) en het syndroom van Sjögren (SS)11. EBV wordt ook geassocieerd met de ontwikkeling van inflammatoire darmziekte (IBD)12.

Veel van deze ziekten kunnen worden bestudeerd of gemodelleerd met behulp van celkweek, muizen of andere organismen die zijn geïnfecteerd met EBV. Daarom zijn EBV-deeltjes nodig om cellen of organismen te infecteren, of het nu in vitro of in vivo modellenzijn 13,14,15,16, vandaar de noodzaak om een techniek te ontwikkelen die isolatie van virale deeltjes tegen lage kosten mogelijk maakt. Het hier beschreven protocol biedt richtlijnen voor een eenvoudige manier om EBV-deeltjes betrouwbaar te isoleren uit een relatief toegankelijke cellijn en om de deeltjes te kwantificeren met behulp van real-time PCR, dat kosteneffectief en direct beschikbaar is voor de meeste laboratoria. Dit in vergelijking met verschillende andere methoden die zijn beschreven om EBV te isoleren van verschillende cellijnen 17,18,19,20.

P3HR-1 is een BL-cellijn die groeit in suspensie en latent is geïnfecteerd met een EBV type 2-stam. Deze cellijn is een EBV-producent en kan worden geïnduceerd om virale deeltjes te produceren. Het doel van dit manuscript is om een methode te demonstreren die de isolatie van EBV-deeltjes uit de P3HR-1-cellijn mogelijk maakt, gevolgd door kwantificering van de virale voorraad die later kan worden gebruikt voor zowel in vitro als in vivo EBV-experimentele modellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: EBV moet worden beschouwd als een potentieel biologisch gevaarlijk materiaal en moet daarom worden behandeld onder bioveiligheidsniveau 2-containment of hoger. Een laboratoriumjas en handschoenen moeten worden gedragen. Als er potentieel is voor blootstelling aan spatten, moet ook oogbescherming worden overwogen. De volgende procedure moet worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast.

1. De P3HR1-cellen tellen

  1. Cellen centrifugeren en resuspenderen
    1. Breng de celsuspensie over van een kweekplaat van 100 mm (of T-25 kolf) van een doorlopende P3HR1-celcultuur bij 80% samenvloeiing naar een conische buis van 15 ml. De zaaidichtheid van P3HR-1 cellen is 1 x 106 cellen / ml. Handhaven in volledige RPMI kweekmedium (79% RPMI kweekmedium, 20% Foetaal Runderserum, 1% Pen-Strep antibioticum) bij 37 °C en 5% CO2, en passage om de 3-4 dagen.
    2. Centrifugeer gedurende 8 minuten bij 120 x g. Gooi na centrifugatie het supernatant weg, resuspenseer de celpellet in 1 ml volledig RPMI-kweekmedium en meng goed (deze oplossing wordt suspensie A genoemd).
  2. De celsuspensie voorbereiden voor het tellen
    1. Bereid een verdunde celsuspensie B door 2 μL celsuspensie A te mengen met 8 μL kweekmedium. Voeg 10 μL van 0,4% trypan blue toe aan suspensie B om suspensie C te verkrijgen. Meng het preparaat goed door voorzichtig pipetteren.
  3. Cellen tellen met behulp van een hemocytometer
    1. Plaats een glazen deklip op de hemocytometer en laad 10 μL suspensie C. Plaats de hemocytometer onder een lichtmicroscoop en tel het aantal cellen dat niet blauw gekleurd is in elk van de vier kwadranten van de hemocytometerkamer met behulp van het 40x microscoopobjectief (figuur 1).
    2. Trypan blauw kleurt dode cellen blauw; tel deze cellen niet, noch cellen die een van de bovenste, onderste, rechter- of linkerranden van elk hemocytometerkwadrant raken.
    3. Bereken de concentratie van cellen per ml met behulp van de volgende formule:
      figure-protocol-1
      OPMERKING: Het aantal getelde kwadranten is vier en 10-4 ml is het volume van de vierkanten op de hemocytometer. De vier kwadranten die geteld moeten worden, zijn in figuur 1 in het groen weergegeven. Totaal aantal cellen geteld in de formule is de som van het aantal cellen in kwadranten 1, 2, 3 en 4. Cellen die in figuur 1 in blauw worden weergegeven, moeten worden geteld, terwijl cellen in rood niet mogen worden geteld omdat ze de boven-, rechter-, onder- of linkerrand van het kwadrant raken.

figure-protocol-2
Figuur 1: Celtelling met behulp van een hemocytometerkamer. Vier kwadranten worden geteld met behulp van een lichtmicroscoop; deze kwadranten zijn in het groen weergegeven. Totaal aantal cellen Geteld in de formule aangegeven in stap 1.3.3 van het hier beschreven protocol is de som van het aantal cellen in kwadranten 1, 2, 3 en 4. Cellen die in blauw zijn aangegeven, moeten worden geteld, terwijl cellen in rood niet mogen worden geteld omdat ze de boven-, rechter-, onder- of linkerranden van het kwadrant raken Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Het bord voorbereiden op cultuur

  1. Plaats een volume celsuspensie A in een conische buis van 15 ml. Het vereiste volume is afhankelijk van het aantal cellen. Pas het volume zodanig aan dat het aantal cellen ongeveer 2,2 x 106 cellen is voor een kweekplaat van 100 mm.
  2. Voeg 5 ml compleet kweekmedium toe aan de buis en breng vervolgens de inhoud van de buis over op een kweekplaat van 100 mm. Voeg 80 μL dimethylsulfoxide (DMSO) toe aan de kweekplaat.
    OPMERKING: DMSO is lichtgevoelig, daarom moet het worden bewaard in een lichtbestendige container of worden bedekt met een ondoorzichtig materiaal zoals aluminiumfolie.
  3. Voeg 350 μL 1 mg/ml phorbol 12-myristate 13-acetaat (PMA) toe aan de buis. De uiteindelijke concentratie van PMA moet 35 ng/ml zijn en die van DMSO moet 0,08% zijn.
    LET OP: PMA is giftig, corrosief en kankerverwekkend, daarom moet het met uiterste zorg worden behandeld. PMA is lichtgevoelig, daarom moet het worden bewaard in een lichtbestendige container of worden bedekt met een ondoorzichtig materiaal zoals aluminiumfolie.
  4. Voeg 4,27 ml kweekmedium toe zodat het totale volume 10 ml is. Meng de inhoud van de buis door te kantelen en breng de inhoud vervolgens over op een kweekplaat van 100 mm. Laat de plaat 5 dagen in een celkweekincubator staan bij 37 °C, 5% CO2.

3. Inductie en isolatie van Epstein-Barr-virusdeeltjes

  1. Na 5 dagen in de incubator, centrifugeer de inhoud van de plaat op 120 x g gedurende 8 minuten om de cellen te pelleteren. Verzamel het celvrije, virusbevattende supernatant en gooi de celpellet weg.
  2. Centrifugeer het supernatant bij 16.000 x g gedurende 90 minuten bij 4 °C om de virusdeeltjes te pelleteren. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de viruskorrel in 5 ml kweekmedium.
    OPMERKING: Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) kan worden gebruikt om de viruskorrel te resuspenderen in plaats van kweekmedium.
  3. Aliquot de virale suspensie verkregen in 20 buizen, die elk 250 μL van de virale suspensie bevatten. Bewaar de suspensie bij -80 °C.

4. DNA-extractie uit virale deeltjes

LET OP: Uiterste voorzichtigheid is geboden bij het hanteren van fenol, omdat het giftig en corrosief is en het vermogen heeft om ernstige brandwonden te veroorzaken. Fenol is lichtgevoelig en oxideert bij contact met licht of lucht. Bewaar het in een lichtbestendige container of bedek de fenolbuis met een ondoorzichtig materiaal zoals aluminiumfolie.

  1. Scheiding van eiwitten uit DNA
    1. Voeg 500 μL TrisCl-verzadigd fenol toe aan een van de 250 μL-buizen. Voeg 100 μL water toe (om het volume van de waterige fase te vergroten) en vortex goed om een roze emulsie te verkrijgen. Centrifugeer gedurende 15 min bij 9650 x g.
  2. DNA neerslag
    1. Verzamel het supernatant (transparante, waterige fase) en breng het over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    2. Voeg een equivalent toe van 1/10 van het volume koud natriumacetaat van het supernatant (3 M, pH 5,2) en meng door op en neer te pipetteren. Voeg 1 μL 20 mg/ml glycogeen toe en meng door te pipetteren.
      OPMERKING: Deze stap is optioneel, maar de toevoeging van glycogeen verbetert de DNA-neerslag en maakt het gemakkelijker om de DNA-pellet te visualiseren.
    3. Voeg drie keer het volume koude 100% ethanol van het supernatant toe. Bewaren bij -80 °C 's nachts.
      OPMERKING: De procedure kan hier worden gestopt om op een later tijdstip te worden hervat. Het monster kan gedurende 1 uur bij -80 °C of als alternatief 's nachts worden bewaard. Nachtelijke opslag verbetert de DNA-neerslag en wordt daarom aanbevolen.
  3. Het isoleren van het virale DNA
    1. De volgende dag centrifugeer je bij 9650 x g gedurende 15 min bij 4 °C en gooi je het supernatant weg om een DNA-pellet te verkrijgen.
    2. Was de pellet drie keer met 1 ml koude 70% ethanol, centrifugeer op 9650 x g gedurende 15 minuten en gooi het supernatant weg.
    3. Droog de pellet ongeveer 10 minuten aan de lucht. Resuspendeer de pellet in 10-50 μL nucleasevrij gedestilleerd water (afhankelijk van de grootte van de DNA-pellet).
    4. Bewaar de monsters bij -20 °C voor latere verwerking of bij 4 °C 's nachts om een maximale dna-oplossing te garanderen, gevolgd door opslag bij -20 °C. U kunt ook direct doorgaan met stap 5.

5. Controle van dna-concentratie en zuiverheid

  1. Na het reinigen van het voetstuk van een microspectrofotometer met een delicate taakwisser, laadt u 1 μL van het DNA-preparaat.
  2. Let op de concentratie van het DNA in het monster. Controleer de absorptieverhoudingen bij zowel als figure-protocol-3 figure-protocol-4. DNA absorbeert bij 260 nm, eiwitten bij 280 nm en organische stoffen zoals fenol bij 230 nm. Een verhouding van 1,8-2 wordt voldoende geacht voor real-time PCR.

6. Kwantificering door real-time polymerasekettingreactie

  1. Bereiding van de PCR-reactiemengsels
    1. Plaats 5 μL van een SYBR groene real-time PCR mix in 0,2 ml PCR buizen. Voeg aan elke buis 1 μL 7,5 pmol/μL voorwaartse primer en 1 μL 7,5 pmol/μL omgekeerde primer toe. Voorwaartse primervolgorde: 5'-CCCTAGTGGTTTCGGACACA-3'; omgekeerde primersequentie: 5'-ACTTGCAAATGCTCTAGGCG-3'. Het gen dat is versterkt om het EBV-genoomkopienummer te bepalen, is het kleine RNA 2(EBER-2)-gen van het Epstein-Barr-virus .
    2. Voeg aan een van de buisjes 2 μL nucleasevrij water en 1 μL viraal DNA uit stap 4 toe. Het totale volume van het reactiemengsel is 10 μL.
      OPMERKING: Afhankelijk van de concentratie van DNA in het monster, kan een verdunningsstap nodig zijn. De verdunningsfactor F moet worden genoteerd en zal worden geïntegreerd in de formule in stap 6.3.
    3. Bereid andere buizen voor die als standaarden zullen worden gebruikt met bekende EBV-genoomkopienummers (1000, 2000, 5000, 10.000 en 54.000 kopieën).
  2. Laat de PCR-mengsels beginnen met een eerste stap van activering bij 95 °C gedurende 5 minuten, vervolgens 40 cycli bij 95 °C en 58 °C (gloeien) gedurende respectievelijk 15 s en 30 s.
  3. Genereer een qPCR-standaardcurve door de Ct-waarden van de normen uit te zetten tegen het logboek van het aantal EBV-genoomkopieën per standaardbuis. Met behulp van de standaard curve plot vergelijking, leidt u het aantal EBV-genoomkopieën af in de PCR-buis die het geïnduceerde virale DNA bevat. Gebruik vervolgens de volgende formule om de concentratie van het geïnduceerde virale preparaat te berekenen:
    figure-protocol-5
    Waarbij X het aantal EBV-genoomkopieën is dat is afgeleid van de standaardcurve en F de verdunningsfactor is die wordt gebruikt voor het opzetten van het DNA dat per PCR-reactie wordt gebruikt.

7. Controle op biologische activiteit/infectiviteit van de virale deeltjes

  1. Breng BC-3 cellen over van een 100 mm kweekplaat bij 80% confluentie naar een conische buis van 15 ml. De zaaidichtheid van P3HR-1 cellen is 1 x 106 cellen / ml. Handhaven in volledige RPMI kweekmedium (79% RPMI kweekmedium, 20% Foetaal Runderserum, 1% Pen-Strep antibioticum) bij 37 °C en 5% CO2, en passage om de 3-4 dagen.
  2. Tel de BC-3-cellen op dezelfde manier als de P3HR-1-cellen werden geteld door stap 1 te volgen. Voeg aan een plaat met 96 putten 105 BC-3-cellen toe aan elke put. Gebruik drie, zes, negen of 12 putten om de betekenis van de resultaten te garanderen en fouten te minimaliseren.
  3. Voeg een volume virale bouillon toe aan elk putje, afhankelijk van de concentratie van het virale preparaat bepaald in stap 6.3. De MOI kan variëren en optimalisatie van dit protocol zal de beste MOI voor infectie onthullen (een MOI-bereik van 2-50 wordt aanbevolen). Zorg ervoor dat het totale volume van het mengsel in elke put 250 μL is.
    1. Om het vereiste volume te bepalen, moet de concentratie van de virale voorraad bekend zijn en moet een MOI worden geselecteerd. Als de MOI bijvoorbeeld 2 is, moet het aantal toegevoegde virale deeltjes tweemaal het aantal cellen zijn. Bereken het volume V van de virale voorraad dat nodig is met behulp van de formule: figure-protocol-6, waarbij n het aantal benodigde virale deeltjes is en C de bekende concentratie van de virale voorraad
  4. Incubeer de inhoud van de 96-well plaat gedurende 5 dagen. Breng na 5 dagen de inhoud van elk putje over in een buis van 1,5 ml.
  5. Centrifugeer de buisjes op 120 x g gedurende 8 minuten om de cellen te scheiden van het virusbevattende kweekmedium. Onderwerp de celpellets en de supernatanten aan DNA-extractie gevolgd door real-time PCR-kwantificering om te controleren op de aanwezigheid van virale genomen in elke fractie, waardoor de infectiviteit van de virale deeltjes wordt beoordeeld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van deze procedure is om EBV-deeltjes te isoleren in een suspensie met bekende virale titer, die vervolgens kan worden gebruikt om EBV-infectie te modelleren. Het is dus van het grootste belang om optimale concentraties van de verschillende reagentia te gebruiken om de hoogste EBV-opbrengst uit de procedure te halen.

Een optimalisatiestudie werd uitgevoerd om de concentraties PMA en DMSO te bepalen die het hoogste aantal EBV-deeltjes zouden opleveren (figuur 2

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De productie van EBV-deeltjes is noodzakelijk voor het begrijpen van de biologie van dit virus en de bijbehorende ziekten. Hier beschreven we de productie van deze deeltjes uit de P3HR-1 cellijn. Deze cellijn is niet de enige EBV-producentenlijn; in feite zijn EBV-deeltjes ook geïsoleerd uit B95-8-cellen21,22 en de Raji-cellijn18,19. De EBV-lytische cyclus is in deze cellen geïnduceerd met n-butyraat. Als...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Financiering voor dit werk werd ondersteund door subsidies aan ER van het Asmar Research Fund, de Libanese Nationale Raad voor Wetenschappelijk Onderzoek (L-CNRS) en het Medical Practice Plan (MPP) aan de Amerikaanse Universiteit van Beiroet.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 mL thin-walled PCR tubesThermo ScientificAB0620Moet voor gebruik geautoclaveerd worden
0.2-10 µL Microvolume Filter TipsCorning4807Moet voor gebruik geautoclaveerd worden
0.5-10 µL PipetteBrandTech704770
10 mL Disposable Serological PipetteCorning4488
1000 µL Filtered Pipette TipsQSPTF-112-1000-Q
100-1000 µL PipetteEppendorf3123000063
100x20 mm Cuture PlatesSarstedt83.1802
10-100 µL PipetteBrandTech704774
15 mL Conical TubesCorning430791
200 µL Filtered Pipette TipsQSPTF-108-200-Q
20-200 µL PipetteEppendorf3123000055
50 mL Conical TubesCorning430828
CFX96 Real-Time C-1000 Thermal CyclerBio-Rad184-1000
DMSOAmresco0231
DNase/RNase Free WaterZymo ResearchW1001-1
EBER PrimersMacrogenN/ACustom Made Primers
EBV DNA Control (Standards)VircellMBC065
Ethanol (Laboratory Reagent Grade)Fischer ChemicalE/0600DF/17
Fetal Bovine SerumSigmaF9665
Fresco 21 MicroCentrifugeThermo Scientific10651805
Glycogen SolutionQiagen158930
HemocytometerBOECOBOE 01
Inverted Light MicroscopeZeissAxiovert 25
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-5121
Microcentrifuge TubeCostar (Corning)3621Moet voor gebruik geautoclaveerd worden
P3HR-1 Cell LineATCCHTB-62
Penicillin-Streptomycin SolutionBiowestL0022
PhenolVWR20599.297
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)Sigma-AldrichP8139
Pipette FillerThermo Scientific9501
Precision WipesKimtech7552
RPMI-1640 Culture MediumSigmaR7388
SL 16R CentrifugeThermo Scientific75004030
Sodium AcetateRiedel-de Haën (Honeywell)25022
SpectrophotomerDeNovixDS-11
Tris-HClSigmaT-3253
Trypan Blue SolutionSigmaT8154
Water Jacketed CO2 IncubatorThermo Scientific4121

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Epstein, M. A., Achong, B. G., Barr, Y. M. Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt's lymphoma. Lancet. 1 (7335), 702-703 (1964).
  2. Sample, J., et al. Epstein-Barr virus types 1 and 2 differ in their EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes. Journal of Virology. 64 (9), 4084-4092 (1990).
  3. Chang, M. S., Kim, W. H. Epstein-Barr virus in human malignancy: a special reference to Epstein-Barr virus associated gastric carcinoma. Cancer Research and Treatment. 37 (5), 257-267 (2005).
  4. Manet, E. Encyclopedia of Cancer. Schwab, M. , Springer. Berlin Heidelberg. 1602-1607 (2017).
  5. Babcock, G. J., Decker, L. L., Volk, M., Thorley-Lawson, D. A. EBV persistence in memory B cells in vivo. Immunity. 9 (3), 395-404 (1998).
  6. Khan, G., Miyashita, E. M., Yang, B., Babcock, G. J., Thorley-Lawson, D. A. Is EBV persistence in vivo a model for B cell homeostasis. Immunity. 5 (2), 173-179 (1996).
  7. Jha, H. C., Banerjee, S., Robertson, E. S. The role of gammaherpesviruses in cancer pathogenesis. Pathogens. 5 (1), 18(2016).
  8. El-Sharkawy, A., Al Zaidan, L., Malki, A. Epstein-Barr virus-associated malignancies: roles of viral oncoproteins in carcinogenesis. Frontiers in Oncology. 8, 265(2018).
  9. Vereide, D., Sugden, B. Insights into the evolution of lymphomas induced by Epstein-Barr virus. Advances in Cancer Research. 108, 1-19 (2010).
  10. Vereide, D. T., Sugden, B. Lymphomas differ in their dependence on Epstein-Barr virus. Blood. 117 (6), 1977-1985 (2011).
  11. Houen, G., Trier, N. H. Epstein-Barr virus and systemic autoimmune diseases. Frontiers in Immunology. 11, 587380(2020).
  12. Ortiz, A. N., et al. Impact of Epstein-Barr virus infection on inflammatory bowel disease (IBD) clinical outcomes. Revista Espanola de Enfermedades Digestivas. 114 (5), 259-265 (2021).
  13. Caplazi, P., et al. Mouse models of rheumatoid arthritis. Veterinary Pathology. 52 (5), 819-826 (2015).
  14. Kiesler, P., Fuss, I. J., Strober, W. Experimental models of inflammatory bowel diseases. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 1 (2), 154-170 (2015).
  15. Warde, N. Experimental arthritis: EBV induces arthritis in mice. Nature Reviews Rheumatology. 7 (12), 683(2011).
  16. Jog, N. R., James, J. A. Epstein Barr virus and autoimmune responses in systemic lupus erythematosus. Frontiers in Immunology. 11, 623944(2020).
  17. Shimizu, N., Yoshiyama, H., Takada, K. Clonal propagation of Epstein-Barr virus (EBV) recombinants in EBV-negative Akata cells. Journal of Virology. 70 (10), 7260-7263 (1996).
  18. Hsu, C. H., et al. Induction of Epstein-Barr virus (EBV) reactivation in Raji cells by doxorubicin and cisplatin. Anticancer Research. 22, 4065-4071 (2002).
  19. Nutter, L. M., Grill, S. P., Li, J. S., Tan, R. S., Cheng, Y. C. Induction of virus enzymes by phorbol esters and n-butyrate in Epstein-Barr virus genome-carrying Raji cells. Cancer Research. 47 (16), 4407-4412 (1987).
  20. Fresen, K. O., Cho, M. S., zur Hausen, H. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
  21. Glaser, R., Tarr, K. L., Dangel, A. W. The transforming prototype of Epstein-Barr virus (B95-8) is also a lytic virus. International Journal of Cancer. 44 (1), 95-100 (1989).
  22. Sairenji, T., et al. Inhibition of Epstein-Barr virus (EBV) release from P3HR-1 and B95-8 cell lines by monoclonal antibodies to EBV membrane antigen gp350/220. Journal of Virology. 62 (8), 2614-2621 (1988).
  23. Savage, A., et al. An assessment of the population of cotton-top tamarins (Saguinus oedipus) and their habitat in Colombia. PLoS one. 11 (12), 0168324(2016).
  24. Kallin, B., Klein, G. Epstein-Barr virus carried by raji cells: a mutant in early functions. Intervirology. 19 (1), 47-51 (1983).
  25. Fresen, K. O., Cho, M. S., Hausen, H. Z. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
  26. Bounaadja, L., Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Evaluation of Epstein-Barr virus, human herpesvirus 6 (HHV-6), and HHV-8 antiviral drug susceptibilities by use of real-time-PCR-based assays. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1244-1246 (2013).
  27. Buelow, D., et al. Comparative evaluation of four real-time PCR methods for the quantitative detection of Epstein-Barr virus from whole blood specimens. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (4), 527-534 (2016).
  28. Wu, D. Y., Kalpana, G. V., Goff, S. P., Schubach, W. H. Epstein-Barr virus nuclear protein 2 (EBNA2) binds to a component of the human SNF-SWI complex, hSNF5/Ini1. Journal of Virology. 70 (9), 6020-6028 (1996).
  29. Li, C., et al. EBNA2-deleted Epstein-Barr virus (EBV) isolate, P3HR1, causes Hodgkin-like lymphomas and diffuse large B cell lymphomas with type II and Wp-restricted latency types in humanized mice. PLoS Pathogens. 16 (6), 1008590(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Virus IsolationVirus QuantificationViral DNA ExtractionReal Time PCREBV Genome CopyCell CulturePMA InductionHemocytometer Counting

Gerelateerde artikelen