Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Analyse van door uithongering geïnduceerde autofagie in het Drosophila melanogaster larvale vetlichaam

2.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64282

⸱

4 augustus 2022

 , 
1Ministry of Education Key Laboratory of Biosystems Homeostasis and Protection and Innovation Center for Cell Signaling Network, Life Sciences Institute, Zhejiang University

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft de inductie van autofagie in het Drosophila melanogaster larvaal vetlichaam via nutriëntendepletie en analyseert veranderingen in autofagie met behulp van transgene vliegenstammen.

Samenvatting

Autofagie is een cellulair zelfverteringsproces. Het levert lading aan de lysosomen voor degradatie als reactie op verschillende spanningen, waaronder uithongering. De storing van autofagie wordt geassocieerd met veroudering en meerdere menselijke ziekten. De autofagiemachinerie is sterk geconserveerd - van gist tot mens. Het larvale vetlichaam van Drosophila melanogaster, een analoog voor gewervelde lever en vetweefsel, biedt een uniek model voor het monitoren van autofagie in vivo. Autofagie kan gemakkelijk worden geïnduceerd door uithongering van voedingsstoffen in het larvale vetlichaam. De meeste autofagie-gerelateerde genen worden bewaard in Drosophila. Er zijn veel transgene vliegenstammen ontwikkeld die gelabelde autofagiemarkers tot expressie brengen, wat de monitoring van verschillende stappen in het autofagieproces vergemakkelijkt. De klonale analyse maakt een nauwkeurige vergelijking mogelijk van autofagiemarkers in cellen met verschillende genotypen in hetzelfde stuk weefsel. Het huidige protocol beschrijft procedures voor (1) het genereren van somatische klonen in het larvale vetlichaam, (2) het induceren van autofagie via aminozuuruithongering en (3) het ontleden van het larvale vetlichaam, met als doel een model te creëren voor het analyseren van verschillen in autofagie met behulp van een autofagosoommarker (GFP-Atg8a) en klonale analyse.

Inleiding

Autofagie is een "zelf-etend" proces geïnduceerd door verschillende stress, waaronder aminozuurhonger1. Macroautofagie (hierna autofagie genoemd) is het meest bestudeerde type autofagie en speelt een onvervangbare rol bij het handhaven van cellulaire homeostase2. De storing van autofagie is geassocieerd met verschillende menselijke ziekten3. Bovendien zijn sommige autofagie-gerelateerde genen potentiële doelwitten voor de behandeling van verschillende ziekten4.

Autofagie wordt op een zeer geavanceerde manier gereguleerd5. Bij uithongering sequesteren de isolatiemembranen cytoplasmatische materialen om dubbelmembrane autofagosomen te vormen6. Autofagosomen fuseren dan met endosomen en lysosomen om amfosomen en autolysosomen te vormen. Met behulp van lysosomale hydrolytische enzymen wordt de overspoelde cytoplasmatische inhoud afgebroken en worden de voedingsstoffen gerecycled7.

Autofagie is een evolutionair geconserveerd proces8. Drosophila melanogaster is een geweldig model voor het bestuderen van het autofagieproces in vivo. Aminozuurhonger induceert gemakkelijk autofagie in vliegvet lichaamsweefsel, een analoog van menselijke lever en vetweefsel9. Defecten in autofagie verstoren de verschillende punctapatronen van verschillende autofagie-gerelateerde eiwitten, zoals Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 en p62, onder andere10. Daarom zal het analyseren van de patronen van deze autofagiemarkers helpen bij het onderscheiden van het optreden van autofagiedefecten en de defecte autofagiestap. Het ubiquitine-achtige eiwit Atg8 is bijvoorbeeld de meest gebruikte autofagiemarker11. In Drosophila melanogaster zijn transgene stammen met een groen fluorescerend eiwit (GFP)-gelabeld Atg8a met succes ontwikkeld12. GFP-Atg8a wordt verspreid in het cytosol en de kernen in de gevoede cellen. Bij uithongering wordt GFP-Atg8a verwerkt en gemodificeerd door fosfatidylethanolamine (PE) en vormt puncta, die de isolatiemembranen en volledig ontwikkelde autofagosomen labelen13,14. Door middel van directe fluorescentiemicroscopie kan de autofagie-inductie gemakkelijk worden waargenomen als een toename van GFP-Atg8 punctavorming15. Atg8a puncta zou zich niet vormen als reactie op uithongering in de aanwezigheid van een autofagie-initiatiedefect. Omdat GFP-Atg8a kan worden geblust en verteerd door de lage pH in autolysosomen, kan GFP-Atg8a puncta in aantal toenemen als autofagie in late stadia wordt geblokkeerd16.

Omdat autofagie zeer gevoelig is voor de beschikbaarheid van voeding17, leiden kleine verschillen in kweekomstandigheden vaak tot variaties in fenotypen. Daarom heeft klonale analyse, een methode die mutante cellen analyseert versus wild-type controlecellen in hetzelfde weefsel, een groot voordeel bij het ontleden van autofagiedefecten18. Door gebruik te maken van flippase / flippase recognition target (FLP / FRT) -gemedieerde site-specifieke recombinatie tussen homologe chromosomen, worden vliegen die mozaïekweefsels dragen gemakkelijk gemaakt19,20. De wild-type cellen rond de mutante cellen vormen een perfecte interne controle om individuele verschillen te voorkomen21.

De huidige studie beschrijft hoe autofagie te induceren door aminozuurhonger en GFP-Atg8a-expressie mozaïekvetweefsels te genereren. Deze protocollen kunnen worden gebruikt voor het analyseren van verschillen in autofagie tussen gemuteerde klonen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Drosophila kruising en het leggen van eieren

  1. Introduceer 3 mannelijke (genotype hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) en 15 vrouwelijke (genotype y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP ) volwassen vliegen (zie tabel met materialen) in een kweekflacon (met standaard maïsmeel/melasse/agar Drosophila media bij 25 °C) voor paring.
    OPMERKING: Meerdere kweekflacons van hetzelfde kruis moeten worden opgezet om ervoor te zorgen dat er voldoende larven zijn voor verdere experimenten. De mannelijke vliegenstam met genotype hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a draagt een FRT-plaats op het X-chromosoom nabij het centromeer (FRT19A). Het drukt ook FLP uit bij een hitteschok bij 37 °C. Een transgen met alomtegenwoordige RFP-expressie wordt ingebracht op het X-chromosoom. GFP-Atg8a wordt uitgedrukt onder controle van cgGal4 in het larvale vetlichaam22. De vrouwelijke vliegenstam met genotype y' w* Mu FRT19A / FM7, Kr GFP draagt een dodelijke mutatie (Mu) en FRT19A op het X-chromosoom. Het gedetailleerde kruisingsschema is weergegeven in figuur 1.
  2. Breng voor het leggen van eieren de vliegen over naar een nieuwe kweekflacon. Tik 48 uur na introductie op de "paring" injectieflacon totdat de vliegen verdoofd zijn en op de media aan de basis van de injectieflacon vallen.
    1. Koppel de "paringsinjectieflacon" los en bedek de mond met een niet-aangesloten omgekeerde injectieflacon met verse media (injectieflacon met verse cultuur). Breng vervolgens de vliegen over naar de injectieflacon met verse cultuur door de injectieflacons om te draaien en erop te tikken.
    2. Sluit de verse kweekflacon (met de overgedragen vliegen) aan en gooi de oude kweekflacon weg. Plaats deze injectieflacon met verse cultuur in een broedmachine van 25 °C voor het leggen van eieren op de verse media.
      OPMERKING: Het voorverwarmen van de verse kweekflacons tot 25 °C gedurende 15 minuten vóór het vliegenoverdrachtsproces zal de vliegen helpen zich snel aan te passen aan de nieuwe omgeving en het leggen van eieren versnellen.
  3. Verwijder de vliegen na 6 uur eieren leggen. Als de experimenten moeten worden herhaald, breng deze vliegen dan over in een andere kweekflacon (zoals beschreven in stap 1.2). Gooi de vliegen anders weg door ze in een kolf met 75% ethanol te dumpen).
    1. Incubeer de injectieflacon met embryo's in een waterbad van 37 °C gedurende 1 uur om FLP-expressie te induceren. Plaats ze vervolgens in een incubator van 25 °C en laat de embryo's zich verder ontwikkelen.
      OPMERKING: De succesvolle vorming van gemuteerde klonen kan vervolgens worden bevestigd door middel van beeldvorming. De afwezigheid van RFP-signalen markeert de mutante klonen.

2. Aminozuurhonger induceert autofagie

  1. Schep met behulp van een laboratoriumspatel de media met de zich ontwikkelende larven 75 uur na het leggen van het ei in een petrischaaltje. Voeg 3 ml 1x PBS toe aan het gerecht en scheid voorzichtig de kweekmedia en de larven met een lange tang. Selecteer 10 tot 15 vroege derde instarlarven.
    OPMERKING: Vroege derde instarlarven moeten zorgvuldig worden gekozen. Het ontwikkelingsstadium van de larven is van cruciaal belang voor het succes van dit protocol. Vanwege de beperkte legduur van het ei wordt verwacht dat de meeste larven in de kweekflacon zich in het vroege derde instarstadium bevinden tegen 75 uur incubatie. Verschillende recepten voor cultuurmedia kunnen echter leiden tot variaties in de ontwikkelingstiming van de larven. De criteria voor het onderscheiden van vroege derde instarlarven zijn de lichaamslengte, de aanwezigheid van voorste en achterste spiracles, evenals de mandibulaire haken van het mondapparaat23.
  2. Vul de putjes van een 9-well glazen drukspotplaat (zie Materiaaltabel) met 1x PBS. Plaats de afgescheiden derde instarlarven in de putjes met een lange tang en was de larven grondig om alle mediaresten te verwijderen.
  3. Neem 5 ml 20% sucrose (in 1x PBS) oplossing in een lege injectieflacon en plaats de schone derde instarlarven in deze oplossing met een lange tang. Incubeer deze injectieflacon gedurende 6 uur in een incubator van 25 °C voordat u ze oogst voor dissectie.
    OPMERKING: De 20% sucrose (in 1x PBS) oplossing dient als het aminozuur-deficiënte uithongeringsmedium.

3. Derde instar larven dissectie en monsterweefselverwerking

  1. Slijp twee paar #5 tangen (zie Materiaaltabel) gelijkmatig aan beide zijden met een slijpsteen.
  2. Voeg 400 μL 1x PBS toe aan elke put van de 9-well glazen depressiespotplaat en breng de larven met een lange tang over in de putjes. Plaats een larve in een put met de dorsale kant (de kant met de luchtpijp) naar boven gericht.
    1. Pak de cuticula van de larve vast met twee #5 tangen in het midden van de larvale stam en scheur voorzichtig de nagelriemen open. De blootgestelde vetlichamen, samen met andere larvale interne weefsels, zullen nog steeds aan het karkas van de larve worden bevestigd. Trek voldoende om de inwendige organen zoveel mogelijk bloot te leggen. Herhaal deze stap voor alle larven.
      OPMERKING: Elke larve heeft twee grote stukken vetlichaam langs de lichaamsstam. Vet lichaamsweefsel is een witte, ondoorzichtige en platte monolaag die gemakkelijk kan worden onderscheiden onder de dissectiemicroscoop24.
  3. Breng het larvale karkas over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met 500 μL 4% paraformaldehyde (PFA). Incubeer gedurende 30 minuten bij 25 °C zonder de buizen te schudden.
    LET OP: 4% PFA is giftig. Draag handschoenen en maskers ter bescherming.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 4% PFA in 1x PBS-buffer te bereiden. PFA poeder lost niet direct op in 1x PBS. Daarom moet het mengsel gedurende een nacht bij 65 °C in een incubator worden geïncubeerd of met tussenpozen gedurende 45 minuten bij 25 °C worden geschud.
  4. Na 30 minuten incubatie van het karkas met 4% PFA, pipetteer de PFA-oplossing, voeg 500 μL 1x PBS toe aan de buis en schud de buis voorzichtig op een platte rotator gedurende 10 minuten voordat u de 1x PBS-oplossing weggooit (herhaal 3x).
  5. Breng met een lange tang het vaste en gewassen larvale karkas over naar een put in de 9-depressieve spotplaat gevuld met 1x PBS. Gebruik # 5 tang en verwijder alle niet-vette lichaamsweefsels.
  6. Gebruik # 5 tang om de stukjes van het vetlichaam op een microscoopglaasje te monteren met 80% glycerol als montagemedium en leg er een coverslip op.
    OPMERKING: Controleer voor de montage de pH van de 80% glycerol (met behulp van pH-papier, pH = 7 is optimaal) om het GFP-signaal te beschermen. Montagemedia (zie materiaaltabel) met DAPI in 80% glycerol helpen bij het in beeld brengen van de kernen van vetlichaamscellen. Deze glaasjes zijn 1 week stabiel wanneer ze in het donker bij 4 °C worden bewaard.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Onder gevoede omstandigheden wordt het GFP-gelabelde ubiquitine-achtige eiwit, GFP-Atg8a, verspreid in de cellen. Bij uithongering vormt het groene puncta en labelt het autofagosomen. Zodra autofagosomen versmelten met lysosomen, wordt GFP geblust in de zure autolysosomen en verdwijnen de groene puncta. Als autofagie niet wordt geïnduceerd of de rijping van het autofagosoom wordt versneld, zal het aantal GFP-puncta naar verwachting laag zijn. Als de fusie tussen autofagosomen en lysosomen echter wordt geblokkeerd of als ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het huidige protocol beschrijft de methoden om (1) vliegen te genereren die gemuteerde klonen in de larvale vetlichamen dragen, (2) autofagie te induceren door aminozuurhonger en (3) de larvale vetlichamen te ontleden. Om met succes klonen in de larvale vetlichamen te genereren, moeten de volgende kritieke stappen ijverig worden uitgevoerd. (1) Het nauwkeurig timen van de hitteschok is cruciaal omdat mitotische recombinatie alleen optreedt wanneer het weefsel mitose ondergaat, en (2) zowel de temperatuur als de duur van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Dankbetuigingen

We zijn THFC en BDSC dankbaar voor het leveren van de vliegsoorten. Dr. Tong Chao wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (32030027, 91754103, 92157201) en fundamentele onderzoeksfondsen voor de centrale universiteiten. We danken de kernfaciliteit in het Life Sciences Institute (LSI) voor het verlenen van diensten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL microcentrifuge tubeAxygenMCT-150-C
#5 ForcepsDumontRS-5015
9 Dressions Spot platePYREX7220-85
Fluorescence MicroscopeNikonSMZ1500
GlycerolSangon BiotechA100854-0100
KClSangon BiotechA610440-0500Samenstelling van 1x PBS-oplossing
KH2PO4Sangon BiotechA600445-0500Samenstelling van 1x PBS-oplossing
Laboratory spatulaFisher14-375-10
Long forcepsR' DEERRST-14
Microscope cover glassCITOTEST80340-1130
Microscope slidesCITOTEST80302-2104
Na2HPO4Sangon BiotechA501727-0500Samenstelling van 1x PBS-oplossing
NaClSangon BiotechA610476-0005Samenstelling van 1x PBS-oplossing
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
Petri dishCorning430166
Standard cornmeal/molasses/agar fly foodTong Lab-made
Stereo microscopeNikonSMZ745
SucroseSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.10021418
Vectashield antifade mounting medium with DAPIVectorlabratoryH-1200-10Aanbevolen montagemedium
Vliegstammen
y'w* Iso FRT19ATong Lab's vliegstammen
y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFPTong Lab's vliegstammen
y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFPTong Lab's vliegstammen
hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8aTong Lab's vliegstammen

Referenties

  1. Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. Autophagy: Molecular machinery for self-eating. Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).
  2. Jin, S., White, E. Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress. Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).
  3. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  4. Mizushima, N., et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).
  5. Yang, Z., Klionsky, D. J. Eaten alive: A history of macroautophagy. Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).
  6. Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).
  7. Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes...Wait,I'mconfused. Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).
  8. Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes. Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).
  9. Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body. Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).
  10. Liu, W., et al. Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity. Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).
  11. Ichimura, Y., et al. A ubiquitin-like system mediates protein lipidation. Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).
  12. Rusten, T. E., et al. Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway. Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).
  13. Nishida, Y., et al. Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy. Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).
  14. Ravikumar, B., et al. Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).
  15. Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation. Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).
  16. Shintani, T., Klionsky, D. J. Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).
  17. Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. Autophagy regulation by nutrient signaling. Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).
  18. Nagy, P., et al. How and why to study autophagy in Drosophila: It's more than just a garbage chute. Methods. 75, 151-161 (2015).
  19. Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59 (3), 499-509 (1989).
  20. Senecoff, J. F., Cox, M. M. Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing. Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).
  21. Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. Mosaic analysis in Drosophila. Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).
  22. Zappia, M. P., et al. E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes. eLife. 10, 67753(2021).
  23. Demerec, M. Biology of Drosophila. , Hafner Pub. Co. New York, NJ. (1965).
  24. Rizki, R. M., et al. Drosophila larval fat body surfaces. Wilhelm Roux's Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).
  25. Szeto, J., et al. ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy. Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).
  26. Renna, M., et al. Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).
  27. Guo, S., et al. A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages. Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).
  28. Tian, W., et al. An antibody for analysis of autophagy induction. Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).
  29. Nezis, I. P. Selective autophagy in Drosophila. International Journal of Cell Biology. 2012, 146767(2012).
  30. Chu, Y., et al. Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology. Materials. 14 (15), 4180(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Vetlichaam van Drosophila-larvenclonale analyseaminozuurgebrekGFP-Atg8a-markergeneratie van somatische klonenautofagiemarkersmozaïekanalyseselectieve autofagiemonitoring van mitofagie
Analyse van door uithongering geïnduceerde autofagie in het Drosophila melanogaster larvale vetlichaam
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.