Clearing en fluorescentiemicroscopie combineren voor het visualiseren van veranderingen in genexpressie en fysiologische reacties op Plasmodiophora brassicae

Summary

Het huidige protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode voor de histologische observatie van gallen geïnduceerd door Plasmodiophora brassicae. Vibratome-secties van hypocotylen worden gewist vóór fluorescentiebeeldvorming om de betrokkenheid van transcriptiefactoren en fytohormonen tijdens ziekteprogressie te bestuderen. Dit protocol overwint de beperkingen van de inbedding van hars, waardoor planta-visualisatie van fluorescerende eiwitten mogelijk wordt.

Abstract

Infectie van Brassica-gewassen door de bodemgebonden protist Plasmodiophora brassicae leidt tot galvorming op de ondergrondse organen. De vorming van gallen vereist cellulaire herprogrammering en veranderingen in het metabolisme van de geïnfecteerde plant. Dit is nodig om een pathogeen-georiënteerde fysiologische sink vast te stellen waarnaar de voedingsstoffen van de gastheer worden omgeleid. Voor een volledig begrip van deze specifieke plant-pathogeen interactie en de mechanismen waarmee gastheergroei en -ontwikkeling worden ondermijnd en gerepatterd, is het essentieel om de interne veranderingen die gepaard gaan met galvorming met cellulaire resolutie te volgen en te observeren. Methoden die fluorescerende vlekken en fluorescerende eiwitten combineren, worden vaak gebruikt om anatomische en fysiologische reacties in planten te bestuderen. Helaas fungeren de grote omvang van gallen en hun lage transparantie als belangrijke hindernissen bij het uitvoeren van waarnemingen van de hele montage onder de microscoop. Bovendien beperkt lage transparantie het gebruik van fluorescentiemicroscopie om de progressie en galvorming van clubrootziekte te bestuderen. Dit artikel presenteert een geoptimaliseerde methode voor het fixeren en verwijderen van gallen om epifluorescentie en confocale microscopie te vergemakkelijken voor het inspecteren van P. brassicae-geïnfecteerde gallen. Een weefselzuiveringsprotocol voor snelle optische clearing werd gebruikt, gevolgd door vibratome-secties om anatomische veranderingen te detecteren en genexpressie te lokaliseren met promotorfusies en reporterlijnen die zijn getagd met fluorescerende eiwitten. Deze methode zal nuttig zijn voor het bestuderen van cellulaire en fysiologische reacties in andere door pathogenen geactiveerde structuren in planten, zoals door nematoden geïnduceerde syncytia en wortelknopen, evenals bladgallen en vervormingen veroorzaakt door insecten.

Introduction

Planten die zijn aangetast door ziekteverwekkers of insecten kunnen abnormale structuren ontwikkelen (orgaanvervormingen of gallen), waardoor de indringer voedingsstoffen kan opnemen en zich kan voortplanten¹. Hier werd een efficiënte histopathologische benadering gevolgd om de veranderingen te bestuderen die plaatsvinden in gallen die zich ontwikkelen op de ondergrondse delen van planten die zijn geïnfecteerd met de protist Plasmodiophora brassicae (figuur 1). De kleine draad die geassocieerd wordt met deze ziekteverwekker komt voort uit het feit dat P. brassicae rustende sporen hun vermogen om planten binnen te dringen vele jaren kunnen behouden. In het geval van grootschalige teelt van koolzaad (Brassica napus) is dit een ernstig probleem, aangezien economische factoren de vruchtwisseling beperken, wat leidt tot sporenophoping in de bodem². De weerstand van koolzaad tegen clubrootziekte veroorzaakt door P. brassicae is genetisch bepaald. Helaas is de ziekteverwekker vaak de resistentie te slim af vanwege zijn biologie en de smalle genetische pool waaruit koolzaad is ontstaan. Daarom is het relevant geworden om de post-infectieresponsen in waardplanten te bestuderen en hun vermogen om de progressie van de ziekte te vertragen of te voorkomen dat bepaalde symptomen zich ontwikkelen.

Bij clubrootziekte wordt de ernst over het algemeen geëvalueerd op basis van de ontwikkeling van gallen en de mate van schade aan het wortelstelsel. Dit staat bekend als de Disease Index-DI³. Het geeft echter niet volledig de ware beoordeling van deze plant-pathogeen interactie weer. In het bijzonder gaat het niet in op hoe het pathogeen in de wortels wordt verdeeld en of de plant zich kan bedwingen P. brassicae beweging in zijn weefsels. Verder is het niet eenvoudig om te anticiperen in welke mate P. brassicae herprogrammeert ondergrondse orgaananatomie. Studies over de modelfabriek Arabidopsis thaliana hebben aangetoond dat P. brassicae infectie leidt tot de remming van xylogenese (zowel de initiatie- als rijpingsstappen) en de verbetering van floëemdifferentiatie in gallen^4,5. Bovendien, in wortels en hypocotylen van geïnfecteerde planten, verlaat cambiale cel nakomelingen de mitotische toestand niet en prolifereert langer dan in gezonde planten⁶. Dit proces regelt de uiteindelijke grootte van de gal en bepaalt het aantal pathogene rustsporen dat in de geïnfecteerde plant wordt geproduceerd. P. brassicae-gedreven ontwikkelings-, metabole en fysiologische herprogrammering in de gastheer is zeer complex⁷; daarom is de toepassing van hulpmiddelen die de inspectie van interne veranderingen in gallen mogelijk maken, cruciaal voor het goed beoordelen van deze interactie. De levenscyclusprogressie van P. brassicae gaat gepaard met herprogrammering van het metabolisme van de gastheercel, dat kan worden waargenomen als zetmeel- of lipideafzetting^7,8. Het belangrijkste obstakel voor de succesvolle microscopie van gallen komt van hun lage transparantie. Hierdoor zijn de meeste histologische specimens die clubroot-gedreven veranderingen in gallen vertonen, afkomstig van fixatie-inbedding (was of hars) technieken gevolgd door microtoomsectie. Dergelijke benaderingen werden met succes gebruikt voor het lokaliseren van de promotoractiviteit voor tal van genen die actief zijn in clubroot galls^4,5 of verschillende kleuringstechnieken die de waarneming van P. brassicae progressie van de levenscyclus⁹. Er moet echter worden opgemerkt dat de fixatie- en inbeddingsfasen tijdrovend zijn en resulteren in gedeeltelijke of volledige uitspoeling van belangrijke biomoleculen (bijv. Lipiden), waardoor bepaalde waarnemingen aanzienlijk worden belemmerd. Onlangs P. brassicae levenscyclusprogressie in de gastheer werd gevisualiseerd met behulp van de fluorescente in situ hybridisatie (FISH), waarbij een SABATH-type methyltransferase (PbBSMT) genspecifieke sonde werd gebruikt om de vorming van sporen in rust te markeren¹⁰. Een goed alternatief is het gebruik van andere op fluorescentie gebaseerde methoden waarbij de autofluorescentie van sommige cellulaire componenten, de activiteit van 5'- stroomopwaarts regulerende regio's van genen gefuseerd tot fluorescerende eiwitmarkers en de accumulatie van bepaalde fluorescerend getagde eiwitten kunnen worden gezien. Naast de lage transparantie van de monsters is een groot nadeel van dergelijke objecten het werken met niet-gefixeerde exemplaren, waardoor de tijd waarin afbeeldingen van goede kwaliteit kunnen worden gedocumenteerd, aanzienlijk wordt verkort. In 2015 hebben Kurihara et al.¹¹ ontwikkelde een clearing reagens, dat het behoud van fluorescerende eiwitten mogelijk maakt en de transparantie van plantenweefselmonsters verhoogt. Bovendien is het compatibel met tal van histologische vlekken. Onlangs werd dezelfde techniek met succes toegepast om verschillende celwandcomponenten in plantenweefsels te visualiseren^12,13. Hier is dit protocol gebruikt om verschillende aspecten van de ontwikkeling van clubwortelgalen te analyseren. De workflow begint met de fixatie van gallen, vibratomsectie, weefselzuivering, kleuring en fluorescentiebeeldvorming. Afhankelijk van iemands behoeften, direct of na bepaalde kleuring, kunnen de resulterende secties worden onderworpen aan inspectie onder een epifluorescentie of confocale microscoop. Deze methode biedt een effectieve oplossing om lokale veranderingen in genexpressie en fysiologische reacties te bestuderen, inclusief fytohormoonbalans en signalering. Ziekteprogressie kan worden gevolgd door te kijken naar het distributiepatroon van rustende sporen en rijpingsdynamiek. Bovendien kan het protocol eenvoudig worden toegepast voor veranderingen in de beeldkarakteristiek binnen P. brassicae geïnfecteerde planten, inclusief de remming van xylogenese of de verdedigingsreacties van de waardplant die zichtbaar zijn als lokale lignificatie in resistente genotypen. Voorbeelden in dit protocol zijn afkomstig van beeldvorming uitgevoerd op de Arabidopsis thaliana model; het protocol kan echter ook worden toegepast op andere gewassoorten die behoren tot de Brassicaceae Familie. De hieronder beschreven methode zal toekomstige gedetailleerde studies van cellulaire structuren en moleculaire veranderingen die gepaard gaan met galvorming in P. brassicae-geïnfecteerde planten.

De algemene workflow van het protocol is vrij eenvoudig en alle stadia van galontwikkeling kunnen gemakkelijk worden afgebeeld en gekarakteriseerd (figuur 2). Aangezien P. brassicae een bodempathogeen is, moeten alle experimenten worden uitgevoerd in bodemsystemen. De ziekteverwekker geeft de voorkeur aan zure omstandigheden; daarom moeten niet-kalkbehandelde bodemsubstraten worden gebruikt. Hoewel P. brassicae geen bedreiging vormt voor de mens, is het strikt een plantpathogeen dat zich via bodem en water kan verspreiden. Daarom moeten alle delen van de geïnfecteerde plant, evenals de grond, na het experiment worden vernietigd door autoclaveren of door behandeling met bleekmiddel.

Protocol

1. Groeiomstandigheden van planten

1. Kweek Arabidopsis thaliana planten in een kortdaags lichtregime met 9 uur licht bij 22 °C en 15 uur donker bij 20 °C en een bestralingssterkte van 120 μmol·m⁻²s⁻¹ (gemeten als de fotosynthetisch actieve straling, PAR op het niveau van het bladerdak, zie Materiaaltabel).

2. Bereiding van sporen inoculum

OPMERKING: Voor details, zie Fuchs et ^al.14.

1. Homogeniseer twee tot drie bevroren gallen van Chinese koolplanten (Brassica rapa var. pekinensis cultivar "Granaat") in een blender met 300 ml geautoclaveerd gedestilleerd water en filter door vier lagen steriel gaas.
2. Centrifugeer het filtraat (bij 6.000 x g, gedurende 5 minuten en bij 4 °C) en verwijder de zetmeellaag mechanisch uit de sporenpellet met behulp van een spatel. Herhaal dit proces totdat het grootste deel van het zetmeel is verwijderd.
3. Bepaal de sporenconcentratie met behulp van een hemocytometer¹³ door het aantal sporen in 20 verschillende veldgebieden te tellen.
4. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van sporensuspensie die wordt gebruikt voor het inenten 1 x 10⁶ sporen·ml⁻¹ is voor Arabidopsis thaliana. Ent elke plant 20 dagen na ontkieming met 2 ml gekalibreerde sporensuspensie.

3. Weefselvoorbereiding en fixatie

1. Bereid het plantenweefsel voor.
   1. Verwijder voorzichtig grond uit de wortelsystemen van met clubwortel geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde planten. Reinig grondig met water en verzamel hypocotylen en gallen (lengte tussen 0,5-2 cm) in microcentrifugebuizen.
2. Voer PFA-fixatie uit (4% paraformaldehyde, PFA in 1x PBS + 0,01% Triton X-100) volgens de onderstaande stappen.
   1. Voeg 4 g PFA-poeder (zie materiaaltabel) toe aan 100 ml PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing, pH 7.4, tabel 1) door te roeren bij 65 °C (niet koken). Gebruik KOH (10 M en 1M) druppelsgewijs om een heldere oplossing te verkrijgen met een pH van ongeveer 11.
   2. Pas de pH aan met H₂SO₄ om deze terug te brengen tot 6,9 en voeg 0,01% (v/v) Triton X-100 toe om de fixatie te verbeteren. Bewaar de oplossing bij −20 °C (niet opnieuw invriezen) of bewaren bij 4 °C.
3. Voer weefselfixatie uit.
   1. Bevestig de monsters in 200-500 μL PFA-fixatief gedurende 1 uur bij kamertemperatuur door een constant vacuüm (700 mbar) toe te passen met behulp van een vacuümpomp. Zorg ervoor dat het object volledig is ondergedompeld in de PFA-oplossing.
      OPMERKING: Monsters kunnen een paar weken bij 4 °C (koelkast) worden bewaard en later worden gebruikt voor het snijden.

4. Inbedding en sectie van weefsel

1. Gebruik 4% w/v agarose voor agarose inbedding van niet-geïnfecteerde hypocotylen en geïnfecteerde gallen. Kook de oplossing om agarose op te lossen en giet het wanneer het afkoelt terwijl het nog stroperig is.
2. Droog het voorwerp een paar seconden lichtjes op een tissue om overtollige PFA te verwijderen.
3. Gebruik tandenstokers/tangen om het plantobject zorgvuldig in te bedden en te oriënteren in agarose. Om schuine secties te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat het object correct is georiënteerd en gegoten, zodat de as loodrecht staat op het vlak van het vibratomeblad (voor radiale secties).
4. Om het agarose stollen te versnellen, plaatst u de petri- of multicultuurplaat gedurende 10 minuten op 4 °C.
   OPMERKING: Als het object te groot is (zoals in het geval van grotere gallen van Arabidopsis 21 dagen na inenting [DPI]), kan het object zelfs zonder inbedding in agarose worden gesneden.

5. Vibratome sectie

OPMERKING: De vibratome is uitgerust met een vibrerend scheermesje om door plantenorganen / weefsel te snijden. De trillingssnelheid, amplitude, hoek van het blad en sectiedikte zijn allemaal parameters die kunnen worden aangepast (zie Materiaaltabel).

1. Snijd en vorm het object zorgvuldig met behulp van een mes in een agarose-blok, waarbij u de voorkeursoriëntatie voor secties noteert.
2. Plak het agaroseblok/de grote gal om het goed op de monsterhouder te monteren met behulp van cyanoacrylaat/instantlijm en afplaktape (zie Materiaaltabel).
3. Voor Arabidopsis hypocotylen en gallen (vroege stadia), houd de dikte van secties tussen 30-40 μm voor het verkrijgen van beelden van goede kwaliteit.
   OPMERKING: Voor het analyseren van de latere stadia van galprogressie kan de dikte van secties tussen 50-80 μm liggen.
4. Vermijd het snijden van dunnere secties omdat het het galmonster kan vernietigen als gevolg van de trillingen van het bewegende mes.
5. Pas de dikte voor secties, snelheid en trillingsamplitude aan op basis van de dikte en grootte van de gal (40 μm of 60 μm).
6. Voeg gedestilleerd water toe aan het waterbad en begin met secties.
7. Verzamel secties zorgvuldig met behulp van een tang of borstel en breng ze over in een microcentrifugebuis met 1 ml 1x PBS-buffer (pH 7,4).
   OPMERKING: Typisch, hoe hoger de trillingsamplitude, hoe beter de sectiekwaliteit. Voor niet-geïnfecteerde hypocotylen of gallen die geen volwassen rustsporen bevatten, kan de trillingsamplitude op 1,2 mm worden gehouden met een snelheid van 0,60 ^mm-s−1 . In het geval van grote gallen met gedeeltelijk verlies van cellulaire integriteit en zichtbare tekenen van sporenrijping, moet de trillingsamplitude worden verlaagd tot 0,55 mm met een snelheid van 0,45 ^mm-s−1 .

6. Opruiming van specimens

1. Verwijder 1x PBS uit de microcentrifugebuis en voeg 200-500 μL clearingoplossing toe (tabel 1).
2. Bewaar de monsters voortaan bij kamertemperatuur in het donker. Zorg ervoor dat de objecten altijd ondergedompeld zijn in de clearingoplossing.
3. Vervang de clearingoplossing door de nieuwe als de kleur na enige tijd tijdens de monsterverwerking verandert.
   OPMERKING: De kleur van de clearingoplossing kan geelachtig worden als gevolg van monsterverwerking. In een dergelijk geval wordt het vervangen van de oplossing aanbevolen om het opruimen van weefsels te verbeteren.

7. Kleuringsprocedure

1. Voor Calcofluor witte kleuring voor de celwanden (voor het uitzetten van plantencellen), bereid 5% v/v calcofluor witte vlek (zie tabel met materialen) in de clearing oplossing. Vlek gedurende minstens 5 minuten in het donker.
2. Voor het kleuren van lipiden met Nijlrood (voor het kleuren van rustende sporen en oliedruppels in geïnfecteerde cellen), bereidt u 1 mg / ml van de bouillon (zie materiaaltabel) in de opruimoplossing. Verdun het verder om 1:99 te verkrijgen. Vlek gedurende minstens 10 minuten in het donker.
3. Bereid voor basic fuchsine lignine kleuring 0,2% w/v van de vlek (zie materiaaltabel) in de opruimoplossing. Vlek gedurende minstens 10 minuten in het donker.
   OPMERKING: Tijdens dubbele kleuring worden monsters eerst gedurende 10 minuten gekleurd met Nile Red voordat Calcofluor white wordt aangebracht. De overtollige kleuringsoplossingen werden na elke stap verwijderd. Als het object overvlekt lijkt, verwijder dan de overtollige vlek door te wassen met de opruimoplossing. Verdun vlekken met behulp van de opruimoplossing, indien nodig. Beits het monster altijd met Nile Red/Basic Fuchsin voordat calcofluorkleuring plaatsvindt. Eerst kleuren met Calcofluor kan een goede kleuring van de sporen door Nile Red voorkomen.

8. Microscopie

1. Monteer gewiste secties op de microscopiedia en observeer onder een epifluorescentie of een confocale microscoop (zie Materiaaltabel). Gebruik de opruimoplossing als montagemedium om uitdroging van het monster te voorkomen.
2. Gebruik meerdere acquisitiemodi om meer dan één fluorescentiespectrum tegelijkertijd in beeld te brengen.
   OPMERKING: De excitatie/emissiespectra die in het gepresenteerde protocol worden gebruikt, zijn als volgt: voor Nile Red 553/636 nm, voor xyleemautofluorescentie 380/475 nm, voor Basic Fuchsin 561/650 nm, voor Calcofluorwit 405/475 nm, voor erRFP 585/608 nm en voor GFP 488/509 nm (tabel 2).

Results

Met Nile Red dat lipiden en suberine kleurt, is het mogelijk om de pathogene rustende sporen met lipiden te bekijken (figuur 3A, B). Vandaar dat met behulp van dubbele kleuring scherpe beelden kunnen worden verkregen om te kijken naar het patroon van pathogene distributie in de gallen. Counterstaining met Calcofluor wit creëert contrast en helpt om tegelijkertijd xyleemontwikkeling te volgen met P. brassicae rijping (figuur 3B).

Xyleemvorming en -ontwikkeling kunnen ook worden gecontroleerd door autofluorescentie in niet-gekleurde monsters te observeren (figuur 4A) of door vlekken zoals Basic Fuchsin te gebruiken die op fluorescentie gebaseerde beeldvorming van lignine mogelijk maken (figuur 4B).

Door deze methode te gebruiken, zou men genexpressieveranderingen of reacties op groeiregulatoren kunnen volgen. Een perfect voorbeeld is waar Arabidopsis-planten met pHCA2:erRFP-construct werden gebruikt om hoge CAMBIALE ACTIVITEIT 2 (HCA2) genexpressie in floëemweefsel in clubwortelgalen te visualiseren. HCA2-genactiviteit is eerder gevonden in meristematicaly actieve cambium- en floëemlijncellen¹⁵. Hier lokaliseert het samen met het floëem in de late stadia van P. brassicae-gedreven galontwikkeling, en de activiteit ervan weerspiegelt hoe P. brassicae de floëemcomplexiteit verhoogt (figuur 5). De resulterende afbeelding toont floëemproliferatie in het late stadium van de galontwikkeling wanneer het cambium gefragmenteerd raakt. Figuur 5A toont een niet-gekantelde handsectie van de gal, terwijl figuur 5B meer scherpe en gelokaliseerde fluorescerende signalen laat zien die worden verkregen door vibratomsectie gevolgd door weefselopruiming. De objecten waren gecounterd met Calcofluor wit. Figuur 6 vergelijkt deze afbeelding (figuur 6B) met een vergelijkbaar gebied dat is afgebeeld in in hars ingebedde en microtoomgesneden gallen (figuur 6A) bij 21 DPI. Differentiële cytokinineresponsen tussen geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde planten werden beoordeeld door de expressie van de TCS:GFP (Two Component Signalling) marker¹⁶ in ontwikkelende gallen te controleren (figuur 7). Bij het afbeelden van zwakke GFP-signalen in gallen en weefsels met secundaire verdikkingen, is het belangrijk op te merken dat extra achtergrondsignaal als gevolg van autofluorescentie van volwassen xyleemcellen ook wordt vastgelegd tijdens beeldvorming.

Figuur 1: Symptomen van de ziekte van Clubroot bij koolzaad (B. napus) en Arabidopsis thaliana (Columbia-0) bij 26 DPI met Plasmodiophora brassicae sporen. In de loop van de ziekte ontwikkelen zich grote gallen op het hele wortelstelsel, waardoor het extreem broos wordt. Het eindigt met het vrijgeven van sporen in de omliggende bodem om toekomstige infecties te bevorderen. De bovenste delen van het plantenlichaam vertonen ook tekenen van slechte groei en ontwikkeling. Ten slotte bezwijken de geïnfecteerde planten aan de verwoestende effecten op het groeimetabolisme en de ontwikkeling zodra het wortelstelsel volledig beschadigd raakt en de plant de ziekte niet langer aankan. De schaalbalk staat voor 1 cm. De -INF staat voor mock-inocculated, terwijl +INF staat voor P. brassicae-inoculated plants. Bij deze gelegenheid wordt een foto van koolzaadplanten verstrekt voordat de grond wordt verwijderd om gezonde wortelsystemen te presenteren. Na het wassen worden alleen het hypocotyl en het bovenste deel van de wortel verzameld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: De algemene workflow. Gewassen Arabidopsis-wortelsystemen zijn (A) ontleed, (B) vast, (C) agarose ingebed, (D) gemonteerd en (E) doorsneden op het vibratoom. De resulterende objecten worden onderworpen aan weefselopruiming (3 dagen tot enkele weken bij RT in het donker, afhankelijk van het weefseltype en de dikte). (F) Gewiste voorwerpen kunnen vervolgens worden gekleurd en geïnspecteerd onder de microscoop. (G) Samenvatting van de workflow. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Pathogene sporen markeren met Nijlrode vlek. (A,B) Nijlrode kleurt lipiden in rustende sporen, wat perfect werkt om de rijping van P. brassicae te volgen. (A) Vergrote cellen gekoloniseerd door P. brassicae en gevuld met pathogene sporen. (B) Rijpe xyleemcellen worden ook gekleurd door Nile Red. De sectie is gecounterd met Calcofluor wit om de uitgaven van gastheercellen te zien (A: Objectief lens = 20x en sectiedikte = 60 μm; B: Objectieflens = 5x en sectiedikte = 60 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Het volgen van de mate van xyleemontwikkeling en rijping. (A) Lignine geeft sterke autofluorescentie bij excitatie met UV; daarom kan volwassen xyleem relatief gemakkelijk worden gediscrimineerd. (B) Dubbele kleuring met Basic Fuchsin en Calcofluor geeft betere resultaten omdat alle cellen worden gekleurd door de laatste kleurstof, terwijl volwassen xyleem duidelijk gekleurd is met Basic Fuchsin. Op deze manier biedt dubbele kleuring beelden met een verbeterd contrast dat merkbare remming van xylogenese weergeeft (A: Objectieflens = 10x en sectiedikte = 60 μm; B: Objectieflens = 10x en sectiedikte = 60 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Phloem-specifiek signaal voor het HCA2-gen in hypocotylen van P. brassicae-geïnfecteerde planten bij 21 DPI. Promotoractiviteit voor proHCA2::erRFP met transgene Arabidopsis thaliana is te zien in (A) en (B). Er kunnen verschillen worden waargenomen tussen een niet-geklaarde handsectie in paneel (A) waar het erRFP-signaal diffuus lijkt als gevolg van superpositie en overlappende cellagen, vooral in ongelijke handsecties. Aan de andere kant toont (B) een vibratomesectie na het opruimen van weefsel waarbij het erRFP-signaal de floëemcellen nauwkeurig markeert in een volwassen vasculaire bundel (Objectieflens = 20x en sectiedikte = 60 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Vergelijking tussen TB, hars-ingebedde en microtoom-gesneden gallen met behulp van fluorescentie. (A) Een vergelijking tussen beelden van Toluidine Blue (TB), hars-ingebedde en microtoom-sectie gallen, en (B) een representatief object (ook weergegeven in figuur 5B) verkregen met behulp van fluorescentie. Xyleemcellen zijn gelabeld met gele sterretjes, het cambiale gebied met levendige groene haakjes, floëem met cyaansterretjes en Plasmodiophora brassicae-gekoloniseerde cellen met een wit PB-symbool. In hars ingebedde secties (A) bieden een goede resolutie voor het bestuderen van de verdeling van rustende sporen in hypertrofische organen, de mate van ziekteprogressie en andere processen zoals lokale lignificatie in resistente planten. Het hier beschreven protocol (B) maakt echter de gevoelige observatie van genexpressie of eiwitaccumulatie mogelijk en de visualisatie van andere fysiologische veranderingen en belangrijke moleculen zoals lipiden (in sporen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Het volgen van cytokinine signaleringsreacties in hypocotylen van niet-geïnfecteerde (-INF) en P. brassicae-geïnfecteerde (+INF) Arabidopsis planten bij 16 DPI. TCS::GFP marker werd gebruikt voor het karakteriseren in planta cytokinine responsen. Vibratome secties werden onderworpen aan clearing behandeling gevolgd door kleuring met Calcofluor wit. Op basis van de afbeelding lijken cytokinineresponsen bij 16 DPI grotendeels verminderd te zijn in geïnfecteerde gallen (rechterpaneel), terwijl ze sterk blijven, vooral in de floëempool (cellen die uiteindelijk zullen differentiëren om floëemweefsel te vormen), in niet-geïnfecteerde planten (linkerpaneel) (objectief objectief = 5x en dikte = 30 μm). Bepaalde niveaus van xyleemautofluorescentie kunnen ook zichtbaar zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Opruimoplossing (giftig)
Onderdelen	Percentage (%)	in 100 ml gedestilleerd water
Xylitol	10%	10g
Natriumdeoxycholaat	15%	15g
Ureum	25%	25g
10x PBS (Fosfaat gebufferde zoutoplossing)		1x PBS (100 ml)
NaCl	8 gr	10 ml 10x PBS + 90 ml gedestilleerd water
Kcl	0,2 g
KH2PO4	0,24 g
Na2HPO4 · 2u2o	1,81 g
gedestilleerd water	100 ml
Ph	pH aangepast tot 7,4 met HCl
Autoclaaf en bewaren bij 4 °C.

Tabel 1: Samenstelling van de clearingoplossing en fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).

Fluorescerende vlek/ Tag	Excitatie/emissiegolflengten	Microscoopfilterset gebruikt
Nijl Rood	553/636 NM	filterset 43
Xylem Autofluorescentie	380/475 nm	filterset 49
Calcofluor Wit	405/475 NM	filterset 49
Basic Fuchsijn	561/650 nm	filterset 43
erRFP	585/608 NM	filterset 43
GFP	488/509 NM	filterset 38

Tabel 2: Excitatie/emissiespectra geselecteerd voor deze studie.

Discussion

Het aanbrengen van de clearingoplossing op door vibratomen gesneden delen van gallen verbetert zeker het vermogen om de biotrofe interactie tussen P. brassicae en de waardplant te bestuderen. Hoewel het clearingprotocol zelfs van toepassing is op handsecties, werkt het beter met vibratomsecties. Het fixeren van monsters in PFA-fixatief fungeert als een kritieke stap in het protocol, omdat monsters vervolgens enkele dagen bij 4 °C kunnen worden bewaard voordat ze doorgaan met secties. Dit biedt flexibiliteit om monsters voor een beperkte periode op te slaan zonder de expressie en het behoud van fluorescerende eiwitten tijdens fixatie in gevaar te brengen.

Nile Red (in DMSO of methanol) is onverenigbaar met harssecties vanwege de hydrofobiciteit, die hars oplost en in hars ingebedde secties¹⁷ vernietigt. Vibratome-secties blijken dus instrumenteel voor het bestuderen van de pathogene distributie en de levenscyclus ervan in zich ontwikkelende gallen, waarbij Nijlrode kleuring gemakkelijk kan worden gebruikt.

De clearingoplossing die in dit protocol wordt gebruikt, is zeer veelzijdig¹², waardoor een verscheidenheid aan fluorescentievlekken in verschillende combinaties kan worden gebruikt om verschillende biomoleculen / componenten van de celwanden te kleuren (suberine, lignine, cellulose en chitine in schimmelinteracties). Het is ook mogelijk om secties van fluorescerende GFP-markerlijnen te counterstainen en daardoor de promotoractiviteit of het eiwitaccumulatiepatroon te correleren met de aanwezigheid van het pathogeen in bepaalde cellen of regio's van de gal. Achtergrondautofluorescentie van xyleem en met pathogenen gevulde reuzencellen kon echter niet worden geëlimineerd, zelfs niet na het clearingprotocol. Dit vormt een beperking voor het kijken naar fluorescerende markers tijdens de latere stadia van galvorming, vooral bij het gebruik van een epifluorescentiemicroscoop en het afbeelden van zwakke signalen.

Vanwege de lage niveaus van expressie / accumulatie van fluorescerende signalen zijn transcriptiefactoren moeilijk te detecteren, maar met deze techniek is het mogelijk om bevredigende beelden voor hen te verkrijgen. Over het algemeen breidt het combineren van vibratomsectie met de weefselzuiveringsbenadering de toolkit uit voor histologische observaties van complexe galweefsels. De flexibiliteit van dit protocol vergemakkelijkt het proces van weefselfixatie en vermindert de tijd die nodig is voor het snijden en afbeelden van verse weefselmonsters om fluorescerende eiwitten en promotoractiviteiten te observeren. Met verdere verbeteringen en door gebruik te maken van andere fluorescerende kleurstoffen die specifiek zijn voor verschillende biomoleculen, zal deze methode grotere vooruitgang betekenen in histologische studies en beeldanalyse van dichte, ondoorzichtige weefsels met complexe weefselorganisatie. In de afgelopen tijd is de gepresenteerde weefselzuiveringsmethode naar voren gekomen als een populair en veelgebruikt protocol om de gelijktijdige acquisitie van verschillende fluorescerende signalen te combineren en mogelijk te maken 11,12,13. Toekomstige ontwikkeling en modificaties in dergelijke technieken zullen de beeldresolutie voor het observeren van plant-pathogeeninteracties op cellulair niveau aanzienlijk verbeteren.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2N Sulfuric acid (H2SO4)	Roth	UN2796	pH adjustment
Agarose	PRONA	BGQT100	Embedding
Basic Fuchsin	BIOSHOP	BSF410.5	Fluorescent dye
Calcofluor White	Sigma Aldrich	18909-100ML-F	Fluorescent dye
Commercial Bleach	Domestos
Cyanoacrylate/ Instant glue	Kropelka		Adhesive
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	BIOSHOP	DMS555.500	Solvent
Epifluorescence microscope	Carl Zeiss M2 automated epifluorescence microscope with Colibri LED system	Carl Zeiss M2	Carl Zeiss Filter Set filter set 38, 43, 49 used
Fully automated Vibratome	Leica	VT1200 S
Lightmeter /Photometer	LI-COR Biosciences	LI-250A + LI-190R quantum sensor	For measuring  light intensity within the 400-700nm (PAR) waveband
Masking tape			For sticking agarose block on mould
Murashige & Skoog Medium (MS Medium)	Duchefa Biochemie	MO222.0050	Plant Growth Medium
Nile Red	Sigma Aldrich	N3013-100MG	Fluorescent dye
Paraformaldehyde PFA	Sigma Aldrich	158127-100G	Fixative
Potassium Chloride (KCl)	POCH	739740114	PBS component
Potassium Hydroxide (KOH)	Sigma Aldrich	P1767-250G	pH adjustment
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	BIOSHOP	PPM302.500	PBS component
Sodium chloride (NaCl)	BIOSHOP	SOD001.1	PBS component
Sodium Deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750-25G	Clearing Solution
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4 · 2H2O)	POCH	799490116	PBS component
Triton X-100	BIOSHOP	TRX506.100	Fixative
Urea	Sigma Aldrich	U5378-100G	Clearing Solution
Vacuum/Pressure pump and Dessicator	Welch by Gardner Denver	2522C-02	For Vacuum Infilteration
Xylitol	Sigma Aldrich	X3375-25G	Clearing Solution (componenet)