Methodenartikel

Fluorescentie Lifetime Macro Imager voor biomedische toepassingen

DOI:

10.3791/64321

⸱

7 april 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biochemistry and Cell Biology, University College Cork, 2Cancer Research@UCC, University College Cork, 3Centre for Microscopy, Characterisation and Analysis (CMCA), The University of Western Australia, 4Physics Department, Brookhaven National Laboratory

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft het gebruik van een nieuwe, snelle optische imager voor de macroscopische fotoluminescentie lifetime imaging van monsters die lang verval uitzenden. De integratie-, beeldacquisitie- en analyseprocedures worden beschreven, samen met de voorbereiding en karakterisering van de sensormaterialen voor de beeldvorming en de toepassing van de imager bij het bestuderen van biologische monsters.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel presenteert een nieuwe fotoluminescentie lifetime imager ontworpen om de moleculaire zuurstof (O 2) concentratie in verschillende fosforescerende monsters in kaart te brengen, variërend van solid-state, O 2-gevoelige coatings tot levende dierlijke weefselmonsters gekleurd met oplosbare O 2-gevoelige sondes. In het bijzonder werd de op nanodeeltjes gebaseerde nabij-infrarode sonde NanO2-IR gebruikt, die prikkelbaar is met een 625 nm light-emitting diode (LED) en uitzendt bij 760 nm. Het beeldsysteem is gebaseerd op de Timepix3-camera (Tpx3Cam) en de optomechanische adapter, die ook een beeldversterker herbergt. O2 fosforescentie lifetime imaging microscopie (PLIM) is vaak vereist voor verschillende studies, maar de huidige platforms hebben beperkingen in hun nauwkeurigheid, algemene flexibiliteit en bruikbaarheid.

Het hier gepresenteerde systeem is een snelle en zeer gevoelige imager, die is gebouwd op een geïntegreerde optische sensor en uitleeschipmodule, Tpx3Cam. Het is aangetoond dat het fosforescentiesignalen met hoge intensiteit en stabiele levensduurwaarden produceert uit oppervlaktegekleurde darmweefselmonsters of intraluminaal gekleurde fragmenten van de dikke darm en maakt het mogelijk om weefsel O2-niveaus gedetailleerd in kaart te brengen in ongeveer 20 s of minder. Eerste experimenten met de beeldvorming van hypoxie in getransplanteerde tumoren bij bewusteloze dieren worden ook gepresenteerd. We beschrijven ook hoe de imager opnieuw kan worden geconfigureerd voor gebruik met O2-gevoelige materialen op basis van Pt-porfyrinekleurstoffen met behulp van een 390 nm LED voor de excitatie en een bandpass 650 nm filter voor emissie. Over het algemeen bleek de PLIM-imager nauwkeurige kwantitatieve metingen van levensduurwaarden voor de gebruikte sondes en respectieve tweedimensionale kaarten van de O2-concentratie te produceren. Het is ook nuttig voor de metabole beeldvorming van ex vivo weefselmodellen en levende dieren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O 2 is een van de belangrijkste omgevingsparameters voor levende systemen, en kennis van de verdeling van O 2 en zijn dynamiek is belangrijk voor veel biologische studies 1,2,3. De beoordeling van weefseloxygenatie door middel van fosforescerende sondes 4,5,6,7,8 en PLIM 9,10,11,12,13 wint aan populariteit in biologisch en medisch onderzoek 3,9,14,15,16, 17,18,19. Dit komt omdat PLIM, in tegenstelling tot fluorescentie- of fosforescentie-intensiteitsmetingen, niet wordt beïnvloed door externe factoren zoals sondeconcentratie, fotobleaching, excitatie-intensiteit, optische uitlijning, verstrooiing en autofluorescentie.

De huidige O2 PLIM-platforms worden echter beperkt door hun gevoeligheid, beeldacquisitiesnelheid, nauwkeurigheid en algemene bruikbaarheid. Time-correlated single photon counting (TCSPC), gecombineerd met een rasterscanprocedure, wordt vaak gebruikt in PLIM- en fluorescentie-lifetime imaging microscopie (FLIM) -apparaten20,21,22. Omdat PLIM echter een lange pixelverblijftijd vereist (in het millisecondebereik), is de tijd van beeldacquisitie veel langer dan wat vereist is voor FLIM-toepassingen20,22,23. Andere technieken, zoals gated CCD / CMOS-camera's, missen enkele fotongevoeligheid en hebben lage framesnelheden20,24,25,26. Bovendien worden de bestaande PLIM-systemen meestal gebruikt in het microscopische formaat, terwijl macroscopische systemen minder vaak voorkomen27.

De op TCSPC gebaseerde PLIM-macro-imager28 is opgezet om veel van deze beperkingen te overwinnen. Het ontwerp van de imager werd aanzienlijk vergemakkelijkt door het gebruik van een nieuwe opto-mechanische adapter, Cricket, die het volgende heeft: i) twee C-mount adapters, die een eenvoudige koppeling van de cameramodule aan de achterkant en een objectieflens aan de voorkant bieden; ii) een interne behuizing voor een beeldversterker en een stopcontact voor de laatste aan de buitenzijde van de Krekel; iii) een interne ruimte achter de C-montageadapter aan de voorzijde waar een standaard emissiefilter van 25 mm voor de versterker kan worden ondergebracht; en iv) een ingebouwde lichtbotsende optiek met ringregelaars, die optische uitlijning / scherpstelling tussen de lens en de camera mogelijk maken om scherpe beelden op de camerachip te produceren.

In de geassembleerde imager is de cameramodule gekoppeld aan de achterkant van de Cricket-adapter, die ook een beeldversterker herbergt die bestaat uit een fotokathode gevolgd door een microkanaalplaat (MCP), een versterker en een snelle scintillator, P47-fosfor. Een 760 nm ± 50 nm emissiefilter is gemonteerd in de Cricket en een objectieflens, NMV-50M11'', is bevestigd aan de C-mount adapter aan de voorzijde. Tot slot zijn de lens en de camera optisch uitgelijnd met ringregelaars.

De rol van de versterker is om inkomende fotonen te detecteren en om te zetten in snelle lichtflitsen op de camerachip, die worden geregistreerd en gebruikt om emissieverval en levensduurbeelden te genereren. De cameramodule bestaat uit een geavanceerde TCSPC-gebaseerde optische sensorarray (256 pixels x 256 pixels) en een nieuwe generatie uitleeschip 29,30,31,32,33, die de gelijktijdige registratie van de aankomsttijd (TOA) en de tijd over drempel (TOT) van fotonuitbarstingen bij elke pixel van de beeldchip mogelijk maakt met een tijdresolutie van 1,6 ns en een uitleessnelheid van 80 Mpixel / s.

In deze configuratie heeft de camera met de versterker een enkele fotongevoeligheid. Het is datagedreven en gebaseerd op het speedy pixel detector readout (SPIDR) systeem34. De ruimtelijke resolutie van de imager werd eerder gekarakteriseerd met vlakke fosforescerende O2-sensoren en een resolutieplaatmasker. De instrumentresponsfunctie (IRF) werd gemeten door de beeldvorming van een vlakke fluorescentiesensor onder dezelfde instellingen als voor alle andere metingen. De levensduur van de kleurstof van ongeveer 2,6 ns was kort genoeg om te worden gebruikt voor de IRF-meting in PLIM-modus. De imager kan objecten van maximaal 18 mm x 18 mm groot maken met ruimtelijke en temporele resoluties van respectievelijk 39,4 μm en 30,6 ns (volledige breedte bij half-maximum),28.

De volgende protocollen beschrijven de assemblage van de macro-imager en het daaropvolgende gebruik ervan voor het in kaart brengen van de O 2-concentratie in biologische monsters die zijn gekleurd met de eerder gekarakteriseerde nabij-infrarode O2-sonde, NanO2-IR35. De sonde is een heldere, fotostabiele, celdoorlatende O2-sensing sonde op basis van platina (II) benzoporfyrine (PtBP) kleurstof. Het is prikkelbaar bij 625 nm, zendt uit bij 760 nm en biedt een robuuste optische respons op O 2 in het fysiologische bereik (0% -21% of 0-210 μM van O2). De imager blijkt ook verschillende sensormaterialen te karakteriseren op basis van Pt(II)-porfyrinekleurstoffen. Over het algemeen is de imager compact en flexibel, vergelijkbaar met een gewone fotocamera. In de huidige opzet is de imager geschikt voor verschillende breedveld PLIM-toepassingen. Het vervangen van de LED door een snelle laserbron zal de prestaties van de imager verder verbeteren en kan mogelijk nanoseconde FLIM-toepassingen mogelijk maken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures met dieren werden uitgevoerd onder vergunningen die zijn afgegeven door de Health Products Regulatory Authority (HPRA, Ierland) in overeenstemming met de richtlijn van de Raad van de Europese Gemeenschappen (2010/63/EU) en zijn goedgekeurd door de Animal Experimentation Ethics Committee van het University College Cork.

1. Monstervoorbereiding

  1. Kleuring met de sonde van levende weefselmonsters ex vivo
    1. Gebruik voor ex vivo toepassingen vers geïsoleerde weefselmonsters van 4 weken oude vrouwelijke Balb/c muizen.
    2. Op de dag van het experiment, euthanaseer een muis door onthoofding en ontleed snel fragmenten van de dikke darm (dikke darm), ongeveer 10 mm groot. Was ze onmiddellijk met PBS-buffer, plaats ze in DMEM-medium aangevuld met 10 mM Hepes-buffer (pH 7,2) en incubeer bij 37 °C36.
    3. Voor oppervlaktekleuring van de serosale kant van de darm, breng de levende weefselmonsters over in een minischaal, breng 2 ml volledige DMEM met 1 mg / ml NanO2-IR-sonde aan om de weefselmonsters te bedekken en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
      OPMERKING: Cellen in post-mortem weefsel blijven vele uren in cultuur leven. NaNO2-IR vertoont een geringe cytotoxiciteit, dus alle experimenten werden binnen 4 uur na weefselisolatie voltooid.
    4. Voor intraluminale ex vivo kleuring van diep weefsel, breng de stukjes van de darm over naar een droge petrischaal en verwijder overtollige DMEM met filterpapier.
    5. Injecteer 1 μL DMEM met 1 mg/ml NanO2-IR 35 in het lumen met een Hamilton-spuit en incubeer de monsters gedurende15 minuten of gedurende maximaal 4 uur.
      OPMERKING: NaNO2-IR vertoont kleine cytotoxische effecten op lange termijn; Daarom moeten alle experimenten binnen 4 uur na weefselisolatie worden voltooid.
  2. Bereiding van gekleurd tumorweefsel bij levende dieren
    1. Voor in vivo toepassingen, pre-kleuring CT26-cellen gedurende 18 uur in serumvrij medium met NaNO2-IR-sonde bij 0,05 mg / ml.
    2. Neem een muis, scheer het injectiegebied in de rechterflank en injecteer met een spuit 200 μL van een mengsel van 1 × 10 5 niet-gekleurde cellen en 1 × 105 cellen voorgekleurd met NanO2-IR .
    3. Laat tumoren groeien in de muizen, controleer de tumorgrootte met een remklauw en het gewicht van het dier periodiek37. De dieren met getransplanteerde tumoren worden klaar voor beeldvorming op de zevende dag van tumorgroei.
      OPMERKING: Het tumorvolume werd berekend met behulp van vergelijking (1):
      V = (L × W 2)/2 (1)
      waarbij L de diameter van de tumor is en W ide diameter loodrecht op de diameter L.
    4. Offer de dieren op door cervicale dislocatie vlak voor de beeldvorming.

2. PLIM imaging instellen

  1. Neem de Cricket-adapter en verwijder de C-mount adapter aan de achterkant om toegang te krijgen tot de behuizing van de versterker aan de binnenkant. Plaats de MCP-125 beeldversterker in dit compartiment en plaats de C-mount adapter terug.
  2. Verwijder de C-mount adapter aan de voorzijde van de Cricket, plaats het 760 nm ± 50 nm emissiefilter en repareer het door de C-mount terug te plaatsen.
  3. Sluit de Tpx3Cam-cameramodule aan op de achterkant van de Cricket-module via de C-mount-adapter
  4. Sluit de lens aan op de voorkant van de Cricket-module via de C-mount adapter.
  5. Monteer de hele camera-assemblage bovenop de optische zwarte doos, naar beneden gericht naar het podium waarop de monsters worden afgebeeld (figuur 1).
  6. Monteer de 624 nm superheldere LED op een paal die is aangesloten op een breadboard in de zwarte doos.
  7. Sluit de LED aan op een voeding en een pulsgenerator. Schakel de LED in en richt deze op een effectieve en uniforme excitatie van afgebeelde monsters.
  8. Sluit de camera aan op een andere pulsgenerator en synchroniseer de pulsen die naar de camera en de LED38 worden verzonden.
  9. Sluit met behulp van de speciale kabel en aansluiting op de Cricket-eenheid de versterker aan op een standaardvoeding en stel de versterking in op 2,7 V.
  10. Gebruik de scherpstelmogelijkheden van de lens en cricketadapter om de cameraoptiek op het monsterpodium te richten om duidelijke beelden van monsters met een goed contrast en helderheid te genereren.
  11. Voor imagergebruik met Pt-porfyrinekleurstoffen vervangt u de 625 nm LED door een 390 nm LED voor excitatie en vervangt u het 760 nm ± 50 nm filter door een 650 nm ± 50 nm filter in de Cricket module.

3. Beeldacquisitie

  1. Plaats het monster voor de cameralens.
    OPMERKING: Gebruik een x-y-z verstelbare trap als monsterhouder om de monsterpositie aan te passen voor een goede scherpstelling.
  2. Doe alle lichten in de kamer uit.
  3. Schakel de Sophy-software in voor het afstemmen van de operationele parameters, zoals de scherpstelling en monsteruitlijning.
    OPMERKING: Sophy-software wordt samen met de camera geleverd om de beeldparameters in te stellen en de gegevens vast te leggen. Zorg ervoor dat de software is aangesloten op de camera door de cameracode te controleren. We gebruikten echter een ander programma voor data-acquisitie.
  4. Selecteer in Modules oneindige frames en stel de pixelbewerkingsmodus in op tijd boven drempel.
  5. Ga in Modules naar Voorvertoning en selecteer Actieve module. Dit opent het Medpix /Timpix Frames venster.
  6. Wijzig in dit venster de kleurenschaal en draai de afbeelding in de gewenste richting.
  7. Schakel de versterker in en start de opname.
    OPMERKING: Gebruik het opnamescherm van de Sophy-software om de uitlijning en focus van het monster visueel te bevestigen en om de LED-excitatieparameters voor opname te optimaliseren.
  8. Stop de opname en sluit de Sophy-software.
  9. Ga naar de terminal en gebruik de op maat ontworpen software om de onbewerkte gegevens in het binaire formaat te verkrijgen en na te bewerken (https://github.com/svihra/TimePix3).
    1. Voer in de terminal de volgende opdrachten uit om de gegevens vast te leggen:
      Cd Document/SPIDR/trunk/Release/
       Ls
      ./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {Naam van het bestand} - t {acquisitietijd}
      OPMERKING: Controleer bij het typen van "ls" de lijst met bestanden in de huidige map; bevestig dat Tpx3daq wordt gezien.
    2. Wacht tot alle frames zijn opgenomen.
    3. Als u de gegevens wilt verwerken, voert u de volgende opdrachten uit in de terminal:
      cd Documenten/DataProcessing/Timepix3/Timepix3/
      wortel
      . L dataproces.cpp++
      .x DRGUI. C
    4. Wacht tot een RRGui-venster wordt geopend. Selecteer alle variabelen aan de linkerkant en Alle gegevens, Eén bestand en Centroid aan de rechterkant.
    5. Selecteer het bestand dat u wilt verwerken en voer het gegevensreducer uit.
      OPMERKING: Alle verwerkte bestanden verschijnen in dezelfde map als het RAW-bestand.

4. Data-analyse

  1. Analyseer de nabewerkte gegevens met een speciaal programma geschreven in C-taal dat de gegevens in een .ics afbeeldingsbestand (https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam) schrijft.
  2. Open de .ics afbeeldingsbestanden met behulp van de vrij beschikbare Time Resolved Imaging-software (zie Materiaaltabel). Gebruik twee exponentiële functies om het fosforescentieverval aan te passen.
  3. Open de aangepaste .ics afbeeldingsbestanden met de beschikbare beeldanalysesoftware (zie Materiaaltabel).
  4. Genereer met behulp van opzoektabellen afbeeldingen met een fosforescentielevensduur en codeer ze in pseudokleurenschaal (bijvoorbeeld blauwe kleur voor korte levensduur en rood voor lange levensduur). Gebruik de functie Meten om de gemiddelde levensduurwaarden voor de gehele afbeelding of specifieke interessegebieden (ROI's) te berekenen.
  5. Zet de levensduurwaarden om in de zuurstofconcentratie met behulp van de vergelijking die wordt verkregen uit de aanpassing van de O 2-kalibratie van de sonde36.
    OPMERKING: Vergelijking (2) werd gebruikt voor dit werk:
    O 2 [μM] = −86,16 + 770,35 × e−0,049 × LT (2)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor ex vivo beeldvormingstoepassingen werden fragmenten van darmweefsels gekleurd door de topische toepassing van de NanO2-IR-sonde aan de serosale zijde van het weefsel. Voor diepere kleuring werd 1 μL van de sonde in het lumen geïnjecteerd. In het laatste geval schermde de 0,2-0,25 mm dikke darmwand de sonde af van de camera. De twee kleuringsprocessen worden gedemonstreerd in figuur 2A.

De resulterende intensiteit en PLIM-beelden worden weergegeven in...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De bovenstaande protocollen geven een gedetailleerde beschrijving van de assemblage van de nieuwe imager en de werking ervan in de microseconde FLIM/PLIM-modus. De TCSPC-gebaseerde nieuwe generatie Tpx3Cam-camera, gekoppeld door middel van de optomechanische adapter Cricket met de beeldversterker, emissiefilter en macrolens, produceert een stabiele, compacte en flexibele optische module die eenvoudig te bedienen is. De imager bleek goed te presteren met een reeks verschillende monsters en analytische taken, waaronder de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Financiële steun voor dit werk van de Science Foundation Ireland, subsidies SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 en 18/SP/3522, en Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) wordt dankbaar erkend.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
627 nm LEDParts ExpressKan worden vervangen door een andere LED op basis van de excitatiegolflengte van de sensor. 390 nm LED gebruikt voor Pt-porfyrine kleurstoffen.
760 ± 50 nm emissiefilterEdmund Optics84-788Kan worden vervangen door een andere filter op basis van de emissiegolflengte van de sensor. 650 ± 50 nm bandpass filter gebruikt voor Pt-porfyrine kleurstoffen.
Balb/c muizenEnvigo, UKBalb/c
Black boxThorlabsXE25C9/M
Cricket AdapterPhotonisCricket-2
CT26 cellen ATCCCT26.WThttps://www.atcc.org/products/crl-2638
DMEMSigma-AldrichD0697Ook andere media kunnen worden gebruikt
ImageJ SoftwareImageJGratis beeldanalysesoftware. Kan worden gedownload van: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
MCP-125 beeldversterker met P47 fosfor schermPhotonisPP0360EF
Mini schotelsSarstedt83.3900.30035 mm diameter 
Mylar kunststof film, 75 micron RS Ireland785-0795Ook andere kunststof substraten kunnen worden gebruikt
NanO2-IRzelfgemaaktn/aDe sonde kan worden gesynthetiseerd volgens de gepubliceerde methode 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo beeldvorming van hersenmetabolismeactiviteit met behulp van een fosforescente zuurstofgevoelige sonde. J Neurosci Methods. 2013 15 jun;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 25 apr. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' of geleverd door ons lab. 
NMV-50M11” 50 mm lensNavitarOok andere lenzen compatibel met C-mount adapters kunnen worden gebruikt
Optisch broodbordThorlabsMB1836
Petri schotelsSarstedt82.1472.00192 mm diameter
VoedingTenma72-10495
PulsgeneratorTenmaTGP110
SophyAmsterdam Scientific Instrumentsn/zGeleverd door ASI samen met de Tpx3Cam
Tpx3CamAmsterdam Scientific InstrumentsTPXCAM
Tri2 SoftwareUniversity of Oxfordn/aGratis Time Resolved Imaging software, kan worden gedownload van: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml
XYZ TranslatiebaanThorlabsLT3

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
  2. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).
  3. Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes. Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).
  4. Papkovsky, B. Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research. 17th International Meeting on Chemical Sensors - IMCS. , 71-72 (2018).
  5. Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
  6. O'Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications. Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).
  7. Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).
  8. Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research. Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150(2017).
  9. Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).
  10. Hogan, M. C. Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers. Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).
  11. Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime. Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).
  12. Becker, W., Shcheslavskiy, V., Rück, A. Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).
  13. Wolfbeis, O. S. Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode. BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).
  14. Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
  15. Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging. Applied Physics Letters. 108, 091111(2016).
  16. Babilas, P., et al. In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors. Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).
  17. Babilas, P., et al. Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors. Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).
  18. Golub, A. S., Pittman, R. N. PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).
  19. Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).
  20. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - Techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
  21. Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. Becker, W. , Springer. Cham, Switzerland. 225-247 (2015).
  22. Becker, W. Advanced TCSPC-FLIM techniques. Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. König, K. , De Gruyter. Berlin, Germany. 23-52 (2018).
  23. Wei, L., Yan, W., Ho, D. Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics. Sensors. 17 (12), 2800(2017).
  24. Hirvonen, L. M., Suhling, K. Wide-field TCSPC: Methods and applications. Measurement Science and Technology. 28, 012003(2017).
  25. Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution. Optics Letters. 39 (19), 5602(2014).
  26. Sparks, H., et al. Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging. Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707(2017).
  27. Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, Springer. Cham, Switzerland. (2017).
  28. Sen, R., et al. A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications. Proceedings of SPIE. , 113591(2020).
  29. Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping. Journal of Instrumentation. 11, (2016).
  30. Nomerotski, A. Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).
  31. Poikela, T., et al. Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout. Journal of Instrumentation. 9, 05013(2014).
  32. Nomerotski, A., et al. Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons. Journal of Instrumentation. 12, 01017(2017).
  33. Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam. Review of Scientific Instruments. 88, 013104(2017).
  34. Visser, J., et al. SPIDR: A read-out system for Medipix3 & Timepix3. Journal of Instrumentation. 10, 12028(2015).
  35. Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
  36. Sen, R., et al. Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager. Scientific Reports. 10, 19006(2020).
  37. Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).
  38. Sen, R., et al. New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera. Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).
  39. Papkovsky, D. B., et al. Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors. Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).
  40. Sen, R., et al. Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager. Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459(2020).
  41. Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M. Fluorescence lifetime imaging. Analytical Biochemistry. 202 (2), 316-330 (1992).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

FluorescentielevensduimbeeldvormingFosforescentielevensduimbeeldvormingZuurstofmappingTimepix3 cameraTCSPC modusBeeldvorming van dierweefselNanodeeltjes zuurstofsondeBeeldversterkerHypoxiebeeldvormingPlatinumporfyrinekleurstof

Gerelateerde artikelen