Fluorescentie Lifetime Macro Imager voor biomedische toepassingen

Summary

Dit artikel beschrijft het gebruik van een nieuwe, snelle optische imager voor de macroscopische fotoluminescentie lifetime imaging van monsters die lang verval uitzenden. De integratie-, beeldacquisitie- en analyseprocedures worden beschreven, samen met de voorbereiding en karakterisering van de sensormaterialen voor de beeldvorming en de toepassing van de imager bij het bestuderen van biologische monsters.

Abstract

Dit artikel presenteert een nieuwe fotoluminescentie lifetime imager ontworpen om de moleculaire zuurstof (O 2) concentratie in verschillende fosforescerende monsters in kaart te brengen, variërend van solid-state, O 2-gevoelige coatings tot levende dierlijke weefselmonsters gekleurd met oplosbare O _2-gevoelige sondes. In het bijzonder werd de op nanodeeltjes gebaseerde nabij-infrarode sonde NanO2-IR gebruikt, die prikkelbaar is met een 625 nm light-emitting diode (LED) en uitzendt bij 760 nm. Het beeldsysteem is gebaseerd op de Timepix3-camera (Tpx3Cam) en de optomechanische adapter, die ook een beeldversterker herbergt. O₂ fosforescentie lifetime imaging microscopie (PLIM) is vaak vereist voor verschillende studies, maar de huidige platforms hebben beperkingen in hun nauwkeurigheid, algemene flexibiliteit en bruikbaarheid.

Het hier gepresenteerde systeem is een snelle en zeer gevoelige imager, die is gebouwd op een geïntegreerde optische sensor en uitleeschipmodule, Tpx3Cam. Het is aangetoond dat het fosforescentiesignalen met hoge intensiteit en stabiele levensduurwaarden produceert uit oppervlaktegekleurde darmweefselmonsters of intraluminaal gekleurde fragmenten van de dikke darm en maakt het mogelijk om weefsel O_2-niveaus gedetailleerd in kaart te brengen in ongeveer 20 s of minder. Eerste experimenten met de beeldvorming van hypoxie in getransplanteerde tumoren bij bewusteloze dieren worden ook gepresenteerd. We beschrijven ook hoe de imager opnieuw kan worden geconfigureerd voor gebruik met O_2-gevoelige materialen op basis van Pt-porfyrinekleurstoffen met behulp van een 390 nm LED voor de excitatie en een bandpass 650 nm filter voor emissie. Over het algemeen bleek de PLIM-imager nauwkeurige kwantitatieve metingen van levensduurwaarden voor de gebruikte sondes en respectieve tweedimensionale kaarten van de O_{2-concentratie} te produceren. Het is ook nuttig voor de metabole beeldvorming van ex vivo weefselmodellen en levende dieren.

Introduction

O 2 is een van de belangrijkste omgevingsparameters voor levende systemen, en kennis van de verdeling van O 2 en zijn dynamiek is belangrijk voor veel biologische studies _1,2,3. De beoordeling van weefseloxygenatie door middel van fosforescerende sondes 4,5,6,7,8 en PLIM 9,10,11,12,13 wint aan populariteit in biologisch en medisch onderzoek 3,9,14,15,16

Protocol

Alle procedures met dieren werden uitgevoerd onder vergunningen die zijn afgegeven door de Health Products Regulatory Authority (HPRA, Ierland) in overeenstemming met de richtlijn van de Raad van de Europese Gemeenschappen (2010/63/EU) en zijn goedgekeurd door de Animal Experimentation Ethics Committee van het University College Cork.

1. Monstervoorbereiding

1. Kleuring met de sonde van levende weefselmonsters ex vivo
   1. Gebruik voor ex vivo toepassingen vers geïsoleerde weefselmonsters van 4 weken oude vrouwelijke Balb/c muizen.
   2. Op de dag van het experiment, euthanaseer een muis door....

Results

Voor ex vivo beeldvormingstoepassingen werden fragmenten van darmweefsels gekleurd door de topische toepassing van de NanO2-IR-sonde aan de serosale zijde van het weefsel. Voor diepere kleuring werd 1 μL van de sonde in het lumen geïnjecteerd. In het laatste geval schermde de 0,2-0,25 mm dikke darmwand de sonde af van de camera. De twee kleuringsprocessen worden gedemonstreerd in figuur 2A.

De resulterende intensiteit en PLIM-beelden worden weergegeven in.......

Discussion

De bovenstaande protocollen geven een gedetailleerde beschrijving van de assemblage van de nieuwe imager en de werking ervan in de microseconde FLIM/PLIM-modus. De TCSPC-gebaseerde nieuwe generatie Tpx3Cam-camera, gekoppeld door middel van de optomechanische adapter Cricket met de beeldversterker, emissiefilter en macrolens, produceert een stabiele, compacte en flexibele optische module die eenvoudig te bedienen is. De imager bleek goed te presteren met een reeks verschillende monsters en analytische taken, waaronder de .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
627 nm LED	Parts Express		Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes.
760 ± 50 nm emission filter	Edmund Optics	84-788	Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes.
Balb/c mice	Envigo, UK	Balb/c
Black box	Thorlabs	XE25C9/M
Cricket Adapter	Photonis	Cricket-2
CT26 cells	ATCC	CT26.WT	https://www.atcc.org/products/crl-2638
DMEM	Sigma-Aldrich	D0697	Other media can also be used
ImageJ Software	ImageJ		Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen	Photonis	PP0360EF
Mini dishes	Sarstedt	83.3900.300	35 mm diameter
Mylar plastic film, 75 micron	RS Ireland	785-0795	Othe plastic substrates can also be used
NanO2-IR	home-made	n/a	The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab.
NMV-50M11” 50 mm lens	Navitar		Other lenses compatibel with C-mount adators can be used
Optical breadboard	Thorlabs	MB1836
Petri Dishes	Sarstedt	82.1472.001	92 mm diameter
Power Supply	Tenma	72-10495
Pulse Generator	Tenma	TGP110
Sophy	Amsterdam Scientific Instruments	n/z	Provided by ASI together with the Tpx3Cam
Tpx3Cam	Amsterdam Scientific Instruments	TPXCAM
Tri2 Software	University of Oxford	n/a	Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml
XYZ Translation Stage	Thorlabs	LT3