Methodenartikel

Contactovergevoeligheid als een muizenmodel van allergische contactdermatitis

3.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64329

⸱

26 september 2022

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 2Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

Contactovergevoeligheid (CHS) is een muizenexperimenteel model van allergische contactdermatitis (ACD). CHS is gebaseerd op sensibilisatie met reactieve hapten door de geschoren huid van de borst en buik te schilderen, met een daaropvolgende oorhuiduitdaging met een verdunde hapten, waardoor een zwellingsreactie ontstaat die op verschillende manieren wordt beoordeeld.

Samenvatting

Contactovergevoeligheid (CHS) is een experimenteel model van allergische contactdermatitis (ACD) dat kan worden bestudeerd bij muizen. Deze studie heeft tot doel een objectieve laboratoriummethode te presenteren die kan helpen bij het bestuderen van de CHS-reactie bij muizen, die kan worden gemeten en gekwantificeerd door verschillende tests. Om CHS te induceren, werden muizen op dag "0" op een eerder geschoren plek gesensibiliseerd door buikhuid te schilderen met het hapten 2,4,6-trinitrochlorobenzeen (TNCB) in een aceton-ethanolmengsel, terwijl negatieve controlemuizen werden gesensibiliseerd met een voertuig-aceton-ethanolmengsel. Op dag "4" werd de oordikte gemeten met een micrometer voorafgaand aan de elicitatie van CHS (challenge) door beide oren te schilderen met verdunde TNCB zowel in de test- als in de controlegroep. Na 24 uur werd de oorzwelling gemeten met een micrometer. CHS is een voorbeeld van een T-cel-gemedieerde immuunrespons die zwelling veroorzaakt in ontstoken weefsel, met een piek van 24 uur na de huiduitdaging met dezelfde hapten. Een toename van ooroedeem gecorreleerd met verhoogd oorgewicht, myeloperoxidase (MPO) activiteit, pro-inflammatoire cytokineconcentratie in de oorextracten, verhoogde verdikking van de oedemateuze dermis in het histologisch onderzoek en oor vasculaire permeabiliteit. Er was ook een toename van de concentratie van TNP-specifieke IgG1-antilichamen in de sera van de testgroep in vergelijking met de controlemuizen. Bovendien kan CHS met succes worden overgedragen met de CHS-effectorcellen die zijn verkregen van donoren die eerder zijn gesensibiliseerd met TNCB. De CHS-effectorcellen werden intraveneus toegediend aan naïeve ontvangende muizen, die vervolgens werden uitgedaagd met dezelfde verdunde hapten. Oorzwelling werd 24 uur later gemeten met een micrometer.

Inleiding

Allergische contactdermatitis (ACD) is een veel voorkomende huidontstekingsziekte in geïndustrialiseerde landen veroorzaakt door een type IV overgevoeligheidsreactie als gevolg van blootstelling aan chemicaliën met een laag molecuulgewicht die haptens worden genoemd. De stoffen die contactsensibilisatie bij de mens veroorzaken, zijn onder meer zware metaalionen (chroom, nikkel, ijzer, kobalt), terpentijn, geurstoffen, kleurstoffen en conserveermiddelen die aanwezig zijn in cosmetica (bijv. p-fenyleendiamine), sommige geneesmiddelen (bijv. neomycine, benzocaïne), β-lactamantibiotica (d.w.z. penicilline), chemicaliën geproduceerd door planten (pentadecacatechol, een stof die aanwezig is in poison ivy), evenals hydrochinon die wordt gebruikt in de fotografische industrie 1,2 . ACD-etiologische middelen zijn erg hoog, omdat alleen al in de industrie meer dan 100.000 chemicaliën worden gebruikt en elk jaar 2.000 nieuwe worden gesynthetiseerd. Tot op heden zijn meer dan 3.700 moleculen geïdentificeerd die contact haptens/allergenen kunnen zijn3. De contactovergevoeligheidsreactie (CHS) is een experimenteel model van ACD dat kan worden bestudeerd bij muizen, cavia's en ratten en kan worden geïnduceerd door de plaatselijke huidtoepassing van reactieve chemische haptens opgelost in organische oplosmiddelen 4,5,6. Deze studie heeft tot doel een objectieve laboratoriummethode te beschrijven die kan helpen bij het bestuderen van de CHS-reactie bij muizen, die kan worden gemeten en gekwantificeerd door verschillende tests.

Het CHS bestaat uit sensibilisatie (inductie) en effector (challenge) fasen. In diermodellen binden haptens eerst covalent aan eiwitten in het lichaam om neoantigenen te creëren. Tijdens de sensibilisatiefase bevorderen geactiveerde keratinocyten de migratie en rijping van huiddendritische cellen (sDC's) door pro-inflammatoire cytokines-tumornecrosefactor α (TNF-α) en interleukine 1β (IL-1β)7 te produceren. Epidermale Langerhans-cellen (LC's) presenteren antigenen tijdens de CHS-inductie- en effectorfasen8. LCs blootgesteld aan hapten tijdens sensibilisatie bevorderen de inductie van zowel regulerende als effectorcellen9. Toenemend bewijs uit verschillende studies suggereert dat CHS-responsen kunnen worden gemedieerd door CD4 + MHC klasse II-beperkte Th1-cellen, waarbij lokaal interferon-γ (IFN-γ) vrijkomen om een karakteristiek ontstekingsinfiltraat te gebruiken, CD8 + MHC klasse I-beperkte Tc1-lymfocyten die ook IFN-γ kunnen afgeven, maar meestal cytotoxische schade aan keratinocyten kunnen bemiddelen, en nu ook interleukine 17 (IL-17) -producerende Th17-cellen10, 11.

Er zijn verschillende CHS-modellen ontwikkeld met verschillende soorten1 2,13,14 en haptens (een gedetailleerde vergelijking van verschillende haptens, oplosmiddelen en toedieningstijd is samengevat in tabel 1). De muis, een veelgebruikte laboratoriumsoort, biedt een paar voordelen bij het bestuderen van CHS. Er zijn meer stammen, knock-outs (KO) en transgene dieren onder muizen in vergelijking met andere soorten, waardoor ze een zeer aantrekkelijk dierzijn 15. Bovendien vereist het CHS-model veel dieren en zijn muizen hier zuiniger. Diermodellen bootsen ACD niet in alle opzichten na; in het bijzonder vertonen ze korstvorming en desquamatie, wat niet gebruikelijk is voor mensen 16,17. De kenmerken van chronische ziekten zijn een uitdaging om te reproduceren, vooral omdat het beschreven model niet uitgaat van de toepassing van de hapten voor een lange periode van tijd. Hier is echter bevestigd dat veel van de belangrijke aspecten van ACD worden gereproduceerd. Het is ook aangetoond dat, net als bij mensen, deze kenmerken geassocieerd zijn met lokale allergische reacties. De keuze van hapten, het oplosmiddel en de toepassing ervan die in dit protocol wordt beschreven, werden bepaald door het feit dat de resultaten zijn bevestigd door talrijke in vitro tests en dat het vele jaren in het laboratorium is getest en gewijzigd totdat de huidige versie werd vastgesteld. Muizenmodellen maken de analyse mogelijk van de celsubsets of cytokines die betrokken zijn bij de ontwikkeling van ACD en zijn essentieel voor preklinische beoordelingen van nieuwe behandelingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten die in dit artikel worden gepresenteerd, zijn uitgevoerd volgens de richtlijnen van de 1e lokale ethische commissie voor dierproeven in Krakau. Alle beschreven procedures werden uitgevoerd volgens de lokale aanbevelingen, vooral met betrekking tot het gebruik van ketamine / xylazine als verdovingsmiddel, het gebruik van beide zijden van de oren om de stof / hapten aan te brengen, het oor af te snijden en bloed te verzamelen door oogbolverwijdering. BALB/c (haplotype H-2d), CBA/J (H-2k) en C57BL/6 (H-2b) mannelijke en vrouwelijke muizen, 6-12 weken oud, werden gebruikt voor dit onderzoek (zie Materiaaltabel). Voor statistische significantie is het het beste als elke groep muizen uit 10-12 dieren bestaat.

1. Voorbereiding van dieren

  1. Reinig de operatietafel met een 70% ethanoloplossing voor en na alle procedures. Als u muizen gebruikt die steriele omstandigheden vereisen, voert u alle bewerkingen uit in een bioveiligheidskast.

2. Muizen markeren voor identificatie

  1. Label de muizen door de huid te scheren met een scheermesje: #0 - ongemarkeerd, #2 - op de rechtervoorpoot, #3 - aan de rechterkant, #4 - aan de rechter achterpoot, #5 - aan de basis van de staart, #6 - aan de linker achterpoot, #7 - aan de linkerkant, #8 - aan de linkervoorpoot.
    OPMERKING: Vanwege de geïnduceerde reactie kunnen muizen niet klassiek worden gemarkeerd door oorstoten of tagging. De muizen werden niet verdoofd tijdens het etiketteren.

3. Inductie van CHS

OPMERKING: Deze procedure is weergegeven in figuur 1.

  1. Voer de sensibilisatie (inductie) uit volgens de onderstaande stappen.
    1. Scheer op dag "0" muizen op de borst en buik (vierkant 2 cm x 2 cm) door grijze zeep met water aan te brengen en te scheren met een scheermesje.
      LET OP: Wacht voor het aanbrengen van hapten 6 uur zodat de huid niet geïrriteerd raakt.
    2. Bereid 5% hapten: 2,4,6-trinitrochlorobenzeen (TNCB, zie Materiaaltabel) in een aceton-ethanolmengsel (verhouding 1:3) of alleen in een voertuig (aceton-ethanol). Bereid oplossingen vlak voor gebruik in een glazen injectieflacon en bescherm deze tegen licht door de injectieflacon te bedekken met aluminiumfolie.
    3. Sensibiliseer de muizen op dezelfde dag door 150 μL van 5% hapten aan te brengen op de eerder geschoren plek. In de groep controlemuizen past u alleen het medium toe om de niet-specifieke ontstekingsreactie te beoordelen. Voordat u het dier terug in de kooi plaatst, wacht u 30 s en laat u de hapten drogen.
      LET OP: Gebruik handschoenen; TNCB veroorzaakt bij de meeste mensen een ernstige allergische reactie.
  2. Voer elicitatie (challenge) en oorzwelling uit.
    1. Bereid op dag "4" 0,4% hapten: TNCB in een aceton-ethanolmengsel (verhouding 1:1). Bereid de oplossing vlak voor gebruik in een glazen injectieflacon en bescherm deze tegen licht door de injectieflacon te bedekken met aluminiumfolie.
    2. Verdoof de muizen met een intraperitoneale (i.p.) injectie van een mengsel van ketamine (90-120 mg/kg) en xylazine (5-10 mg/kg) (zie Materiaaltabel) voor diepe anesthesie. Zorg ervoor dat de muis volledig verdoofd is gedurende ten minste 5 minuten door teen te knijpen.
    3. Meet de oordikte (0 uur meting, baseline) met een micrometer (zie Materiaaltabel) door een waarnemer die niet op de hoogte is van de experimentele groepen.
    4. Breng 10 μL van 0,4% hapten aan beide zijden van de oren aan in beide groepen (test en controle). Voordat u het dier terug in de kooi plaatst, wacht u 30 s en laat u de hapten drogen.
    5. Herhaal op dag "5", 24 uur na het aanbrengen van hapten, stap 3.2.2-3.2.3 voor de meting van 24 uur.
    6. Evalueer de CHS-respons door het verschil in oorschelpdikte voor en na de challenge te berekenen met de hapten: 24 h oordikte (μm) - 0 h oordikte (μm). Tel elk oor als een afzonderlijke meting. Druk vervolgens de oorzwelling uit in micrometers (μm) ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) (tabel 2, figuur 3).

4. Oorbiopten

  1. Direct na de 24 uur meting van de oordikte (wanneer de muis nog onder diepe anesthesie is), knipt u de oren zo dicht mogelijk bij de schedel af met een schaar. Verzamel de biopsieën van de distale kant van de oren door een pons met een diameter van 6 mm te maken met behulp van een biopsiepunch (zie Materiaaltabel).
    1. Meet het oorgewicht (stap 4.2) en voer daarnaast een van de volgende tests uit op dezelfde oorbiopsie: myeloperoxidase (MPO) assay (stap 4.3) of in vitro meting van cytokineconcentratie in de oorextracten (bijv. IFN-γ, IL-17A, TNF-α [stap 4.4]).
      OPMERKING: Snijd de oren voordat het bloed wordt afgenomen. Na deze procedure moeten de muizen worden geëuthanaseerd (bijvoorbeeld door cervicale dislocatie).
  2. Meet het gewicht van elke oorbiopsie op de analytische balans en druk deze uit in milligrammen (mg) (figuur 4).
  3. Voer een MPO-test uit volgens de onderstaande stappen.
    1. Bereid homogenisatiebuffer voor door 0,5% hexadecyltrimethylammoniumbromide op te lossen in 50 mmolfosforaatbuffer KH2PO4/Na2HPO4 en de pH aan te passen op 6,0 (gebruik bij kamertemperatuur, RT).
    2. Homogeniseer de biopten in 2 ml microcentrifugebuizen met 500 μL bereide buffer gedurende 10 minuten met behulp van een homogenisator met roestvrijstalen kralen met een diameter van 5 mm (voeg twee kralen / injectieflacon toe) (zie materiaaltabel). Laat het monster vervolgens 15 minuten afkoelen bij 4 °C en homogeniseer het nog eens 10 minuten.
      OPMERKING: Microcentrifugebuizen hebben een ronde bodem, zodat de kralen gemakkelijk kunnen bewegen.
    3. Vries de homogenaten gedurende 30 minuten in bij −20 °C. Ontdooien en vortex (zorg ervoor dat de monsters worden ontdooid). Herhaal deze procedure 3x.
    4. Centrifugeer de homogenaten bij 3.000 x g gedurende 30 min bij 4 °C. Oogst de supernatanten met een pipet. Druk de MPO-activiteit uit in eenheden (U) per 1 mg eiwit.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De monsters zijn stabiel bij −20 °C gedurende 3 maanden.
    5. Om de MPO-activiteit te meten, voert u een enzymatische reactie uit door 20 μL supernatant en 200 μL MPO-substraat (0,167 mg/ml orthodianisinedihydrochloride te mengen in 50 mmol KH2PO4/Na2HPO4-buffer met 5 x 10−4% H202) en toe te voegen aan 96-well platte bodemplaten. Incubeer de platen gedurende 20 minuten bij RT.
    6. Bereid de standaardcurve voor met behulp van 20 μL van de MPO-standaard bij concentraties van 0,008 U tot 0,5 U in 200 μL van het MPO-substraat. Bereid het lege monster voor met alleen het MPO-substraat.
      LET OP: Gebruik een masker tijdens het werken met ortho-dianisine dihydrochloride.
      OPMERKING: De platen moeten gemaakt zijn van polypropyleen, dat een lager bindingsvermogen heeft, zodat eiwitten of DNA niet binden.
    7. Meet de optische dichtheid (OD) bij een golflengte van λ = 460 nm. De enzymatische reactie is stabiel gedurende 10 minuten. Lees de MPO-activiteit in geteste monsters van de standaardcurve.
    8. Om de eiwitconcentratie te meten, gebruikt u 20 μL van het supernatant, voert u een test uit met een bicinchonininezuurkit voor eiwitbepaling (zie tabel met materialen) en meet u de OD bij λ = 562 nm (figuur 5).
  4. Voer in vitro metingen uit van cytokines in het oorextract.
    1. Homogeniseer de oorbiopten bij RT in 2 ml microcentrifugebuizen met 500 μL weefseleiwitextractiereagens (T-PER) gedurende 10 minuten met behulp van een homogenisator met roestvrijstalen kralen met een diameter van 5 mm (voeg twee kralen / injectieflacon toe). Laat het monster vervolgens 15 minuten afkoelen bij 4 °C en homogeniseer het nog eens 10 minuten.
      OPMERKING: Microcentrifugebuizen hebben een ronde bodem, zodat de kralen gemakkelijk kunnen bewegen.
    2. Centrifugeer de homogenaten bij 3.000 x g gedurende 30 min bij 4 °C.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De monsters zijn stabiel bij −80 °C gedurende 6 maanden.
    3. Beoordeel de cytokineniveaus met behulp van een in de handel verkrijgbare ELISA-set (bijv. IFN-γ) (zie Materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant (figuur 6).

5. Histologie van oorweefsel

  1. Direct na de 24 uur meting van de oordikte, wanneer de muis nog diep verdoofd is, snijdt u de oren zo dicht mogelijk bij de schedel af met de schaar (stap 4.1).
    OPMERKING: Na deze procedure moeten de muizen worden geëuthanaseerd (bijvoorbeeld door cervicale dislocatie).
  2. Voer paraffine-inbedding van de weefselblokken uit volgens de onderstaande stappen.
    1. Plaats direct na verwijdering het oor in ~ 10 ml 10% formaline gedurende 24 uur.
    2. Plaats de oren in een weefselverwerkingscassette. Plaats de cassettes in een geautomatiseerde processor (zie materiaaltabel) voor dehydratiecycli (alcohol 70%, 90%, 100%, 30 min elk bij RT), clearingcycli (xyleen 3x, 30 min elk bij RT) en wasinfiltratiecycli (paraffine 3x, 30 min elk bij 56 °C).
    3. Verwijder de cassettes uit de geautomatiseerde processor en houd de opwarmplaat vast totdat deze nodig is. Vul de wasvorm met warme was (uit de dispenser).
    4. Verwijder de secties van de cassette met een verwarmde tang en plaats ze in de mal; plaats vervolgens de cassettebasis op de bovenkant van de mal en vul deze vervolgens met meer was. Plaats het in gekoeld water op een koude plaat gedurende 30 minuten, zodat de paraffine stolt tot een blok met het monster.
    5. Gebruik een roterende microtoom (zie Tabel met materialen) om secties van ~ 5 μm dik te snijden. Drijf de secties in een warm bad om ze plat te maken. Pak de secties op een glazen microscoopglaasje. Laat ze drogen bij RT om ervoor te zorgen dat de secties aan de glijbaan hechten.
      OPMERKING: Gebruik dia's die de noodzaak om kleefmaterialen of eiwitcoatings aan te brengen elimineren om het verlies van weefselsecties tijdens het kleuren te voorkomen.
  3. Voer hematoxyline en eosine (H &E) kleuring uit.
    1. Bereid 17 kleuringsschalen met het volgende: xyleen (vier gerechten), 100% ethanol (absolute alcohol) (vier gerechten), 90% ethanol, 80% ethanol, 70% ethanol, 50% ethanol, PBS (drie gerechten), hematoxyline-oplossing, eosine-oplossing. Breng de dia's over van de ene schotel naar de volgende volgens de onderstaande stappen en voer ze allemaal uit bij RT.
      OPMERKING: De procedure in elk gerecht kan ongeveer 10x worden herhaald (bijvoorbeeld als een schaal met 20 dia's wordt gebruikt, kunnen 200 vlekken worden gemaakt zonder de vloeistoffen te veranderen).
    2. Deparaffineer de secties door incubatie bij 65 °C gedurende 30 minuten in de incubator. Dompel de dia's onder in xyleen gedurende 30 minuten. Herhaal 1x in nieuw xyleen gedurende 30 min.
    3. Dompel de dia's onder in 100% ethanol gedurende 5 minuten. Herhaal 1x in nieuwe 100% ethanol gedurende 5 min. Dompel de dia's onder in de ethanolrij, 90%, 80%, 70% en 50%, gedurende 2 minuten in elke verdunning.
    4. Dompel de dia's gedurende 5 minuten onder in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Veeg overtollige vloeistof weg van rond het weefsel en de achterkant van de dia's.
    5. Bevlek de secties in hematoxyline-oplossing (zie materiaaltabel) gedurende 7-8 minuten. Was gedurende 30 s in stromend water vanaf de achterkant om de secties niet te beschadigen. Herhaal stap 5.3.4.
    6. Beits de secties met eosine-oplossing (zie Materiaaltabel) gedurende 30 s. Wassen zoals vermeld in stap 5.3.5 en herhaal stap 5.3.4.
    7. Dompel de dia's onder in 100% ethanol (absolute alcohol) gedurende 2 minuten. Herhaal 1x in nieuwe 100% ethanol gedurende 2 min.
    8. Dompel de dia's onder in xyleen gedurende 5 minuten. Herhaal 1x in nieuw xyleen gedurende 5 min.
    9. Laat de secties 15 minuten aan de lucht drogen bij RT. Voeg een druppel montagemedium (zie Materiaaltabel) toe aan een coverslip en plaats deze vervolgens bovenaan de sectie.
  4. Bekijk het gedeelte onder een lichtmicroscoop onder een vergroting van 20x of 40x en leg beelden vast (figuur 7).

6. Vasculaire permeabiliteitstest

OPMERKING: Als alternatief voor het meten van de oordikte kan een vasculaire permeabiliteitstest worden uitgevoerd.

  1. Sensibiliseer muizen op dag "0" (stappen 3.1.1-3.1.3) en vervolgens, op dag "4", verdoof de muizen (stap 3.2.2) en breng direct hapten aan op de oren (stap 3.2.4), waarbij de 0 uur oormeting wordt weggelaten.
  2. Verdoof de muizen 23 uur na de challenge (stap 3.2.2).
  3. Injecteer intraveneus (i.v.) 8,3 μL/g lichaamsgewicht van 1% Evans blauwe kleurstof (zie Tabel van materialen) in Dulbecco′s Fosfaat-Gebufferde Zoutoplossing (DPBS).
  4. Verdoof de muizen opnieuw - diepe anesthesie (stap 3.2.2) - 1 uur na Evans blauwe injectie.
  5. Verzamel oorbiopten (stap 4.1).
    OPMERKING: Na deze procedure moeten de muizen worden geëuthanaseerd (bijvoorbeeld door cervicale dislocatie).
  6. Haal de kleurstof uit het weefsel, plaats oorponsen in de buisjes met 1 ml formamide en incubeer bij 37 °C in de atmosfeer van 5% CO2 gedurende 18 uur.
  7. Centrifugeer de biopten op 3.000 x g gedurende 3 min bij RT. Verzamel de supernatanten met een pipet.
  8. Meet de OD op een golflengte van λ = 565 nm in 96-well flat-bottom platen tegen een blanco die formamide bevat. De kleur is 24 uur stabiel. Lees de concentratie van de testmonsters uit de standaardcurve (gebruik de concentraties Evansblauw variërend van 0,2-30 μg kleurstof/ml formamide) (figuur 8).
    OPMERKING: De platen moeten gemaakt zijn van polypropyleen, dat een lager bindingsvermogen heeft, zodat eiwitten of DNA niet binden.

7. Serumverzameling en anti-TNP immunoglobuline (IgG1) antilichaammeting

  1. Na het verzamelen van oorbiopten (stap 4.1), wanneer de muis nog onder diepe anesthesie is, verwijdert u de oogbol met een pincet, oefent u zachte druk uit op de muis en verzamelt u bloed uit de retro-orbitale sinus in de buis (injectieflacon met gel voor het verkrijgen van serum, zie Materiaaltabel). Een alternatieve methode om bloed te verzamelen kan zijn om het hart te doorboren met een spuit en het bloed te verzamelen.
    OPMERKING: Het bloed moet worden verzameld na het verwijderen van de oren. Dezelfde bloedingsmethode moet in een heel onderzoek worden gebruikt vanwege mogelijke verschillen in bloedparameters18. Na deze procedure moeten muizen worden geëuthanaseerd (bijvoorbeeld door cervicale dislocatie).
  2. Keer minimaal 6x om, wacht 30 minuten tot het bloed stolt en centrifugeer vervolgens op 1.300-2.000 x g gedurende 10 minuten bij RT.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Het monster is stabiel bij −20 °C gedurende 6 maanden.
  3. Bekleed een 96-well flat-bottom plaat met 50 μL runderserumalbumine geconjugeerd met 2,4,6-trinitrofenyl (TNP-BSA) opgelost in DPBS bij overleg van 10 μg/ml. Bedek vervolgens de tweede plaat met runderserumalbumine (BSA) alleen opgelost in DPBS (achtergrond) in een concentratie van 10 μg / ml. Incubeer een nacht bij 4 °C.
    OPMERKING: Muizenserum bevat antilichamen (Abs) tegen BSA, dus de monsters moeten op beide platen worden getest en vervolgens moet een berekening worden uitgevoerd (OD TNP-BSA - OD BSA).
  4. Was de platen met 300 μL DPBS met 0,05% Tween 20. Herhaal 3x.
  5. Bereid assay diluent (AD): DPBS met 1% BSA. Blokkeer de putten met AD gedurende 1 uur bij RT. Opnieuw wassen (stap 7.4).
  6. Bereid een interne standaard (iSTD) voor: sensibiliseer de muizen met TNCB (stappen 3.1.1-3.1.3) en verzamel en peil het serum 10 dagen na de sensibilisatie bij alle donoren (stap 7.1 en stap 7.2).
  7. Voeg aan de plaat 50 μL van gegradeerde concentraties iSTD verdund met AD toe voor het maken van de standaardcurve (beschreven in tabel 3). Voeg aan de plaat 50 μL serummonsters toe. Test elk monster en elke standaardcurve op beide platen (TNP-BSA en BSA gecoat). Incubeer gedurende 2 uur bij RT. Was de platen (stap 7.4).
  8. Voeg 50 μL gebiotinyleerd antimuis IgG1 monoklonaal antilichaam (mAb, zie Materiaaltabel) verdund 1:250 met AD toe en incubeer gedurende 1 uur bij RT. Opnieuw wassen (stap 7.4).
  9. Voeg 50 μL mierikswortelperoxidase streptavidin (HRD streptavidin, zie Materiaaltabel) verdund 1:2000 met AD toe en incubeer gedurende 30 minuten bij RT in het donker. Was de plaat (stap 7.4).
  10. Voeg 50 μL TMB-substraat toe (zie Materiaaltabel) en incubeer gedurende 30 minuten op RT in het donker.
  11. Stop de enzymatische reactie door toevoeging van 25 μL van 1 M H2SO4; de reactie is stabiel gedurende 30 minuten.
  12. Meet de OD op een golflengte van λ = 450 nm en een achtergrond van 570 nm (de achtergrond moet worden afgetrokken van elke 450 nm-meting). Trek bij het presenteren van de resultaten de BSA-metingen af van de TNP-BSA voor monsters en de standaardcurve. Bereken vervolgens de eenheid (U) van antilichamen volgens de standaardcurve (figuur 9).

8. Adoptieve overdracht van de CHS-effectorcellen

OPMERKING: Deze procedure is weergegeven in figuur 2.

  1. Donoren (in de verhouding van één donor:1 ontvanger): sensibiliseer muizen met TNCB op dag "0" (stappen 3.1.1-3.1.3).
  2. Verdoof op dag "4" de muizendiepe anesthesie (stap 3.2.2).
  3. Isoleer met een tang de oksel- en inguinale lymfeklieren (LAN's) en milt (SPL's). Bundel de LAN's in de ene injectieflacon en de SPL's in een andere.
    OPMERKING: Er is één oksellymfeklier achter de borstspier in elke oksel. Eén inguinale lymfeklier in het heupgebied bevindt zich naast drie bloedvaten. De milt bevindt zich aan de linkerkant van het lichaam achter de darm en maag19. Werk met steriele gereedschappen in een bioveiligheidskast om steriele omstandigheden te behouden. Na deze procedure moeten de muizen worden geëuthanaseerd (bijvoorbeeld door cervicale dislocatie).
  4. Pureer weefsel tussen de matte uiteinden van twee microscoopglaasjes. Laat de celsuspensie door een celzeef met een poriegrootte van 70 μm gaan (zie Materiaaltabel).
  5. Was de cellen met DPBS aangevuld met 1% foetaal runderserum (FBS). Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Decanteer het supernatant en resuspendeer de resterende celpellet in 1-5,0 ml DPBS.
  6. Tel de levende cellen met behulp van een hemocytometer20 met Trypan blue en meng 10 μL van de celsuspensie met 90-990 μL (afhankelijk van het celnummer) trypanblauw. Houd rekening met de verdunning bij het berekenen van het celgetal (10x-100x).
  7. Bereid een mengsel van LAN's en SPL's (verhouding 1:1): 8,0 x 106 tot 7,0 x 107/muis in 200 μL DPBS.
  8. Ontvangers (naïeve syngene muizen): verdoof naïeve ontvangende muizen (stap 3.2.2) en injecteer i.v. met een voorbereid mengsel van de CHS-effectorcellen (stap 8.7). Injecteer in de controlegroep van muizen geen cellen.
  9. Meet de oordikte vóór (0 h) en na (24 h) de challenge (stappen 3.2.1-3.2.6) (figuur 10).
  10. Voer daarnaast tests uit op geïsoleerde CHS-effectorcellen (bijv. celfenotypering of de meting van geproduceerde cytokines door de CHS-effectorcellen door flowcytometrie). Celculturen kunnen ook worden vastgesteld en het vermogen van de CHS-effectorcellen om zich te vermenigvuldigen in aanwezigheid van het antigeen of de hoeveelheid uitgescheiden cytokines in de kweeksupernatanten kan worden beoordeeld21,22 (gegevens niet gepresenteerd).
    OPMERKING: Het uitvoeren van aanvullende tests vereist dienovereenkomstig meer celdonoren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Voor CHS-inductie werden de dieren gesensibiliseerd via huidverf (buik) met 150 μL van 5% TNCB of schijnsensibiliseerd met het voertuig alleen. Op dag "4" werden de oorzwellingsreacties van beide oren geïnduceerd door contactverf (challenge) met 10 μL van 0,4% TNCB bij beide muizen die eerder contact hadden met TNCB (testgroep) en de controlegroepmuizen (schijnsensibiliseerd). De gepresenteerde gegevens laten zien dat de muizen die gesensibiliseerd waren met TNCB en 4 dagen later werden uitgedaagd, een significa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

CHS wordt geïnduceerd via haptens, die zich binden aan zelfeiwitantigenen in de huid, waardoor neoantigenen ontstaan. CHS wordt gemedieerd door lokale extravasculaire rekrutering van circulerende antigeenspecifieke CHS-effector T-cellen, wat resulteert in zwelling in het uitgedaagde weefsel, met een piek van 24 uur na blootstelling van de secundaire huid aan dezelfde hapten6. De zwelling van het weefsel wordt voornamelijk veroorzaakt door de infiltratie van leukocyten en leukocytenafhanke...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door subsidiëring SUBZ. A020.22.060 van de Medische Universiteit in Wroclaw, Polen, en door subsidies van het ministerie van Wetenschap en Hoger Onderwijs N N401 545940 aan MS en IP2012 0443 72 aan MMS.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
70% ethanolMerck KGaA, Darmstadt, Germany65350-Mvoor oppervlaktedesinfectie
96-well flat-bottom platen, polypropyleenGreiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria655101voor MPO en Evans blue meting - platen moeten van polypropyleen zijn, met een lagere bindingscapaciteit zodat eiwitten of DNA niet zullen binden
Aceton (ACS reagens, ≥99,5%)Merck KGaA, Darmstadt, Germany179124
AluminiumfolieMerck KGaA, Darmstadt, GermanyZ185140
Analytische weegschaalSartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, GermanyPRACTUM224-1s, 29105177
Automatische weefselprocessorMediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, IndiaMTP-E-212automatisch voorbereiden weefselmonsters door fixatie, dehydratie, clearing en infiltratie met paraffine
BD Vacutainer SST II Advance (buis met gel voor het verkrijgen van serum)Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USABD 366882
Bicinchoninic zuur kit voor eiwitbepalingMerck KGaA, Darmstadt, GermanyBCA1-1KT
Biotine Rat Anti-Mouse IgG1Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA553441
BSA (rundeserum albumine)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyA9418eiwit tests & analyse, 2 mg/mL
Cell strainer, poriegrootte 70 μmBIOLOGIX, China15-1070geschikt voor 50 mL buizen
DekglasVWR, Radnor, Pennsylvania, United States631-158324 mm, maar het is mogelijk om verschillende maten te gebruiken
Schikbare pipetten capaciteit: 5 mL, 10 mL, 25 mLMerck KGaA, Darmstadt, GermanyZ740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′s fosfaat gebufferde zoutoplossing)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA14190144geen calcium, geen magnesium, kweekplaats voor zoogdiercellen
DPX Mountant voor histologieMerck KGaA, Darmstadt, Germany6522montage medium voor H-E, kan eventueel andere worden gebruikt, bijv. Canada balsem
Dumont 5 pincet - rechtAnimalab, Poznan, Poland11251-10FSTchirurgische instrumenten voor procedures op muizen (moeten gesteriliseerd worden)
Dumont 7 pincet - gebogenAnimalab, Poznan, Poland11272-50FSTchirurgische instrumenten voor procedures op muizen (moeten gesteriliseerd worden)
Eosine Y oplossing, alcoholischMerck KGaA, Darmstadt, GermanyHT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1,5 mLEppenforf, Germany3,01,20,086polypropyleen
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2,0 mLEppenforf, Germany3,01,20,094polypropyleen, ronde bodem (de homogenisatiekralen kunnen gemakkelijk bewegen)
Ethanol 100% (absolute alcohol)Merck KGaA, Darmstadt, Germany1.07017
Ethanol 96%Merck KGaA, Darmstadt, Germany1.59010
Evans blueMerck KGaA, Darmstadt, GermanyE2129
FBS (foetaal runderserum)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USAA3160802
Formaline oplossing, neutraal gebufferd, 10%Merck KGaA, Darmstadt, GermanyHT501128
Formamide 99,5% (GC)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyF7503
Vrieskast -20 °CBosch, GermanyGSN54AW30
Koelkast +4 °C / vrieskast -20 °CBosch, GermanyKGV36V10kweekplaats voor zoogdiercellen, gekwalificeerd, Brazil, 10 x 50 mL
Glas microscoopglazen, SuperFrost PlusVWR, Radnor, Pennsylvania, United States631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449Glijmiddelvrije glazen voor microscoop, zodat het niet nodig is om lijm of eiwitcoatings aan te brengen, om te voorkomen dat er weefsels verloren gaan tijdens het kleuren.
Graph Pad PrismGraphPad Software Inc.v. 9.4.0
Grijze zeepPollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o., Sp. K., PolandBialy jelen zeepgrijze Zeep Bar Natuurlijk Hypoallergeen. Algemeen verkrijgbaar product
H2SO4 (zwavelzuur) 1 mol/l (1 M)Merck KGaA, Darmstadt, Germany1.60313
Harris hematoxylinline oplossingMerck KGaA, Darmstadt, GermanyHHS16
HemocytometerVWR, Avantor, U.S.A612-5719manuele telkamer aanbevolen, dienauwkeuriger
HexadecyltrimethylammoniumbromideMerck KGaA, Darmstadt, GermanyH5882
HomogenisatorQIAGEN Hilden, GermanyTissue Lyser LT, SN 23.1001/05234homogenisator met roestvrijstalen kralen (diameter 5 mm) voor 2 mL centrifugeerbuisjes
Horseradish peroxidase streptavidine (HRP streptavidine)Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USASA-5004-1
Waterstofperoxide oplossing (H202)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyH1009
Incubator Heracell 150iThermo Electron LED Gmbh, Germany4107106837 oC in de atmosfeer van 5 % CO2, en 65 0C voor depar

Referenties

  1. Nosbaum, A., Vocanson, M., Rozieres, A., Hennino, A., Nicolas, J. F. Allergic and irritant contact dermatitis. European Journal of Dermatology. 19 (4), 325-332 (2009).
  2. Hertl, M., et al. Predominance of epidermal CD8+ T lymphocytes in bullous cutaneous reactions caused by beta-lactam antibiotics. The Journal of Investigative Dermatology. 101 (6), 794-799 (1993).
  3. Martin, S. F. T lymphocyte-mediated immune responses to chemical haptens and metal ions: implications for allergic and autoimmune disease. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (3), 186-198 (2004).
  4. Takeyoshi, M., Iida, K., Suzuki, K., Yamazaki, S. Skin sensitization potency of isoeugenol and its dimers evaluated by a non-radioisotopic modification of the local lymph node assay and guinea pig maximization test. Journal of Applied Toxicology. 28 (4), 530-534 (2008).
  5. Nakamura, K., Aizawa, M. Studies on the genetic control of picryl chloride contact hypersensitivity reaction in inbred rats. Transplantation Proceedings. 13 (2), 1400-1403 (1981).
  6. Asherson, G. L., Ptak, W. Contact and delayed hypersensitivity in the mouse. I. Active sensitization and passive transfer. Immunology. 15 (3), 405-416 (1968).
  7. Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 133 (2), 303-315 (2013).
  8. Kaplan, D. H., Jenison, M. C., Saeland, S., Shlomchik, W. D., Shlomchik, M. J. Epidermal langerhans cell-deficient mice develop enhanced contact hypersensitivity. Immunity. 23 (6), 611-620 (2005).
  9. Wang, L., et al. Langerin expressing cells promote skin immune responses under defined conditions. Journal of Immunology. 180 (7), 4722-4727 (2008).
  10. Wang, B., et al. CD4+ Th1 and CD8+ type 1 cytotoxic T cells both play a crucial role in the full development of contact hypersensitivity. Journal of Immunology. 165 (12), 6783-6790 (2000).
  11. Mori, T., et al. Cutaneous hypersensitivities to hapten are controlled by IFN-gamma-upregulated keratinocyte Th1 chemokines and IFN-gamma-downregulated langerhans cell Th2 chemokines. The Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1719-1727 (2008).
  12. Peszkowski, M. J., Warfvinge, G., Larsson, A. Allergic and irritant contact responses to DNFB in BN and LEW rat strains with different TH1/TH2 profiles. Acta Dermato-Venereologica. 74 (5), 371-374 (1994).
  13. Henningsen, S. J., Mickell, J., Zachariae, H. Plasma kinins in dinitrochlorobenzene contact dermatitis of guinea-pigs. Acta Allergologica. 25 (5), 327-331 (1970).
  14. Maibach, H. I., Maguire, H. C. Elicitation of delayed hypersensitivity (DNCB contact dermatitis) in markedly panleukopenic guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 41, 123-127 (1963).
  15. Martel, B. C., Lovato, P., Bäumer, W., Olivry, T. Translational animal models of atopic dermatitis for preclinical studies. The Yale Journal of Biology and Medicine. 90 (3), 389-402 (2017).
  16. Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 129 (1), 31-40 (2009).
  17. Li, Y. Z., Lu, X. Y., Jiang, W., Li, L. F. Anti-inflammatory effect of qingpeng ointment in atopic dermatitis-like murine model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2013, 907016(2013).
  18. Hoggatt, J., Hoggatt, A. F., Tate, T. A., Fortman, J., Pelus, L. M. Bleeding the laboratory mouse: Not all methods are equal. Experimental Hematology. 44 (2), 132-137 (2016).
  19. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50765(2013).
  20. Vlab, A. Hemocytometer - Counting of Cells. Amrita University. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=MKS0KM3lr90 (2011).
  21. Majewska-Szczepanik, M., Strzepa, A., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig and Zymosan induces TCRαβ+ CD4+ contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression via IL-17A. International Archives of Allergy and Immunology. 164 (2), 122-136 (2014).
  22. Majewska-Szczepanik, M., Zemelka-Wiącek, M., Ptak, W., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with DNP-BSA induces CD4+ CD25+ Treg cells that inhibit Tc1-mediated CS. Immunology and Cell Biology. 90 (8), 784-795 (2012).
  23. Directive 2010/63 / EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , Available from: https://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:0079:En:PDF (2010).
  24. Colvin, R. B., Dvorak, H. F. Role of the clotting system in cell-mediated hypersensitivity. II. Kinetics of fibrinogen/fibrin accumulation and vascular permeability changes in tuberculin and cutaneous basophil hypersensitivity reactions. Journal of Immunology. 114, 377-387 (1975).
  25. Szczepanik, M., et al. Regulation of contact sensitivity in non-obese diabetic (NOD) mice by innate immunity. Contact Dermatitis. 79 (4), 197-207 (2018).
  26. Askenase, P. W., Majewska-Szczepanik, M., Kerfoot, S., Szczepanik, M. Participation of iNKT cells in the early and late components of Tc1-mediated DNFB contact sensitivity: Cooperative role of γδ-T cells. Scandinavian Journal of Immunology. 73 (5), 465-477 (2011).
  27. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Ptak, W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen induces antigen-non-specific suppression of CD8 T cell mediated contact sensitivity. Pharmacological Reports. 64 (6), 1485-1496 (2012).
  28. Van Loveren, H., et al. Use of micrometers and calipers to measure various components of delayed-type hypersensitivity ear swelling reactions in mice. Journal of Immunological Methods. 67 (2), 311-319 (1984).
  29. Tsuji, R. F., et al. B cell-dependent T cell responses: IgM antibodies are required to elicit contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 196 (10), 1277-1290 (2002).
  30. Campos, R. A., et al. Cutaneous immunization rapidly activates liver invariant Valpha14 NKT cells stimulating B-1 B cells to initiate T cell recruitment for elicitation of contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1785-1796 (2003).
  31. Rühl-Muth, A. C., Maler, M. D., Esser, P. R., Martin, S. F. Feeding of a fat-enriched diet causes the loss of resistance to contact hypersensitivity. Contact Dermatitis. 85 (4), 398-406 (2021).
  32. Bour, H., et al. histocompatibility complex class I-restricted CD8+ T cells and class II-restricted CD4+ T cells, respectively, mediate and regulate contact sensitivity to dinitrofluorobenzene. European Journal of Immunology. 25 (11), 3006-3010 (1995).
  33. Majewska-Szczepanik, M., et al. Obesity aggravates contact hypersensitivity reaction in mice. Contact Dermatitis. 87 (1), 28-39 (2022).
  34. Katagiri, K., Arakawa, S., Kurahashi, R., Hatano, Y. Impaired contact hypersensitivity in diet-induced obese mice. Journal of Dermatological Science. 46 (2), 117-126 (2007).
  35. Bouloc, A., Cavani, A., Katz, S. I. Contact hypersensitivity in MHC class II-deficient mice depends on CD8 T lymphocytes primed by immunostimulating Langerhans cells. The Journal of Investigative Dermatology. 111 (1), 44-49 (1998).
  36. Martin, S., et al. Peptide immunization indicates that CD8+ T cells are the dominant effector cells in trinitrophenyl-specific contact hypersensitivity. The Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 260-266 (2000).
  37. Vennegaard, M. T., et al. Epicutaneous exposure to nickel induces nickel allergy in mice via a MyD88-dependent and interleukin-1-dependent pathway. Contact Dermatitis. 71 (4), 224-232 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 1/19/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.

Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

to:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

Figure 1 of the Representative Results has been updated from:

Mouse ear thickness measurement experiment diagram; TNCB-induced dermatitis comparison.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mice sensitization process; diagram of control/test groups, TNCB application, ear thickness measurement.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2 of the Representative Results has been updated from:

CHS induction in mice using TNCB, diagram showing sensitization, i.v. cell transfer, ear measurement.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mouse sensitization and TNCB application diagram; CHS study setup with control and test groups.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Trefwoorden

T celresponsooroedeemhapteensensibilisatiemyeloperoxidase assayvasculaire permeabiliteitoverdracht van effectorcellenisolatie van lymfeklieren

Gerelateerde artikelen