Een methode om de correlatie tussen lokale collageenstructuur en mechanische eigenschappen van atherosclerotisch plaquevezelig weefsel te bestuderen

Summary

We hebben een mechano-imaging pijplijn ontwikkeld om de heterogene structurele en mechanische atherosclerotische plaque-eigenschappen te bestuderen. Deze pijplijn maakt correlatie mogelijk van de lokale overheersende hoek en dispersie van collageenvezeloriëntatie, het breukgedrag en de spanningsvingerafdrukken van het vezelige plaqueweefsel.

Abstract

De breuk van atherosclerotische plaques in kransslagaders en halsslagaders is de primaire oorzaak van fatale cardiovasculaire gebeurtenissen. De breukmechanica van het heterogene, sterk collageenachtige plaqueweefsel en hoe dit verband houdt met de vezelige structuur van het weefsel, is echter nog niet bekend. Bestaande pijpleidingen om plaquemechanica te bestuderen zijn beperkt tot het verkrijgen van alleen grove mechanische kenmerken van het plaqueweefsel, gebaseerd op de aanname van structurele homogeniteit van het weefsel. Vezelig plaqueweefsel is echter structureel heterogeen, waarschijnlijk voornamelijk als gevolg van lokale variatie in de collageenvezelarchitectuur.

De hier beschreven mechano-imaging pijplijn is ontwikkeld om de heterogene structurele en mechanische plaque-eigenschappen te bestuderen. In deze pijplijn wordt de lokale collageenarchitectuur van het weefsel gekarakteriseerd met behulp van multifotonenmicroscopie (MPM) met tweede harmonische generatie (SHG) en het faalgedrag van het weefsel wordt gekarakteriseerd onder uniaxiale trekproefomstandigheden met behulp van digitale beeldcorrelatie (DIC) -analyse. Deze experimentele pijplijn maakt correlatie mogelijk van de lokale overheersende hoek en dispersie van collageenvezeloriëntatie, het breukgedrag en de spanningsvingerafdrukken van het vezelige plaqueweefsel. De verkregen kennis is de sleutel tot het beter begrijpen, voorspellen en voorkomen van atherosclerotische plaqueruptuurgebeurtenissen.

Introduction

Ischemische beroerte, vaak veroorzaakt door atherosclerotische plaqueruptuur in halsslagaders, is wereldwijd een van de belangrijkste oorzaken van mortaliteit en morbiditeit¹. De huidige chirurgische behandelingsplanningsstrategieën om carotis atherosclerose-gerelateerde beroerte te voorkomen, omvatten echter geen plaqueruptuurrisicobeoordeling². Dit komt voornamelijk omdat de eerder gesuggereerde risicobiomarkers, zoals plaquedopdikte³ en lipidekerngrootte⁴, suboptimale voorspellende waarde hebben voor toekomstige klinische gebeurtenissen ^5,6. Een beter begrip van plaquemechanica en breukmechanismen is noodzakelijk om de risicobeoordeling van plaqueruptuur te optimaliseren en nieuwe risicomarkers van atherosclerotische plaques te identificeren.

Plaqueruptuur is een lokale mechanische gebeurtenis waarbij het zeer vezelige plaqueweefsel niet bestand is tegen de mechanische belasting die erop wordt uitgeoefend door de bloeddruk en zijn structurele integriteit verliest⁷. Desondanks zijn de mechanica van de plaquebreuk en de link met de onderliggende microstructuur slecht begrepen⁸. De weinige experimentele studies die plaqueweefselfalen karakteriseerden, hebben 9,10,11,12,13 gerapporteerde grove mechanische breukeigenschappen (d.w.z. ultieme trekfalenspanning en -sterkte), afgeleid met de aanname van structurele homogeniteit van het weefsel. Het vezelige plaqueweefsel is echter structureel heterogeen, waarschijnlijk voornamelijk als gevolg van lokale variatie in de collageenvezelarchitectuur¹⁴. Bovendien werd het verband tussen de mechanische faalkenmerken van het plaqueweefsel en de collageenarchitectuur alleen onderzocht in een recente studie van Johnston et al. De auteurs toonden een interplaqueverschil in de overheersende vezeloriëntatie en rapporteerden hogere ultieme spanningen en lagere uiteindelijke stammen voor vezelige plaquekapmonsters met een overwegend omtrekkende vezeloriëntatie¹⁵. De studie was echter ook beperkt tot bruto mechanische en structurele eigenschappen.

Om licht te werpen op de essentiële informatie over de lokale collageenarchitectuur en lokale mechanische eigenschappen van het vezelige plaqueweefsel, hebben we in de huidige studie een mechano-imaging pijplijn ontwikkeld. Deze ex vivo pijplijn maakt kwantificering van de lokale collageenvezelrichting en -dispersie mogelijk, evenals lokale breukstam. De pijplijn omvat MPM-beeldvorming met SHG om collageenvezels in het plaqueweefsel in beeld te brengen, evenals DIC- en uniaxiale trekproeven om de breukkenmerken van het weefsel te kwantificeren.

Multifotonenmicroscopie-tweede-harmonische generatie (MPM-SHG) is een populaire techniek geworden om collageen in biologische weefsels te bestuderen¹⁶. De techniek heeft veel voordelen ten opzichte van andere collageen imaging technieken, zoals histologie¹⁷, diffusie tensor imaging (DTI)¹⁴ en small-angle light scattering (SALS)¹⁵. Ten eerste is MPM-SHG-beeldvorming niet-destructief, waardoor het ideaal is om te combineren met mechanische tests¹⁸. Ten tweede is het SHG-signaal specifiek voor collageen en daarom is er geen kleuring van het weefsel nodig. Door de lange excitatiegolflengten (nabij-infrarood) is de penetratiediepte groter dan bij andere microscopietechnieken¹⁶. De hoge resolutie (μm-niveau) die wordt bereikt met SHG-beeldvorming maakt ook visualisatie van individuele vezels mogelijk. Dit biedt veel mogelijkheden, zoals lokale kwantificering van het aantal collageenvezels, collageenvezeloriëntatie en distributie¹⁹.

Digitale beeldcorrelatie (DIC) in combinatie met mechanische testen is een veelgebruikte methode om lokale mechanische eigenschappen van biologische weefsels te verkrijgen²⁰. Met DIC wordt de verplaatsing van spikkels die op het weefseloppervlak worden aangebracht, gevolgd door hogesnelheidscamerabeelden te vergelijken die zijn verkregen tijdens mechanische tests²⁰. Deze beeldnabewerkingsmethode wordt gebruikt om de full-field oppervlaktestammen van het specimen²⁰ te schatten en kan ook worden gebruikt om het breukgedrag van het weefsel²¹ te bestuderen.

Protocol

Alle in dit artikel beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Ethische Onderzoekscommissie van het Erasmus Medisch Centrum in Rotterdam; Geïnformeerde toestemming werd verkregen van patiënten vóór het verzamelen van plaquemonsters. Een werkstroomdiagram van het protocol is weergegeven in figuur 1.

1. Weefselverzameling, micro-computertomografie (μCT) beeldvorming en voorbereiding van testmonsters

1. Weefselverzameling en -opslag
   1. Verzamel verse menselijke carotis atherosclerotische plaque monsters van instemmende patiënten die carotis endarterectomie chirurgie hebben ondergaan.
      OPMERKING: De plaquemonsters die uit deze operatie zijn verkregen, bestaan uit de zieke intimalaag van de halsslagader, inclusief de ophoping van vet (de lipidenpool) en verkalkingen²².
   2. Verwijder bloedresten met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (1x PBS) en droog het monster met een gaasje.
   3. Plaats het monster met een pincet in een buis van 15 ml. Vries het weefsel in door de buis gedurende 10 minuten in vloeibare stikstof te plaatsen.
   4. Bewaar het monster na het invriezen in een vriezer van -80 °C tot de dag van de μCT-beeldvorming.
      OPMERKING: Snap-freezing minimaliseert kristalvorming, wat leidt tot microstructurele schade in het weefsel. Een eerdere studie op aortaweefsel van varkens heeft aangetoond dat snap-freezing en opslag bij -80 °C geen significante invloed hadden op de mechanische eigenschappen van het weefsel²³.
2. μCT-beeldvorming
   1. Neem op de dag van de μCT-beeldvorming het plaquemonster uit de buis van 15 ml. Als het weefsel aan de buis kleeft, vult u de buis met PBS bij kamertemperatuur. Laat het weefsel in PBS totdat het monster uit de buis kan worden gehaald.
   2. Droog het plaquemonster grondig af met tissuepapier.
   3. Schakel het μCT-systeem in door op de groene knop te drukken. Druk op de warming-up in de CT-software onder aan het scherm en wacht 15 minuten.
   4. Plaats handmatig een röntgenfilter van Cu 0,06 mm + Al 0,5 mm in het μCT-systeem.
   5. Selecteer de map waarin de afbeeldingen moeten worden opgeslagen.
   6. Kies de parameters in het linkerdeelvenster. Gebruik de vervolgkeuzelijsten om een scantijd van 4 minuten, een resolutie van 172 μm, een spanning van 90 kV, een stroomsterkte van 88 mA, een gezichtsveld van 86 mm en een rotatie van 360° te selecteren.
   7. Open de deur van het apparaat. Trek het platform handmatig uit.
   8. Plaats parafilm op het platform en plaats het monster op het platform (naar het uiterste van het platform).
   9. Plaats het platform handmatig in het apparaat en sluit de deur.
   10. Activeer de live-modus (oogpictogram ). Verplaats het platform met de pijlen in het apparaat om het monster in de FOV te centreren.
   11. Begin met de beeldvorming (pictogram in het midden onder). Zodra de afbeelding is voltooid, drukt u op het deurpictogram onderaan (onder de knop afbreken ).
   12. Na de μCT-scan kunt u het plaquemonster opnieuw invriezen zoals beschreven in stap 1.1.3. Bewaar het bij -80 °C tot de dag van multifotonenmicroscopie en mechanische testen.
   13. Open de verkregen DICOM-bestanden van de μCT-beeldvorming in de open-source 3D Slicer-software²⁴.
   14. Ga naar segmenteditor . Selecteer Een nieuwe segmentatie maken | Het volume dat als mastervolume moet worden geanalyseerd.
   15. Klik op Toevoegen om een segment toe te voegen. Druk op de naam en kleur om deze parameters te wijzigen.
   16. Om de segmenten te definiëren, klikt u op effecten | drempel in het onderste deel van het venster. Gebruik dit drempelinstrument om onderscheid te maken tussen verkalkte (>450 HU) en niet-verkalkte (<450 HU) weefselgebieden. Zodra de drempel is geselecteerd, drukt u op Toepassen in het onderste gedeelte.
   17. Druk op 3D weergeven (net rechts van Toevoegen) om de segmentatie in de 3D-weergave te visualiseren. Als er delen van de segmentatie zijn die niet gewenst zijn, verwijder ze dan met het schaareffect .
   18. Wijzig de dekking van segmenten in de segmentatiemodule door op de naam van de gewenste segmentatie te klikken.
       OPMERKING: Indien mogelijk kunnen μCT-beeldvorming en beoordeling van de μCT-beelden op dezelfde dag worden uitgevoerd als de rest van het protocol. Sla in dat geval stap 1.2.12 over. Houd er echter rekening mee dat de volgende stappen van dit protocol ook tijdrovend zijn en op dezelfde dag moeten worden uitgevoerd. Na enige oefening, en met de beschreven instellingen en weefsel, zou μCT-beeldvorming ~ 45 minuten moeten duren, beoordeling van de μCT-beelden ~ 15 minuten, testmonstervoorbereiding van een enkel testmonster ~ 1 uur, microscopie ~ 4 uur en uniaxiale trekproeven ~ 2 uur.
3. Voorbereiding van het testmonster
   1. Op de dag van collageenbeeldvorming en mechanische tests, ontdooi de plaque door onderdompeling in PBS bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 10 minuten.
   2. Open de 3D-constructie van de plaquette die is gemaakt in stappen 1.2.13-1.2.18 in de 3D-slicersoftware.
   3. Gebruik de natuurlijke oriëntatiepunten van het plaqueweefsel om te bepalen welke delen van de 3D-reconstructie overeenkomen met het echte plaquemonster. Identificeer welk gebied van de 3D-reconstructie geen verkalkingen bevat en identificeer dit gebied visueel in de echte plaquette.
   4. Knip de plaque open langs de lengteas van de slagader met behulp van een chirurgische schaar en een pincet. Als er al een snee aanwezig is van de operatie, begin dan met deze snede voor optimaal gebruik van het weefsel. Als het monster geen buisvorm heeft en het moeilijk is om de lengterichting te bepalen, sluit u het monster uit van de test.
   5. Knip rechthoekige testmonsters uit de plaquemonsters. Zorg ervoor dat de testmonsters zo groot mogelijk zijn en vermijd weefselgebieden met scheuren of verkalkingen. Wees voorzichtig tijdens dit snijden, omdat een kleine scheur of scheur aan de rand van het testmonster kan leiden tot scheurvoortplanting van de bestaande scheur tijdens trekproeven.
   6. Zorg ervoor dat de testmonsters een breedte-lengteverhouding (WL) hebben van <1 in de meetlengte zodra deze in de trekstester is gemonteerd. Als de monsters aan deze eis voldoen, zijn ze geschikt voor geschikte trekproeven in termen van randvoorwaarden²⁵.
      OPMERKING: Het bereik in de monsterafmetingen kan groot zijn. De monsters die de auteurs testten, hadden een meetlengte die varieerde tussen 3,4 en 12,9 mm en een breedte die varieerde tussen 1,6 en 6,4 mm.

2. Multifoton microscopie beeldvorming

1. Voorbereidingen
   1. Verdeel vóór de dag van collageenbeeldvorming en mechanische tests 40 g van een siliconenelastomeerbasis over twee buizen van 50 ml en voeg 2 g van het uithardingsmiddel toe aan elke buis (verhouding van 1: 10) met behulp van een Pasteur-pipet. Meng de twee componenten met het pipet.
   2. Centrifugeer de buizen gedurende 1 minuut bij 700 × g om zoveel mogelijk luchtbellen te verwijderen.
   3. Vul een petrischaaltje (10 cm diameter) met een dunne laag (ongeveer 0,5-1 cm) silicium en incubeer het in de oven bij 65 °C gedurende 3 uur of plaats het gedurende 48 uur op kamertemperatuur.
   4. Neem een plaquetestmonster en bevestig beide uiteinden aan het silicium door naalden in het weefsel vast te pinnen (figuur 2A). Zorg ervoor dat de lichtzijde van het monster naar boven is gericht. Steek de naalden in het gebied van het monster dat zich tijdens de mechanische test in de klemmen van de trekproefinrichting bevindt.
   5. Zet een veiligheidsbril op. Gebruik een zijsnijder om de naalden in te korten, zodat ze minder dan een paar millimeter boven het monsteroppervlak uitsteken, om te voorkomen dat ze het microscoopobjectief beschadigen. Vul de petrischaal met PBS totdat het monster is ondergedompeld.
2. Microscopie instellen
   1. Zorg ervoor dat er een goed objectief op de multifotonenmicroscoop is gemonteerd. Gebruik een objectief dat is geoptimaliseerd om infrarood licht te verzenden, met een vergroting van 20x.
   2. Start het microscoopsysteem op. Open de besturingssoftware van de microscoop.
   3. Wanneer u wordt gevraagd om de beeldvormingstabel te initialiseren, moet u ervoor zorgen dat de condensorarm van de microscoop naar achteren wordt geduwd en dat het objectief zich op de laagste positie bevindt.
   4. Activeer de multifotonlaser.
   5. Leg de petrischaal met het testmonster erin onder het objectief, zoals in figuur 3. Zorg ervoor dat u het objectief nog niet boven het monster plaatst, omdat de laserinstellingen nog moeten worden geoptimaliseerd. Anders kan het mogelijke hoge vermogen van het laserlicht leiden tot schade aan het weefsel.
   6. Zorg ervoor dat het doel enigszins is ondergedompeld in PBS. Gebruik indien nodig een pipet om extra PBS toe te voegen.
   7. Stel de lichtgolflengte in op 880 nm.
      OPMERKING: Deze golflengte is gekozen omdat het SHG-emissiefilter in het gebruikte twee-fotonensysteem een middengolflengte van ongeveer 440 nm heeft. Voor andere microscopen is een andere golflengte misschien meer van toepassing.
3. Tegelscan en selectie van beeldlocaties
   1. Schakel de multifotonenlaser uit en activeer de brightfield-modus van de microscoop. Schakel vervolgens de live scanmodus in.
   2. Plaats het stadium zodanig dat het objectief zich boven het monster bevindt en breng het monsteroppervlak in beeld. Schakel de live scanmodus uit.
   3. Wijzig onder het tabblad acquisitie in het tweede deelvenster de zoomfactor in 1 door de beoogde balk te schuiven.
      OPMERKING: Deze zoomfactor bepaalt samen met de vergrotingsfactor van het objectief (20x) de grootte van het vastgelegde beeld (739 μm x 739 μm).
   4. Wijzig op het tabblad Acquisitie in het tweede deelvenster de scansnelheid in 400 Hz, het lijngemiddelde in 1 en de resolutie in 128 x 128 pixels per afbeelding (pixelgrootte van ~5,8 μm x 5,8 μm) met behulp van de vervolgkeuzelijsten.
   5. Klik op het tabblad Acquisitie in het eerste deelvenster op het rasterpatroonsymbool en wacht tot er een tegelscanvenster wordt weergegeven.
   6. Schakel de live scanmodus in. Verplaats het objectief naar een hoek van het voorbeeld met behulp van de knoppen in het infopaneel en klik op het markeringspositiesymbool in het deelvenster tegelscan. Herhaal dit voor elke hoek van het monster. Als het correct wordt uitgevoerd, wordt een raster met alle geselecteerde tegels voor afbeelding oranje weergegeven.
   7. Schakel de functie voor automatisch naaien uit .
   8. Klik op start in de rechterbenedenhoek van het scherm om een tegelscan van het volledige monsteroppervlak te maken om een overzicht van de monstergeometrie te krijgen.
      OPMERKING: Op basis van de beschreven instellingen, weefsel en microscoopsysteem duurt het verkrijgen van een tegelscan van het gehele monsteroppervlak ~ 10 minuten.
   9. Bekijk na de tegelscan de x- en y-coördinaten van de linkerbovenhoek van elke tegel in het tegelscanpaneel, automatisch weergegeven door de software van het microscopiesysteem. Noteer deze coördinaten in een spreadsheet.
   10. In de microscoopsoftware, in het tegelscanpaneel, observeert u het aantal tegels in de x- en y-richting in het vak scanfield. Let op de grootte van de tegelscan in de spreadsheet. Bereken de coördinaten van de andere tegels door de grootte van de tegel (739 μm) op te tellen/af te trekken.
       OPMERKING: Deze coördinaten zijn nodig om de exacte locatie te identificeren van de tegels die moeten worden gescand met SHG-beeldvorming. Als de totale beeldverwerkingstijd geen probleem is, kunnen alle tegels worden afgebeeld zonder een tegel over te slaan.
   11. Selecteer in de tegelscan de tegels die moeten worden afgebeeld met SHG-afbeeldingen. Vermijd voor deze selectie tegels die zich in de klemmen bevinden en laat één tegel tussen elke geselecteerde tegel in zowel de lengte- als de omtrekrichting, zoals weergegeven in figuur 2B.
4. Collageen visualiseren: SHG-beeldvorming
   1. Doe de lichten in de kamer uit en bedek het microscooppodium met verduisteringsstof, zodat er geen licht uit de kamer de detector bereikt.
      OPMERKING: Het minimaliseren van licht dat de detectoren bereikt, vermindert de ruis tijdens het verkrijgen van beelden.
   2. Schakel de multifotonlaser (MP) in.
   3. Selecteer de NDD-detector (Non-Descanned Detection) die is uitgerust met een 430-450 nm bandpassfilter.
   4. Identificeer de locatie van de tegels die moeten worden afgebeeld met behulp van de informatie die is verkregen in stap 2.3.10. Vul de coördinaten in de daarvoor bestemde vakken in en klik op enter, zodat het doel naar de juiste tegel gaat. Schakel de live scanmodus in.
      OPMERKING: Met andere microscopen of nieuwere versies van de besturingssoftware kan het verplaatsen naar locaties binnen de tegelscan automatisch worden uitgevoerd. In dit geval is het noteren van de x- en y-coördinaten van elke tegel (stap 2.3.10) en het invullen van de coördinaten in de besturingssoftware (stap 2.4.4) niet nodig.
   5. Verhoog het MP-laservermogen door de schuifregelaar in het bovenste paneel onder de instellingen van het straalpad te gebruiken om het hoogst mogelijke laservermogen te krijgen zonder noemenswaardige bleking. Pas vervolgens de detectorversterking aan om heldere beelden te verkrijgen, maar zonder verzadigde pixels, door de knop op het slimme paneel te gebruiken of door op de naam van de detector te klikken onder beam path-instellingen | extra kanalen. Typische waarden voor de detectorversterking liggen tussen 500 en 800 V.
   6. Gebruik de z-positieknop op het slimme paneel om het scherpstelvlak aan te passen.
   7. Ga naar de bovenkant van het voorbeeld en stel de posities van de bovenkant van de z-stack in door op de pijlpunt in het z-stack paneel te klikken (onder het acquisitietabblad |^3e paneel).
   8. Focus vervolgens op het monster totdat het SHG-signaal niet langer wordt gedetecteerd - dit is het einde van de stapel. Klik nogmaals op de pijlpunt in het z-stack paneel om deze positie in te stellen. Als u klaar bent, schakelt u de live scanmodus uit.
      OPMERKING: Het weefsel is mogelijk niet helemaal vlak. Daarom kan het monsteroppervlak van verschillende regio's in het weefsel enigszins verschillende posities in de z-richting hebben.
   9. Houd onder het tabblad acquisitie in het tweede deelvenster de scansnelheid op 400 Hz, stel het lijngemiddelde in op 2 en de resolutie op 512 x 512 pixels per afbeelding (pixelgrootte van ~ 1,4 μm x 1,4 μm) met behulp van de vervolgkeuzelijsten. Schakel de bidirectionele X-scanknop in.
   10. Klik op z-step size in het z-stack paneel en vul een z-step grootte van 3 μm in de box. Klik op start in de rechterbenedenhoek van het scherm om een z-stack te maken. Als u klaar bent, moet u de coördinaten van de tegel opslaan in de bestandsnaam of elke tegel een eigen nummer geven (zoals in figuur 2B).
       OPMERKING: Op basis van de beschreven instellingen, weefsel en microscoopsysteem duurt het verkrijgen van een z-stack van een enkele tegel ~ 10-15 minuten. De voorbereidingsstappen (stappen 2.4.4-2.4.10) zijn opgenomen in deze tijdsschatting.

3. Mechanisch testen

1. Voorbereiding van uniaxiale trekproefopstelling
   1. Maak de horizontale trekproefopstelling (figuur 4) klaar voor gebruik, volgens de instructies voor de trektester (bijv. software inschakelen, klemmen bevestigen, loadcel bevestigen).
   2. Om het uitglijden van het testmonster tot een minimum te beperken, bevestigt u dubbelzijdige schuimtape (figuur 4A, B-2) aan de binnenzijde van de klemmen van de trekstester en schuurpapier aan de binnenzijde van de schuimtape. Uiteindelijk komt het schuurpapier in contact met het testmonster.
   3. Plaats het verwarmingsbad (figuur 4A, B-3) op zijn plaats. Vul het verwarmingsbad met PBS tot ter hoogte van de onderkant van de klemmen, zodat het nog niet bij het schuurpapier komt.
   4. Zet de stroombron van het verwarmingsbad aan en stel de temperatuur in op ongeveer 37 °C.
   5. Monteer de hogesnelheidscamera boven het trektestsysteem (figuur 4A-4), bijvoorbeeld met behulp van een laboratoriumstandaard, en monteer een lens met een brandpuntsafstand van 50 mm op de camera via een verlengring.
   6. Zorg ervoor dat de klemmen scherp zijn en dat het gezichtsveld groot genoeg is om het monster tijdens de gehele rekprocedure (FOV-breedte: ± de monsterbreedte vast te leggen; FOV lengte: ± 2x de lengte van het monster).
   7. Monteer het verlichtingssysteem (figuur 4A-5) boven het trekproefsysteem, bijvoorbeeld met behulp van een laboratoriumstandaard. Schakel het verlichtingssysteem in en pas de lichtintensiteit en -locatie aan, zodat er geen reflecties op het PBS-oppervlak op het camerabeeld kunnen worden waargenomen.
   8. Pas de belichtingstijd en versterking van de camera aan om heldere beelden te verkrijgen.
   9. Stel de beeldacquisitiesoftware in om vast te leggen met 30 frames/s met een resolutie van 5,2 MP.
      OPMERKING: Deze hoge framesnelheid is nodig om de daaropvolgende DIC-analyse uit te voeren en het breukgedrag te bestuderen.
   10. Stel de verplaatsingssnelheid van een van de klemmen zodanig in dat de globale technische reksnelheid tijdens mechanische tests vergelijkbaar is met de in vivo fysiologische overbelastingssnelheid van het weefsel
       (5%/s voor plaqueweefsel²⁶).
2. Generatie van spikkelpatroon
   OPMERKING: Dit spikkelpatroonprotocol is gebaseerd op eerder werk van Walsh et ^al.27.
   1. Droog het monster door het lichtjes te deppen met vloeipapier.
   2. Doe de zwarte tissue kleurstof in de daarvoor bestemde emmer van de airbrush.
   3. Sluit de airbrush aan op de compressor. Zet de airbrushcompressor aan en stel de druk in op 25 PSI.
   4. Probeer een optimaal spikkelpatroon op papier te maken voordat je op het weefsel spuit. Spuit een paar keer tot een zwart/wit verhouding van 50 :50²⁸ is bereikt. Beweeg de naald van de airbrush heen en weer om de ruwheid van het spikkelpatroon aan te passen totdat de grootte van een spikkel vergelijkbaar is met de grootte van 3-5 pixels van de hogesnelheidscamera²⁹.
      OPMERKING: Het spikkelpatroon wordt voor twee verschillende doeleinden gebruikt. Eerst wordt de verplaatsing van deze spikkels gemeten door hogesnelheidscamerabeelden te vergelijken die zijn verkregen tijdens mechanische tests (DIC, stap 4.2). Ten tweede wordt dit spikkelpatroon gebruikt om de breuklocatie op de afbeelding van de niet-vervormde toestand van het monster te identificeren (stap 4.3.1).
   5. Houd de airbrush op ongeveer 30 cm afstand van het testmonster en spuit op het lichtgevende oppervlak.
   6. Laat de kleurstof zich gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur aan het monster hechten voordat u het monster onderdompelt in PBS.
3. Uniaxiale trekproeven
   1. Plaats het monster in de klemmen van de trektester, waarbij de omtrekrichting van de monsters is uitgelijnd met de trekstrekrichting en de lichtgevende zijde van het monster naar boven is gericht. Zorg ervoor dat de initiële meetlengte zo is ingesteld dat de WL-verhouding van de strips <1 is.
   2. Draai de schroeven van de grepen vast door een koppel van 20 cNm toe te passen met behulp van een koppelschroevendraaier. Doe dit geleidelijk door een klein koppel op elke schroef aan te brengen voordat u het uiteindelijke koppel aanbrengt.
   3. Controleer visueel of het monster scheuren bevat die de tests kunnen beïnvloeden.
   4. Breng meer PBS in het verwarmingsbad totdat het monster is ondergedompeld en wacht tot de temperatuur van de PBS weer 37 °C heeft bereikt.
   5. Verkrijg een kalibratiebeeld met de hogesnelheidscamera, waarin het testmonster en een liniaal als referentie zijn opgenomen. Zorg ervoor dat de liniaal zich op dezelfde afstand van het cameraobjectief bevindt als het luminale oppervlak van het monster.
   6. Tarra de loadcel en begin met het registreren van de globale kracht- en verplaatsingsmetingen van de loadcel en de actuator van de trektester.
   7. Maak het monster recht door een voorrek van 0,05 N toe te passen om de speling in het monster te verwijderen. Voer 10 voorconditioneringscycli uit tot 10% spanning op basis van de meetlengtemeting door de actuator na het aanbrengen van prestretch.
   8. Start de uniaxiale trekproef totdat het monster volledig is mislukt, terwijl u een video van de vervorming van het monster opneemt met de hogesnelheidscamera. Stop na weefselfalen met het registreren van de globale kracht- en verplaatsingsmetingen.
      OPMERKING: Sommige commerciële trektesters kunnen stappen 3.3.6-3.3.9 automatisch uitvoeren. Het huidige protocol beschrijft de handmatige stappen die moeten worden genomen als deze automatische optie niet is opgenomen in de trekstester die wordt gebruikt.
   9. Verwijder het testmonster uit de trekproefinrichting en gooi het op de juiste manier weg.
   10. Vervang bij het testen van het volgende monster het schuurpapier en de schuimtape op de klemmen.

4. Data-analyse

1. Collageen organisatie analyse
   1. Open de z-stacks verkregen tijdens MPM met SHG in ImageJ en maak maximale intensiteitsprojecties (MIPs) van elke z-stack.
   2. Analyseer elke MIP met de open-source MATLAB-gebaseerde FOA (Fiber Orientation Analysis) tool³⁰ om de oriëntatiehoek van de individuele collageenvezels in de tegels te meten. Gebruik de volgende parameters: Schalen: [3 4 5] of [2 4 6], afhankelijk van de diameter van het vat, en vatheidsdrempel: 0,999, 0,9995 of 0,9999, afhankelijk van de intensiteit van het SHG-signaal.
      OPMERKING: Meer informatie over het gebruik van deze tool is te vinden in de handleiding van de software³¹.
   3. Gebruik een andere open-source MATLAB-gebaseerde tool, FibLab³², om een Gaussische verdeling aan te passen aan het histogram van de hoekverdeling.
      OPMERKING: Meer informatie over het gebruik van deze tool is te vinden in de handleiding van de software³².
   4. Uit de Gaussische verdelingsplot verkregen met behulp van FibLab, extraheer de volgende structurele parameters uit de werkruimte van MATLAB: de overheersende vezelhoek (μ p), die de modus van de verdeling is, de standaardafwijking (σ_p) van de vezelhoekverdeling en de anisotrope fractie (P_ani = 1 − P_iso).
      OPMERKING: De isotrope fractie is het gebied onder de basislijn in de Gauss-verdeling, terwijl de anisotrope fractie het gebied van de piek bovenop die basislijn³³ bevat. Zowel σ_p als P_ani geven informatie over de verspreiding van de oriëntatie van de vezels in het tegelgebied.
   5. Voor visuele inspectie plot u μp met behulp van georiënteerde lijnen en σ_p en P_animet behulp van kleurenkaarten.
2. Digitale beeldanalyse en breukanalyse
   1. Voer visuele inspectie uit op de camerabeelden om het frame te identificeren waarin breukinitiatie optreedt. Identificeer op dit frame visueel de breuklocatie.
   2. Voer visuele inspectie uit op de camerabeelden om eventuele scheuren of scheuren op de plaats van breuk aan het begin van mechanische tests te identificeren. Als een dergelijke scheur aanwezig is, sluit u het monster uit van analyse.
   3. Voer de DIC-analyse uit met de open-source, MATLAB-gebaseerde software Ncorr (v1.2)³⁴. Volg de stappen in de Ncorr handleiding³⁵.
      1. Gebruik de camerabeelden die tijdens de trekproef zijn opgenomen met de hogesnelheidscamera voor DIC. Selecteer het laatste frame voor het laatste uitrekken tot de fout (na de voorconditionering) als referentieafbeelding. Voor de huidige afbeeldingen selecteert u alle afbeeldingen vanaf het begin van het laatste uitrekken tot het laatste frame vóór het frame waarin de breukinitiatie plaatsvond.
      2. Selecteer het monsteroppervlak als de regio van belang (ROI). Sluit de gebieden uit die zich in de buurt (ongeveer 1 mm) van de klemmen bevinden, omdat de spanningen in deze gebieden sterk worden beïnvloed door de grepen.
      3. Voer DIC-analyse uit met behulp van de volgende parameters: Subsetradius: 30 pixels; Afstand tussen subsets: drie pixels; Iteratie cutoff: 50; Norm van de verschilvectorafsnijding: 10-5; Rekstraal: 5; Automatische voortplanting, stap #: 5.
      4. Uit de DIC-analyse met Ncorr kunt u de Green-Lagrange (of Eulerian stam) verdelingen van de ROI verkrijgen. Gebruik deze stamverdelingen om de gemiddelde Green-Lagrange-stam van het gehele plaquemonsteroppervlak te berekenen bij het laatste frame vóór de breuk. Bereken de Green-Lagrange-stam op de breuklocatie.
3. Correleren van structurele en mechanische gegevens op de breuklocatie
   1. Identificeer met behulp van de natuurlijke oriëntatiepunten in het testmonster en de aangebrachte spikkels op het testmonster de breuklocatie (geïdentificeerd in stap 4.2.1) op het referentiebeeld (stap 4.2.3.1).
   2. Maak met behulp van de natuurlijke oriëntatiepunten in het testmonster een overlay van de referentieafbeelding en de tegelscan (stap 2.3) om de breuklocatie op de tegelscan te identificeren. Identificeer de MPM-SHG-tegel waar de breuk is opgetreden. Als de breuk zich niet in een tegel bevindt die is gescand met de MPM-SHG, identificeert u de tegel die zich het dichtst bij de breuklocatie bevindt. Verkrijg de structurele parameters die te vinden zijn op de tegel waar breuk is opgetreden.

Results

Weefselverzameling en voorbereiding van testmonsters
De weefselcollectie levert plaque vezelige weefselmonsters op die kunnen worden ontleed in individuele testmonsters voor structurele beeldvorming en uniaxiale trekproeven. Idealiter bevat een verzameld vezelig weefselmonster gebieden met weinig tot geen scheuren (figuur 5A) en macrocalcificaties (figuur 5B). Een teveel aan deze scheuren en verkalkingen (figuur 5C) kan leiden tot plaquemonsters die niet voldoen aan de eerder genoemde monstermaatvereiste van WL 1.

Multifoton microscopie beeldvorming
SHG-beeldvorming en beeldnabewerking biedt MIPs van elke afgebeelde tegel (figuur 6A, B). Verdere nabewerking door vezeldetectie (figuur 6C) levert vezeloriëntatiehistogrammen op (figuur 6D) waaruit structurele parameters van collageen kunnen worden geëxtraheerd (figuur 6E). Bovendien kunnen kleurenkaarten met de lokale structurele collageenparameters over het gehele plaquemonster worden verkregen voor visuele analyse (figuur 6F, G). Voor het representatieve testmonster in figuur 6 wordt een grote intrasamplevariatie in de structurele collageenparameters gevonden (gemiddelde ± SD van μ p = -34° ± 32°; σ_p = 21° ± 4°; P_ani = 0,49 ± 0,14, als de omtrekrichting is gedefinieerd als 0°). Deze intrasample-variatie benadrukt het belang van het verkrijgen van lokale structurele parameters in plaats van uit te gaan van homogeniteit.

Mechanisch testen
Breukgedrag
De hogesnelheidscamera geeft beelden van het vervormings- en breukgedrag van de plaquemonsters tijdens mechanische tests (figuur 7). Uit deze beelden kan de locatie van de breukinitiatie en het breukvoortplantingspad worden afgeleid. De resultaten van de breukidentificatie zijn suboptimaal als er bellen of reflecties aanwezig zijn in de camerabeelden, of als de breuk zich te snel voortplant om te worden vastgelegd door de gekozen framesnelheid.

Lokale spanningspatronen
Digitale beeldcorrelatieanalyse op de camera-opnamen die zijn verkregen tijdens de uniaxiale trekproef levert de lokale weefselvervormingskaarten op, zoals de Green-Lagrange-stamkaarten in figuur 8. Deze kaarten tonen de drie rekcomponenten (ε_xx, ε_xy en ε_yy) op het frame voordat de breukinitiatie plaatsvindt. Uit deze stamkaarten kunnen de gemiddelde stammen in een interessegebied en de lokale stam op een plek, zoals de breuklocatie, worden geëxtraheerd.

Voor de representatieve steekproef in figuur 8 laten de lokale stamgegevens een grote intrasamplevariatie zien. Voor het representatieve testmonster in figuur 8 wordt een grote intrasamplevariatie in de lokale stammen gevonden (de bereiken van de waargenomen stammen zijn als volgt: ε_xx = -0,30-0,17; ε_xy = -0,13-0,20; ε_jj = 0-0,40). Dit benadrukt het belang van het verkrijgen van lokale gegevens in plaats van bruto, gemiddelde waarden verkregen met de aanname van weefselhomogeniteit.

Correleren van mechanische en structurele weefselinformatie
De bovengenoemde resultaten maken associatie van de lokale vervorming en het breukgedrag van het weefsel met de collageenarchitectuur mogelijk. Zodra de breuklocatie is geïdentificeerd op de camera-opnamen (figuur 9A), kan deze worden toegewezen aan het referentiecamerabeeld (figuur 9B) en aan de microscopietegelscan (figuur 9C). Dit geeft de MPM-SHG-tegel waar de breuk plaatsvond en de structurele parameters die bij deze tegel zijn gevonden (figuur 9D). De structurele parameters gevonden in de tegel waar breuk optrad in een representatief monster, weergegeven in figuur 9, zijn μ p = 28°, σ_p = 19° en P_ani = 0,6. Dezelfde procedure kan ook worden toegepast op de niet-gescheurde weefsellocaties. Het is belangrijk op te merken dat het in kaart brengen van de breuklocatie op de referentieafbeelding van het breukkader een uitdaging kan zijn in het geval van een slecht spikkelpatroon en onduidelijke natuurlijke oriëntatiepunten. Bovendien, als de natuurlijke oriëntatiepunten van het weefsel niet duidelijk genoeg zijn, kan co-registratie van de tegelscanoverlay en de hogesnelheidscamerabeelden moeilijk zijn.

Figuur 1: Workflowdiagram van het gepresenteerde experimentele protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Selectie van tegels voor SHG-beeldvorming uit de tegelscan . (A) Testmonster vastgepind in silicium. B) Tegelscan van het door middel van brightfieldmicroscopie verkregen testmonster. De tegels die zijn geselecteerd voor SHG-beeldvorming worden gemarkeerd door blauwe vierkanten. (C) Maximale intensiteitsprojectie van het MPM met SHG. Schaalbalk = 140 μm (C). Afkortingen: SHG = tweede harmonische generatie; MPM = multifotonenmicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Plaquemonster geplaatst onder het doel van de multifotonenmicroscoop. De locatie van het plaquemonster wordt beveiligd door een met fosfaat gebufferde met zoutoplossing gevulde petrischaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Op maat ontworpen uniaxiale trektester met aangegeven verschillende componenten . (A) Totaaloverzicht van het systeem. Merk op dat de schuurpapierinzetstukken in de klemmen zichtbaar zijn omdat alleen de onderste klemmen zijn bevestigd. (B) Ingezoomd beeld van de klemmen van de trekproef met het testexemplaar klaar voor test. Afkortingen: PVC = polyvinylchloride; LED = light-emitting diode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Resultaten van weefselverzameling en monstervoorbereiding van representatieve monsters . (A) Vers en intact plaquemonster, verkregen van instemmende patiënten die een carotis-endarterectomie-operatie hebben ondergaan. (B) 3D-reconstructie van een μCT-scan. Verkalkt weefsel wordt weergegeven in lichtblauw en niet-verkalkt in rood. Een optimaal monster zonder verkalkt weefsel kon worden verkregen uit het gebied tussen de blauwe lijnen. (C) 3D-reconstructie van de μCT-scan met een suboptimale plaque met een overmaat aan verkalkt weefsel. Schaalbalk = 3 mm. Afkorting: μCT = micro-computertomografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: MPM-SHG resultaten van een representatieve steekproef. (A) Overzicht van tegelscans; De geselecteerde tegels voor beeldvorming worden in blauw weergegeven. (B) MIPs van verschillende tegels. (C) Vezeldetectie door de FOA-tool van een geselecteerde tegel . (D) Fiber oriëntatie histogram van een geselecteerde tegel. (E) Vezeloriëntatie histogram + Gaussische pasvorm, waaruit collageen structurele parameters kunnen worden geëxtraheerd uit een geselecteerde tegel. (F) Weergave van de μ p (oriëntatie zwarte lijn) en σ_p (achtergrondkleur) over het gehele plaquemonster. (G) Weergave van de μ_p (oriëntatie zwarte lijn) en P_ani (achtergrondkleur) over het gehele plaquemonster. Schaalstaven = 140 μm (B,C). Afkortingen: MPM-SHG = multifoton microscopie-seconde-harmonische generatie; MIPs = projecties met maximale intensiteit; FOA = vezeloriëntatieanalyse; μ_p = overheersende vezelhoek; P_ani = anisotrope fractie; σ_p = standaardafwijking van de vezelhoekverdeling; P_iso = isotrope fractie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Breukinitiatie en -voortplanting in een plaqueweefselmonster tijdens de trekproefprocedure.1) Voorgestrekte toestand, intact weefsel. 2) Breukinitiatie-eerste frame waarin breuk wordt waargenomen. De breukinitiatielocatie is gemarkeerd met een rood vierkant. 3 ) en 4) Breukvoortplanting. 5) Volledige breuk van het plaquemonster. Schaalstaven = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Green-Lagrange stampatronen van een representatief monster (ε_xx, ε_xy en ε_yy) bij het frame vóór de breuk, verkregen met DIC-analyse. Gemiddelde en standaarddeviatie over de gehele plaque worden gegeven, samen met de spanning op de breuklocatie. Afkortingen: DIC = digitale beeldcorrelatie; ε_xx = langsbelasting; ε_xy = afschuiving; ε_yy = trekspanning. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Overlaybeeld van de breuklocatie (rood vierkant) op afbeeldingen. (A) Beeld van hogesnelheidscamera's, waarbij breuk wordt geïdentificeerd (breukframe). (B) Beeld van hogesnelheidscamera's, waarbij alleen prestretch wordt toegepast (referentiekader). (C) Het tegelscanbeeld verkregen via microscopie. (D) Een kleurgecodeerde kaart met lokale collageen structurele parameters op verschillende tegels. De μ_p (oriëntatie zwarte lijn) en P_ani (achtergrondkleur) over het gehele plaquemonster worden gepresenteerd. Afkortingen: μ_p = overheersende vezelhoek; P_ani = anisotrope fractie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De huidige studie richtte zich op het ontwikkelen van een mechano-imaging pijplijn om de correlatie te bestuderen tussen de lokale collageenoriëntatie en -dispersie, lokale mechanische eigenschappen en breukgedrag van fibreus atherosclerotisch plaqueweefsel. Het hierin beschreven protocol is om verschillende redenen vernieuwend. Ten eerste is dit de eerste keer dat digitale beeldcorrelatie is toegepast om de lokale vervorming van vezelig plaqueweefsel onder mechanische belasting te meten. Ten tweede biedt dit protocol de nodige informatie om de associatie tussen het lokale vervormingspatroon en de lokale collageenarchitectuur van het vezelige plaqueweefsel te analyseren. Het belang van de lokale beoordeling wordt benadrukt door zowel de stamgegevens als de collageengegevens in de resultatensectie, die de heterogene aard van het weefsel laten zien. Daarom wordt het gebruik van technieken die lokale beoordeling mogelijk maken, zoals die in dit protocol worden gebruikt, aanbevolen voor toekomstige studies van vezelige plaque-eigenschappen.

De voorbereiding van het testmonster is een van de kritieke stappen van dit protocol. Carotis plaques zijn voornamelijk collageenweefsels; Ze kunnen echter verkalkingen bevatten die worden geacht het algehele mechanische gedrag van de plaque^{te beïnvloeden 36,37}. Omdat de studie zich richt op de vezelige weefselcomponent van de plaque, worden verkalkingen in de testmonsters vermeden door μCT-beeldvorming³⁸ te gebruiken. Als μCT niet beschikbaar is, kunnen andere beeldvormende technieken zoals MRI of OCT³⁹ worden overwogen voor het detecteren van de verkalkte gebieden in de plaque. Het verkrijgen van vezelige weefseltestmonsters die vrij zijn van verkalkingen en die groot genoeg zijn om werkbaar te zijn voor mechanische tests, kan een uitdagende taak zijn voor plaques die zwaar verkalkt zijn of verspreide verkalkingen bevatten. Een andere uitdagende taak in het protocol is het genereren van een optimaal spikkelpatroon voor digitale beeldcorrelatie. Optimale DIC vereist een zwart/witverhouding van 50:50²⁸ en spikkelt de grootte van drie tot vijf pixels²⁹ om de juiste kwaliteit te garanderen. Als u niet aan deze vereisten voldoet, kan dit leiden tot onnauwkeurige lokale spanningsmetingen. Ten slotte kan het in kaart brengen van de breuklocatie naar de SHG-beelden een uitdaging zijn als de natuurlijke oriëntatiepunten van een weefsel niet duidelijk zijn. Voor dergelijke monsters zal het aanbrengen van verschillende fiduciale markers op het weefsel vóór beeldvorming nuttig zijn.

De MPM-SHG-techniek die in het huidige protocol wordt gebruikt, is superieur aan veel andere collageenbeeldvormingstechnieken, omdat het een hoge resolutie en niet-destructieve techniek is met een relatief grote penetratiediepte. Toch vormt de penetratiediepte (<400 μm) van MPM-SHG een beperking, omdat het niet mogelijk is om de volledige dikte van de testmonsters, die varieerde tussen 0,5 en 2 mm, in beeld te brengen. In een recente studie met diffusie tensor magnetische resonantie beeldvorming (DT-MRI), hebben we aangetoond dat de overheersende vezeloriëntatie in de diepere delen van het plaqueweefsel kan verschillen van die in de meer oppervlakkige, luminale delen van het weefsel¹⁴. Daarom zijn verdere studies gerechtvaardigd om de lokale collageenarchitectuur in de diepere delen van dikke vezelige plaqueweefselmonsters en de relatie met de lokale weefselmechanica te onderzoeken. Hiervoor kan gebruik worden gemaakt van polarized spatial frequency domain imaging (pSFDI). Deze recent ontwikkelde optische beeldvormingstechniek zou het potentieel hebben om vezeloriëntatie tot 0,8 mm diep te meten in mitralisklepblaadjes¹². De pSFDI biedt ook een snelle acquisitie, die ook de visualisatie van het hele monstergebied zou kunnen vergemakkelijken in plaats van alleen een selectie van tegels, zoals het geval is in het huidige protocol. Een andere beperking van het huidige protocol is dat alleen oppervlaktevervorming kon worden geïdentificeerd. In toekomstige studies kan spiegelondersteunde multi-view DIC⁴⁰ of digitale volumecorrelatie (DVC)⁴¹ in dit protocol worden opgenomen om aanvullende informatie te verkrijgen over de volumetrische ondergrondse spanningen.

Het huidige experimentele protocol kan op verschillende manieren verder worden uitgebreid of gewijzigd om aanvullende informatie te verkrijgen over de mechanica van plaquebreuken en de relatie met de onderliggende microstructuur. Ten eerste omvat het huidige protocol uniaxiale trekproeven in de omtrekrichting. Dit type mechanische test werd gekozen omdat de plaque voornamelijk trekrek in de omtrekrichting in vivo ervaart. Voor een uitgebreidere mechanische karakterisering kan dit protocol verder worden uitgebreid met inflatietests, biaxiale tests of uniaxiale trekproeven in de lengterichting. Ten tweede richt het huidige protocol zich alleen op het verkrijgen van lokale stammen via DIC. Een vollediger beeld van het mechanische gedrag van de plaque kan echter worden verkregen door ook lokale spanningsanalyse in het protocol op te nemen, maar dit vereist karakterisering van lokale stijfheid. Hoewel dit momenteel een uitdaging is, kan dit worden bereikt door computationele technieken zoals de inverse eindige elementenmethode ^42,43 en de virtuele veldenmethode⁴⁴. Naast experimentele aanpassing kunnen ook enkele extra nabewerkingsstappen aan het huidige protocol worden toegevoegd. Ten eerste kan, in plaats van alleen de breuklocatie te identificeren, het scheurvoortplantingspad worden geïdentificeerd via de verkregen hogesnelheidscamerabeelden. Dit voortplantingspad kan worden gecorreleerd aan lokale structurele en mechanische parameters. Ten tweede werd de locatie van de breukinitiatie visueel geïdentificeerd in het beschreven protocol. Een eerdere studie over niet-biologische weefsels heeft discontinuïteiten in DIC-stammetingen gebruikt om breuk^{te detecteren 45}. Het toepassen van een dergelijke geautomatiseerde breukdetectie op plaqueweefsels kan mogelijk de nauwkeurigheid van de breukdetectie verbeteren. Ten slotte is een groot voordeel van MPM-SHG in vergelijking met andere collageenbeeldvormingstechnieken dat het individuele collageenvezels visualiseert. Daarom kunnen de gegevens die via dit protocol worden verkregen ook worden gebruikt om aanvullende lokale collageenkenmerken te onderzoeken, zoals het collageengehalte.

Dit protocol kan worden gebruikt om een beter begrip te geven van de lokale kenmerken van vezelig plaqueweefsel, de component die mechanisch faalt bij plaqueruptuur in vivo. Deze informatie is nodig om nieuwe structurele en functionele beeldvormingsmarkers vast te stellen die plaqueruptuur bij patiënten voorspellen. Deze nieuwe markers zijn nodig, omdat is aangetoond dat de eerder voorgestelde risicobiomarkers een suboptimale voorspellende waarde hebben voor toekomstige klinische gebeurtenissen ^5,6. In de toekomst kunnen LGO en ps-LGO mogelijk vezelig weefsel in het arteriële systeem identificeren en kwantificeren^46,47,48. Bovendien werd stam beschouwd als een surrogaatmarker voor lokale plaquesamenstelling⁴⁹. In vivo stammetingen⁴⁹ kunnen dus mogelijk helpen bij de identificatie van plaquestabiliteit bij patiënten. Men moet echter voorzichtig zijn met het direct vertalen van de verkregen resultaten naar in vivo plaqueruptuur. Ten eerste ervaart het vezelige plaqueweefsel in vivo een complexere belasting dan de unidirectionele trekbelasting die in dit protocol wordt gebruikt. Ten tweede zijn atherosclerotische plaques multicomponentstructuren; De in vivo spannings- en rekverdelingen in het vezelige plaqueweefsel kunnen worden beïnvloed door de aanwezigheid en locatie van de andere plaquecomponenten, zoals verkalkingen³⁷.

Deze mechano-imaging pijplijn kan ook worden gebruikt om andere collageenweefsels te bestuderen. Wereldwijde mechanische testen en structurele beeldvorming van collageen worden al op grote schaal gebruikt voor biologische weefsels. Lokale beoordeling van pre-faal- en faaleigenschappen, evenals collageenarchitectuur, is echter van cruciaal belang voor nauwkeurige mechanische karakterisering van heterogene vezelige weefsels. We verwachten dat de structuur van dit nieuwe protocol meer inzicht zal geven in het samenspel tussen de microstructuur en mechanica van verschillende biologische weefsels.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mm extension ring	Thorlabs Inc.	CML10
15 mL tube	VWR	525-0150
20x APO water immersion objective	Leica	507701
3D Slicer software	N/A	Version 4.11
50 mL tubes	VWR	525-0156
Airbrush pistol AB 430- nozzle diameter 0.3 mm	Conrad	4.01614E+12
Blackout, Nylon Fabric with Polyurethane Coating	Thorlabs
Black tissue dye	Polysciences inc	24113-2
Camera lens, focal length 50 mm	Thorlabs Inc.	MVL50M1
Camera stand	VWR	241-0093, 241-7311
Chameleon Ultra multiphoton laser	Coherent
Compressor + air hose	JUN-AIR, Conrad	B07GB9HC62, 4016138577198
Excel	Microsoft	Version 2208
Foam tape double-sided, 1.9 x 150 cm	Pattex
Heating bath	N/A		Custom made
High-speed camera + imaging software	Pixelink-Navitar Inc.	PL-D725
Human carotid atherosclerotic plaques (from carotid endarterectomy surgery)	N/A
Image J	National Institute of Health	N/A
LAS-AF	Leica	Version 2.3	Imaging software multiphoton microscope
LEICA TCS SP5 II	Leica		Microscope used for SHG imaging
Lighting system	AMZ instruments	LED-60TB	Used to obtain clear images with the high-speed camera
MATLAB	MathWorks	Version R2021A
MATLAB-based FibLab software	Eindhoven University of Technology	N/A
MATLAB-based FOA (Fibre Orientation Analysis) tool	Eindhoven University of Technology	N/A
MATLAB-based Ncorr software	Georgia Institute of Technology	Version 1.2
Needles	Emerald	BDAM302986
Petri dish (10 cm diameter)	VWR	BRND452000
Parafilm	VWR	291-1214
Pasteur Pipettes	VWR	ELKA127-P511-000
Quantum GX2 Micro computed tomography (μCT) scanner + X-ray filter of Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm	PerkinElmer	CLS149276
Ruler	Fine Science Tools	1800030
Sandpaper (P180)	Conrad	4.00932E+12
Side cutter	Conrad	4.25084E+12
Silicon elastomer base and curing agent (Sylgard 184)	VWR	634165S
Tensile tester + software + clamps	N/A		Made in-house using a cylindrical linear actuator (EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.), and a 10 N load cell (LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.)
Torque screwdriver	Garant, Hoffman group	659906