Methodenartikel

Aptamer-gebaseerde doeldetectie mogelijk gemaakt door een 3-traps G-Quadruplex isothermische exponentiële versterkingsreactie

DOI:

10.3791/64342

⸱

6 oktober 2022

 ,  , 
1Aptagen LLC

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol demonstreert het gebruik van een snelle, 3-traps, aptamer-gebaseerde exponentiële versterkingstest om doelen te detecteren. Monstervoorbereiding, signaalversterking en kleurontwikkeling worden behandeld om dit systeem te implementeren om de aanwezigheid van theofylline te herkennen boven die van cafeïne.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aptameren zijn doelherkenningsmoleculen die binden met een hoge affiniteit en specificiteit. Deze kenmerken kunnen worden gebruikt om andere moleculen met signaalgeneratievermogen te besturen. Voor het hierin beschreven systeem activeert doelherkenning via een aptamerisch domein, Stem II van een gemodificeerd hamerkopribozym, het zelfsplitsende ribozym door de aanvankelijk ongestructureerde constructie te stabiliseren. Het cis-splijtende RNA werkt op de kruising van Stem III en Stem I, waardoor twee splitsingsproducten ontstaan. Het langere splitsingsproduct primeert een isothermische exponentiële amplificatiereactie (EXPAR) van de twee vergelijkbaar katalytisch actieve G-quadruplexen. Die resulterende amplificatieproducten katalyseren peroxidasereductie, die is gekoppeld aan de reductie van een colorimetrisch substraat met een uitgang die het blote oog kan detecteren. Het 3-delige systeem dat in deze studie wordt beschreven, verbetert detectiemodaliteiten zoals enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA's) door een visueel detecteerbaar signaal te produceren voor het aangeven van de aanwezigheid van zo laag als 0,5 μM theofylline in slechts 15 minuten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aptameren zijn typisch enkelstrengs DNA of RNA geselecteerd door een evolutionair proces met een hoge bindingsaffiniteit en specificiteit aan de gewenste doelen1. Naast het bindingsvermogen kunnen aptameren worden gekoppeld aan en besturingsmotieven met signaaluitgangsfuncties2,3, waardoor het signaal wordt versterkt en de gevoeligheid van het systeem wordt verbeterd. Het G-quadruplex isothermische exponentiële versterkingsreactie (GQ-EXPAR) systeem is een driedelig systeem (figuur 1) dat een visueel signaal ontwikkelt als opeenvolgende componenten worden toegevoegd aan een enkel reactievat om een visuele outputte produceren 4. Dit systeem maakt de detectie van een specifiek doelwit, hierin theofylline, in een bepaald monster binnen 15 minuten mogelijk met behulp van een gestroomlijnde workflow om snelle, specifieke detectie van een interessant doelwit mogelijk te maken. Deze methode moet worden overwogen voor monsters waarbij een specifieke kwantificering van de doelconcentratie een lager belang heeft dan een hoge specificiteit van de respons in een korte tijd.

Een allosterische riboswitch, een structuurveranderend RNA-molecuul (ribozym) dat zelfsplitsing ondergaat, produceert het initiële signaal. Deze constructie is gebaseerd op het hamerhaairibozym, met een aptamerisch domein geïntroduceerd in Stem II als regulator van splitsingsactiviteit. De zelfsplitsingsfunctie wordt geactiveerd wanneer het aptamere domein wordt gestabiliseerd bij binding aan zijn doel5. Anders is de switch inactief in de oorspronkelijke staat.

De daaropvolgende exponentiële amplificatiereactie (EXPAR) gebruikt de afgifte van de zelfgesplitste RNA-streng uit de eerste fase om een isotherme amplificatiereactie te primen6. Het amplificatieproduct van EXPAR heeft peroxidase-activiteit7, die fungeert als basis voor de laatste fase van het systeem. Wanneer sommige substraten worden geoxideerd in combinatie met peroxideafbraak, produceren ze een fluorescerende output die kan worden gemeten op verschillende instrumenten. Andere veel voorkomende substraten kunnen worden vervangen om een gekleurd product te produceren voor visuele detectie. EXPAR en de peroxidase-activiteit van zijn amplificatieproducten fungeren als een 2-traps signaalversterker, waardoor de gevoeligheid tot grotere niveaus wordt verhoogd in vergelijking met conventionele strategieën 7,8.

De detectie van theofylline versus cafeïne wordt gebruikt als een voorbeeld van de specificiteit van dit detectieplatform, omdat ze slechts door een enkele methylgroep verschillen (figuur 2). Deze demonstratie van het systeem produceert een colorimetrische output voor visuele detectie van ten minste 500 nM theofylline.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zie aanvullende tabel 1 (de tabel met de reactieopstelling) voor de buisvoorbereiding, met inbegrip van de specifieke volumes en concentraties van de reactiecomponenten. Het hier gedemonstreerde protocol maakt gebruik van een voorgemonteerde detectieplatformkit zoals beschreven in de materiaaltabel. Alle onderdelen moeten op ijs worden bewaard, tenzij anders aangegeven.

1. Bereiding van ribozym

OPMERKING: De primaire detectiecomponent is een allosterisch (aptamer-gereguleerd) ribozym dat theofylline herkent (zie aanvullende tabel 2).

  1. Verzamel 5 U T4 polynucleotidekinase (0,5 μL, zie materiaaltabel) in een PCR-buis, die zal worden gebruikt om de ribozymsplitsingsproducten te activeren.
    OPMERKING: Deze component wordt eerst toegevoegd, zodat de gebruiker de juiste dosering van het enzym kan zien.
  2. Voeg 1 μL vooraf voorbereide 5x ribozymbuffer (zie materiaaltabel) toe aan elke monsterbuis (PCR-buis).
  3. Om de specificiteit visueel aan te tonen, voegt u 1,5 μl 2 mM theofylline (doel) of 2 mM cafeïne (controle) (zie materiaaltabel) toe aan elke monsterbuis als de testmonsters.
    OPMERKING: Voor het vaststellen van een standaardcurve wordt aanbevolen om te beginnen bij 3,125 mM analyt en vijfvoudige verdunningen te testen tot 0,001 mM.
  4. Meng elke monsterbuis grondig door 5-10 keer te pipetteren.
  5. Voeg 2 μL 600 nM RNA met een aptamerisch domein specifiek voor het doelwit (zie tabel met materialen) toe aan elke monsterbuis om een eindconcentratie van 240 nM in 5 μL testoplossing te maken, meng vervolgens snel door pipetteren en plaats op een koud blok om het achtergrondsignaal te minimaliseren.
    OPMERKING: het is belangrijk om in eerste instantie alle reacties zonder ribozym voor te bereiden, omdat de zelfsplitsingsreactie onmiddellijk zal beginnen wanneer ribozym wordt gecombineerd met ribozymbuffer en een significante achtergrond kan produceren.
  6. Zodra alle reactiebuizen zijn voorbereid, incubeer u elk monster (5 μL) bij kamertemperatuur (23 °C) gedurende precies 3 minuten met behulp van een timer. Breng de monsterbuizen na incubatie onmiddellijk terug naar ijs (4 °C).

2. GQ-EXPAR

  1. Voeg 3,5 μL nickase-polymerase-enzymmengsel (zie materiaaltabel) toe aan elke monsterbuis en meng goed.
    OPMERKING: De vereiste enzymconcentraties zijn afhankelijk van de herkenningssequenties, soorten enzymen en reactietemperaturen, waarvan de combinatie empirisch is bepaald.
  2. Voeg 31,5 μl expar reactiemengsel met sjabloon, nucleotiden en reactiebuffer (zie materiaaltabel) toe aan elke monsterbuis en pipet om te mengen.
    OPMERKING: De componentconcentraties zijn geoptimaliseerd op basis van de enzymen en sequenties van de polymeraseproducten.
  3. Zodra alle monsters zijn bereid, incubeert u elk bereid monster (40 μL) bij 55 °C gedurende precies 5 minuten met behulp van een timer. Incubeer indien mogelijk op een thermocycler, hoewel een verwarmd deksel niet nodig is.
  4. Breng de monsterbuizen na de incubatiestap onmiddellijk terug naar ijs (4 °C).

3. Kleurontwikkeling

  1. Voeg 2 μL Hemin-oplossing (25 uM, zie materiaaltabel) toe aan elke monsterbuis en meng goed.
  2. Voeg 58 μL van de in de handel verkrijgbare TMB-oplossing (zie materiaaltabel) toe aan elke monsterbuis en meng goed.
  3. Incubeer de kleurontwikkelingsreactie (100 μL) bij kamertemperatuur gedurende ten minste 3 minuten en maximaal 30 minuten.
    OPMERKING: (Optioneel) Kleurontwikkeling kan worden gestopt door 20 μL 2 M zwavelzuur toe te voegen.
  4. Lees de monsters kwalitatief met het oog of kwantificeer de resultaten met behulp van een absorptieplaatlezer bij 450 nm als de kleurontwikkelingsreacties worden gestopt met zwavelzuur.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het detectieplatform in figuur 1 zet aptamere doelherkenning in korte tijd om in visueel onderscheiden verschillen tussen de monsterpreparaten (doel versus niet-doel, figuur 2). Een allosterisch ribozym geïdentificeerd door Soukup et al.5 diende als uitgangspunt voor het creëren van een minder luidruchtige sequentie met respons op het doelwit over de controle en negatieve monsters. De geoptimaliseerde constructie was in staat om slechts 5...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier gepresenteerde methode maakt gebruik van de overgang tussen een aanvankelijk ongeordende secundaire structuur in een allosterisch ribozym en de extra stabiliteit die wordt verleend door de binding van het doelwit aan het aptamere domein om het cis-splitsende hamerhaairibozym te activeren. De stabiliteit van het ribozym werd aangepast om katalytische activiteit te minimaliseren in afwezigheid van het doelwit, terwijl doelbinding de actieve structuur kon herstellen. Bovendien moet ervoor worden gezorgd dat de buffe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aptagen, LLC produceert en verkoopt een GQ-EXPAR demonstratiekit voor diegenen die directe ervaring willen met een op aptamer gebaseerd detectiesysteem.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door de Research and Development Funding van Aptagen LLC.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3,3'5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"PerkinElmerFOOD-1806-1000Kleurontwikkelingsreagens. Minimaliseer blootstelling aan licht en atmosfeer. Voorheen BIOO Scientific catalogusnummer 1806.
Geleverd in Apta-beacon Demonstration Kit als Buis 3-2.
5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’Integrated DNA Technologies (IDT)CustomGeoptimaliseerde QtQ47 DNA sjabloon voor EXPAR om G-quadruplex te produceren, geprimed door G-quadruplex. Dit wordt gebruikt voor het "exponentiële" deel van EXPAR, om de hoeveelheid DNAzyme die wordt gebruikt voor Stap 3 kleurontwikkeling snel te verhogen. Sjabloon bevat een 3’-biotine om onbedoelde extensie door Bst 2.0 DNA polymerase tijdens EXPAR te voorkomen.
Onderdeel van Apta-beacon Demonstration Kit Buis 2-2.
5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’Integrated DNA Technologies (IDT)CustomTheofylline-herkennende allosterische ribozymsequentie (zelf-splitsende ribozym gereguleerd door RNA aptamer domein voor theofylline) gemodificeerd van Soukup et al.
Soukup, G. A., Emilsson, G. A., en Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632.
Geleverd in Apta-beacon Demonstration Kit als Buis 1-3.
5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’Integrated DNA Technologies (IDT)CustomGeoptimaliseerde P3tQ49 DNA sjabloon voor EXPAR om G-quadruplex te produceren, geprimed door P3 splitsingsproduct. Dit wordt gebruikt in Stap 2 om het splitsingsproduct te vertalen in DNAzyme dat wordt gebruikt voor Stap 3 kleurontwikkeling. Sjabloon bevat een 3’-biotine om onbedoelde extensie door Bst 2.0 DNA polymerase tijdens EXPAR te voorkomen.
Onderdeel van Apta-beacon Demonstration Kit Buis 2-2.
5x Ribozyme BufferAptagen, LLCN/A5x samenstelling: 600 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Gebruikt in Stap 1.
Geleverd in Apta-beacon Demonstration Kit als Buis 1-4.
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration KitAptagen, LLCGQ-EXPAR-TMBHet demokit toont de specificiteit van de colorimetrische analyse door moeilijke kleine moleculaire doelen, theofylline versus cafeïne, die alleen verschillen door een enkele methylgroep te detecteren.
Bst 2.0 DNA polymeraseNew England BiolabsM0537SIsothermische amplificatiepolymerase met strengverplaatsingsactiviteit. Onderdeel van de Nickase-Polymerase Mix, bereid op 9,375 U/uL.
Onderdeel van Apta-beacon Demonstration Kit Buis 2-1.
Buffer 3.1New England BiolabsB6003SVIALGecombineerd met 2 uL van 10X Isothermal Amplification Buffer en 27,5 uL van nuclease-vrij water om 1,11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix te produceren. Dit product vervangt het eerder gebruikte B7203SVIAL dat deel uitmaakte van de initiële systeemontwikkeling (dezelfde samenstelling behalve niet-recombinant BSA).
Onderdeel van Apta-beacon Demonstration Kit Buis 2-2.
CafeïneSigma-AldrichC0750-100GAptamer tegendoel (controle), bereid met nuclease-vrij water.
Geleverd in Apta-beacon Demonstration Kit als Buis 1-1.
dNTPsNew England BiolabsN0447SOnderdeel van de EXPAR reactiemix.
Onderdeel van Apta-beacon Demonstration Kit Buis 2-2.
EXPAR reactiemixAptagen, LLCN/A0,44 mM dNTPs, 0,38 μM P3tQ49, 0,38 μM QtQ47, 44,44 mM Tris-HCl (pH 8,4), 63,5 mM NaCl, 31,5 mM KCl, 6,35 mM MgCl2, 1,27 mM MgSO4, 6,35 mM (NH4)2SO4, 63,5 μg/ml BSA, 0,0635% Tween 20.
Onderdeel van Apta-beacon Demonstration Kit Buis 2-2.
HeminSigma-AldrichH9039Opnieuw opgehangen in DMF tot een eindconcentratie van 25 μM.
Geleverd in Apta-beacon Demonstration Kit als Buis 3-1.
Isothermal Amplification BufferNew England BiolabsB0537SVIALGecombineerd met 2 uL van 10x Buffer 3.1 en 27,5 μL van nuclease-vrij water om 1,11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix te produceren.
Onderdeel van Apta-beacon Demonstration Kit Buis 2-2.
MgCl2Amresco (VWR)E525-500MLHammerhead ribozym cofactor, noodzakelijk voor zelfsplitsing.
Onderdeel van Apta-beacon Demonstration Kit Buis 1-3.
MJ PTC-100 ThermocyclerMJ Research, Inc.PTC-100Thermocycler om incubatietemperaturen te regelen. Elke thermocycler of hot block kan worden gebruikt.
N, N-Dimethylformamide (DMF)Sigma-Aldrich227056-100MLGebruikt om hemin op te schorsen en de houdbaarheid in de vriezer te maximaliseren.
Onderdeel van Apta-beacon Demonstration Kit Buis 3-1.
Nickase-polymerase MixAptagen, LLCN/ANt.BstNBI (9,375 eenheden/'L) en Bst 2.0 DNA polymerase (0,5 eenheden/'L).
Geleverd in Apta-beacon Demonstration

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  2. Tang, J., Breaker, R. R. Rational design of allosteric ribozymes. Chemical Biology. 4 (6), 453-459 (1997).
  3. Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
  4. Liao, A. M., et al. A simple colorimetric system for detecting target antigens by a three-stage signal transformation-amplification strategy. Biochemistry. 57 (34), 5117-5126 (2018).
  5. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., Breaker, R. R. Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection. Journal of Molecular Biology. 298 (4), 623-632 (2000).
  6. Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
  7. Cheng, X., Liu, X., Bing, T., Cao, Z., Shangguan, D. General peroxidase activity of G-quadruplex-hemin complexes and its application in ligand screening. Biochemistry. 48 (33), 7817-7823 (2009).
  8. Nie, J., et al. Reporter-triggered isothermal exponential amplification strategy in ultrasensitive homogeneous label-free electrochemical nucleic acid biosensing. Chemical Communications. 50 (47), 6211-6213 (2014).
  9. Tabuchi, T., Yokobayashi, Y. Cell-free riboswitches. RSC Chemical Biology. 2 (5), 1430-1440 (2021).
  10. Ao, Y., et al. Integration of an expression platform in the SELEX cycle to select DNA aptamer binding to a disease biomarker. ACS Omega. 7 (12), 10804-10811 (2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Aptameer doeldetectieG quadruplex amplificatieribozym splitsingcolorimetrische detectieperoxidase activiteittheofyllinedetectieabsorptieplaatlezerRNA aptameerstandaard kalibratiecurve

Gerelateerde artikelen