Methodenartikel

Een fluorescerende intravitale beeldvormingsbenadering om door belasting geïnduceerde calciumsignaleringsdynamiek in osteocyten van muizen te bestuderen

DOI:

10.3791/64366

⸱

24 februari 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University, 2Sibley School of Mechanical and Aerospace Engineering, Cornell University, 3Department of Biomedical Engineering, The City College of New York, 4Department of Neuroscience, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Orthopaedic Surgery, Albert Einstein College of Medicine, 6Department of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige artikel beschrijft het uitvoeren van een intravitale beeldvormingsbenadering om mechanisch geïnduceerde calciumsignalering van ingebedde osteocyten in vivo in realtime te observeren als reactie op mechanische belasting op weefselniveau van het derde middenvoetsbeentje van de muis.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Botweefsel is buitengewoon gevoelig voor verschillen in mechanische belastingsomvang. Osteocyten, dendritische cellen die een syncytium door het bot vormen, zijn verantwoordelijk voor de mechanosensorische functie van botweefsel. Studies die gebruik maken van histologie, wiskundige modellering, celcultuur en ex vivo botorgaanculturen hebben het begrip van osteocyt-mechanobiologie aanzienlijk verbeterd. De fundamentele vraag hoe osteocyten reageren op mechanische informatie op moleculair niveau in vivo en deze coderen, is echter niet goed begrepen. Intracellulaire calciumconcentratiefluctuaties in osteocyten bieden een nuttig doelwit om meer te weten te komen over acute botmechanotransductiemechanismen. Hier rapporteren we een methode voor het bestuderen van osteocytenmechanobiologie in vivo, waarbij een muizenstam wordt gecombineerd met een fluorescerend genetisch gecodeerde calciumindicator uitgedrukt in osteocyten met een in vivo laad- en beeldvormingssysteem om osteocytencalciumspiegels tijdens het laden direct te detecteren. Dit wordt bereikt met een driepunts buigapparaat dat goed gedefinieerde mechanische belastingen kan leveren aan het derde middenvoetsbeentje van levende muizen, terwijl tegelijkertijd fluorescerend aangegeven calciumresponsen van osteocyten worden bewaakt met behulp van twee-fotonmicroscopie. Deze techniek maakt directe in vivo observatie mogelijk van osteocyten calciumsignaleringsgebeurtenissen als reactie op volledige botbelasting en is nuttig bij het streven om mechanismen in osteocytenmechanobiologie te onthullen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De botmatrix is georganiseerd op basis van mechanische vraag 1,2 en kan dynamisch veranderen om rekening te houden met verschuivende mechanische vereisten 3,4,5. Baanbrekend werk met betrekking tot het mechanosensorische mechanisme in bot werd ongeveer 30 jaar geleden gepubliceerd als een modelleringspaper 6,7,8, waarin werd voorgesteld dat osteocyten ingebed in het botzintuig weefsel, mechanische vervorming op peil brengen via vloeistofbeweging in hun lokale omgeving. Dit model werd experimenteel gevalideerd met in vitro en ex vivo experimenten, waarbij duidelijk werd aangetoond dat osteocyten vrij mechanosensitief zijn 1,2,3,4,5,6 en ook cytokinen tot expressie brengen, die het gedrag van botopbouwende osteoblasten7 en osteoclasten sturen 8,9,10, 11,12.

Calciumsignalering is een alomtegenwoordige tweede boodschapper die is vastgesteld als een centrale figuur en een betrouwbaar experimenteel doelwit in de mechanobiologie van osteocyten 13,14,15,16. Calciumsignalering heeft het voordeel dat het op grote schaal wordt bestudeerd in de celbiologie17, wat betekent dat er veel bekend is over de stroomafwaartse effecten en de bijbehorende fluorescerende instrumenten die beschikbaar zijn voor experimentele observatie. In vitro analyses hebben calciumsignalering gebruikt als middel om de mechanische activering van osteocyten te identificeren en dynamisch signaleringsgedrag te karakteriseren 5,18,19. Merk op dat observatie van calciumsignalering in een osteocytcellijn definitief bewijs leverde dat vloeistofactivering bij de integrine-aanhechtingen langs het celproces waarschijnlijk de belangrijkste vorm van vloeistofstroomactivering is20. Deze studie is een van de vele die het nut van calciumsignalering aantonen. Het wordt op betrouwbare wijze geïnduceerd met de mechanische activering van osteocyten en dient dus als een krachtig doelwit voor het ondervragen van osteocytenmechanobiologie.

Osteocyt mechanotransductie in vivo is sterk afhankelijk van hun directe micro-omgeving. Matrixbindende eiwitten (bijv. proteoglycanen, integrinen) zorgen voor functionele aanhechtingen tussen osteocytcelmembranen in een opstelling die cruciaal is voor vloeistofactivering van de cel 21,22. Hoewel tweedimensionale (2D) in-vitroanalyses nuttig zijn, zijn ze beperkt omdat ze deze kritieke driedimensionale (3D) kenmerken niet bevatten. Ex vivo preparaten van osteocytencalciumsignalering met behulp van confocale microscopie hebben enig licht geworpen op hoe osteocyten reageren terwijl de omringende matrix intact blijft13,16. Er wordt echter gedacht dat het verwijderen van de bloedtoevoer uit het bot de voedingsstoffen en vloeistofdynamiek van het lacunocanaliculaire systeem verandert. Ondervraging van osteocytenmechanobiologie vereist in vivo onderzoek naar door belasting geïnduceerde osteocytensignalering.

In vivo onderzoek van ingebedde cellen in bot werd grotendeels gehinderd door de beperkingen van traditionele beeldvormingstechnieken, zoals helderveld- en confocale microscopie. Osteocyten zijn gepositioneerd in een gemineraliseerde matrix23 die is samengesteld uit hydroxyapatiet, collageen type 1 en andere niet-collageenhoudende eiwitten die de optische toegankelijkheid beperken24 en het in vivo onderzoek technisch uitdagend maken. Recente ontwikkelingen op het gebied van niet-lineaire fluorescerende beeldvorming en genetisch gecodeerde calciumreporters bieden echter de mogelijkheid om deze uitdagingen te overwinnen.

Hier rapporteren we een nieuwe benadering met de mogelijkheid om osteocyten in vivo in beeld te brengen om calciumsignalering te meten met een resolutie op cellulair niveau25. Dit wordt bereikt door voor het eerst een dynamische fluorescerende marker te gebruiken met behulp van een genetisch gecodeerde calciumindicator in osteocyten van muizen. Muizen met DMP1-Cre-gestuurde osteocyt-gerichte expressie van GCaMP6f vertonen zichtbare fluorescentie in osteocyten in de diafysaire cortex van muizen middenvoetsbeentjes17,26. We gebruiken een driepuntsbuigsysteem om fysiologische niveaus van rekgrootte tussen 250-2.000 με27 toe te passen. Deze techniek maakt in vivo visualisatie mogelijk van de dynamiek van de calciumsignalering van osteocyten tijdens mechanische belasting van het hele bot en kan nuttig zijn voor iedereen die de mechanobiologie van osteocyten wil begrijpen. Deze methode zou geschikt zijn voor onderzoekers die hun werk willen uitbreiden van in-vitro-analyses naar in vivo-toepassingen, vooral met behoud van functionele moleculaire analyses (d.w.z. het onderzoeken van cellulaire activiteit via calciumsignalering) in tegenstelling tot brede fenotyperingsstudies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Cornell University.

1. Voorbereiding van materialen en apparatuur

  1. Ontwerp en bouw het middenvoetsbeentje voor gebruik met een multifotonmicroscoop boven het hoofd.
    OPMERKING: Details voor componentspecificaties en de werking van het apparaat worden beschreven in de aanvullende documentatie van een eerdere studie25. In het kort bestaan de belangrijkste componenten uit een actuator in serie met een loadcel en laadbeugel, een waterbad en een draaipuntpen. De actuator en loadcel zijn in de handel verkrijgbaar en moeten geschikt zijn voor belastingen tot 300 g. Het waterbad, de draaipuntpen en de lastbeugel moeten gemaakt zijn van titanium of roestvrij staal. Ze kunnen in eigen huis of commercieel worden vervaardigd via 3D-metaalprinten.
  2. Kalibreer de waarden van de rekgrootte vooraf op de verplaatsing van de actuator voor individuele muisgroepen (d.w.z. geslacht, behandeling, genotype). Dit wordt gedaan met behulp van het in kaart brengen van de oppervlaktespanning in een procedure die in een eerdere studie is beschreven25.
  3. Gebruik muizen met een C57BL/6-achtergrond, in de leeftijd van 16-18 weken, die fluorescerende calciumindicatorconstructies in de osteocyten tot expressie brengen. Osteocytgerichte expressie wordt bereikt door flox-geactiveerde GCaMP6f- en Dmp1-Cre-muizen te kruisen. De details van fokstrategieën en verkopers voor stichtende muizen worden beschreven in een eerder gepubliceerde studie25.
  4. Steriliseer alle chirurgische instrumenten, de lastbeugel, het waterbad en de draaipuntpen met behulp van een autoclaaf (57,2 °C, 15 psi, 3-4 min). Desinfecteer microscoopobjectieven met 100% ethanol.
  5. Schakel elektronische componenten in, waaronder laserbron, microscoop, loadcel en actuator. Wacht 15-20 minuten om elk onderdeel op te warmen voorafgaand aan de intravitale beeldvorming.
    1. Zorg ervoor dat de actuator en de loadcelcomponenten zijn aangesloten en geactiveerd in het besturingsapparaat. Genereer de besturingssoftware met verschillende platforms, waaronder Matlab, LabView en Python, volgens de voorkeuren van de gebruiker. De belangrijkste Matlab-code die in dit onderzoek wordt gebruikt, wordt Actuator_Control_Software_withLoadCell.m genoemd (in de MT3 Loading Device Control Software.zip map Aanvullend bestand 1).
      OPMERKING: De meeste in de handel verkrijgbare twee-foton microscoopsystemen worden geleverd met robuuste beeldvormingssoftware. De belangrijkste kenmerken die voor deze methode nodig zijn, zijn de mogelijkheid om een laser af te stemmen op de juiste excitatie voor GCaMP6f (920 nm), de mogelijkheid om de intensiteit van het laservermogen aan te passen en een tijdreeksverzameling met een frequentie van ten minste 6 Hz. Voorafgaand aan het experimenteren moet de laserverbinding met de beeldvormingssoftware en de juiste lichtpadopstelling voor beeldvorming met twee fotonen worden bevestigd. Dit wordt op verschillende manieren bevestigd, afhankelijk van de beeldvormingsopstelling. Meestal is er een lichtindicator.

2. Operatie

  1. Bereid een chirurgische fase voor en steriliseer het oppervlak met 70% ethanol. Zorg ervoor dat aseptische technieken worden toegepast tijdens de chirurgische ingrepen. Handhaaf het niveau van reinheid dat vereist is voor dit protocol, aangezien het een terminale procedure is.
  2. Verdoof de muis met verdampt isofluraan gemengd met lucht of zuurstof van medische kwaliteit met een debiet van 1 l/min. Voer de eerste verdoving uit in een inductiekamer voor knaagdieren met 3%-5% isofluraan. Handhaaf de anesthesie op 1%-2,5% isofluraan in een neuskegel voor chirurgische en intravitale beeldvormingsprocedures.
  3. Plaats een verwarmingsapparaat onder of naast de muis om te helpen bij het handhaven van de homeostatische kerntemperatuur van het lichaam. Bewaak de lichaamstemperatuur, hartslag en zuurstofverzadiging van de muis tijdens de operatie. Houd de ademhalingsfrequentie tussen 60-80 ademhalingen per minuut en houd deze op peil door de dosering isofluraan aan te passen.
  4. Plaats de muis in rugligging. Bevestig de diepte van de anesthesie vóór de incisie via een teenknijp. Identificeer de locatie tussen het tweede en derde middenvoetsbeentje. Maak een scalpelincisie door de dermis tussen het tweede en derde middenvoetsbeentje, beginnend bij het distale uiteinde en proximaal langs de lengte van de botten (~5 mm).
    OPMERKING: De middenvoetsbeentjes zijn distaal van de enkelbeenderen op de poot en volgen direct proximaal van de distale vingerkootjes. Ze bestaan uit (mediale tot laterale) middenvoetsbeentjes I, II, III, IV en V. Het derde middenvoetsbeentje is gecentreerd in het midden van het volaire aspect van de achterpoot.
  5. Open met een tang de operatieplaats door de huid naar de mediale/laterale randen te trekken. Snijd de strekpezen opnieuw met een rechte Vannas-schaar om het derde middenvoetsbeentje bloot te leggen.
  6. Steek de middelste draaipuntpen van het middenvoetsbeentje onder het derde middenvoetsbeentje.
    1. Steek eerst de pin in de kleine ruimte aan het distale uiteinde waar het derde middenvoetsbeentje het proximale kootje ontmoet en verplaats de pin vervolgens proximaal totdat deze op de middenschacht van het derde middenvoetsbeentje rust.
    2. Wees extra voorzichtig om een directe interface tussen het bot en de pin te garanderen, met uitzondering van spieren en gezichten. Dit is van cruciaal belang voor stabiele beeldvorming tijdens laadprotocollen.
  7. Houd de enkel vast met een tang en plaats de voet in het met fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) gevulde waterbad van de Dulbecco (8-10 ml). Zet de poot op zijn plaats met de laadbeugel en sluit de beugel aan op de actuator/loadcel-opstelling. Een voltooide chirurgische voorbereiding en opstelling in het apparaat wordt weergegeven in figuur 1.

3. Beeldvorming

OPMERKING: De volledige opstelling voor twee-fotonmicroscopie die in dit protocol wordt gebruikt, heeft twee softwarepakketten: Chameleon Discovery GUI V2.0.6 voor de laser (Afbeelding 2) en ThorImageLS4.0 voor de microscoop (Afbeelding 3). Om een beeld te maken op het twee-foton, drukt u op Live (Figuur 3, blauwe afspeelknop). Wanneer u een experiment uitvoert om gegevens in beeld te brengen en op te slaan, drukt u op Capture (Afbeelding 3, het tabblad bovenaan, naast Capture Setup). Deze zijn specifiek voor de apparatuur en de leveranciers die in dit experiment worden gebruikt, maar veel alternatieven met de noodzakelijke specificaties die in dit protocol worden gevonden (excitatiegolflengten, zichtbare venstergrootte, beeldopnamesnelheid, enz.) zouden ook werken.

  1. Pak heel voorzichtig de opstelling van het laadapparaat op met de muis en plaats deze op het microscoopplatform.
  2. Begin met een objectief met een lage vergroting in de epifluorescentiemodus (Figuur 3, vervolgkeuzemenu bovenaan met selecties Multifoton of Fluorescentie-instelling) om de middendiafyse van het bot te lokaliseren en te centreren.
  3. Nadat een interessegebied is gevonden, schakelt u over naar een hogere vergroting van het wateronderdompelingsobjectief (20x-40x) en schakelt u de optiek over naar twee-foton (Figuur 3, vervolgkeuzemenu bovenaan met selecties Multifoton of Fluorescentie-instelling).
    OPMERKING: De aanbevolen beeldhoekgrootte is ten minste 250 μm x 250 μm voor cellulaire activiteit en kan worden bereikt met optische of digitale zoom, afhankelijk van het beeldvormingssysteem.
    1. De geschikte minimale pixeldichtheid is 512 pixels x 512 pixels. Gebruik de instellingen voor Galvo/Resonance Area Control om de pixeldichtheid in te stellen (Afbeelding 3).
    2. Vermijd bij het vinden van de ROI fotobleken door het vermogen te verminderen met behulp van de Power Control-optie (Afbeelding 3) en de PMT-versterking te verhogen in de instellingen van de Galvo/Resonance Scanner Control (Afbeelding 3).
    3. Identificeer het oppervlak van het bot in twee-fotonmodus door te zoeken naar de fibreuze periosteum autofluorescentie in het groene kanaal dat een banddoorlaatfilter gebruikt dat gecentreerd is op 525 nm.
      OPMERKING: De autofluorescentie is het meest zichtbaar met de excitatiegolflengte bij 1.000 nm, maar is ook beschikbaar bij 920 nm excitatie (Figuur 3, Multiphoton Laser Control). Deze mijlpaal is belangrijk voor het bepalen van de relatieve diepte van de ROI in de metatarsale cortex bij het observeren van osteocyten. Opgemerkt moet worden dat tijdens experimenten met tijdreeksen de exacte diepte van het afgebeelde vlak niet wordt geregistreerd, hoewel deze meestal tussen 15-30 μm ligt. Als exacte dieptemetingen gewenst zijn, dan zou er een z-stack moeten worden genomen.
  4. Voer een testlaadwedstrijd uit om er zeker van te zijn dat de chirurgische voorbereiding en positionering in het laadapparaat effectief waren bij het bereiken van een stabiel ROI-veld (d.w.z. geen verplaatsing van het z-vlak). Voer kort een laadcyclus uit om de stabiliteit van het chirurgische preparaat te beoordelen. Voer het laden uit door de sectie Servo inschakelen en Verplaatsen uit te voeren in de Matlab-code.
    1. Breng een kleine tarrabelasting aan. Zorg ervoor dat de juiste protocollen voor het laden van haversinusgolven van tevoren worden voorbereid. Voer de juiste belastingsparameters in die tijdens de kalibratie zijn verkregen in paragraaf 1.2. Voer het laden uit door de sectie Servo inschakelen en Verplaatsen uit te voeren in de Matlab-code.
    2. Als er een zichtbare beweging van de cellen op het scherm is, die het gevolg is van microbeweging van het bot als reactie op belasting of ademhaling, selecteer dan een andere ROI in de y- of z-richting om ervoor te zorgen dat deze zich direct boven de middelste draaipuntpen bevindt. Als de beweging aanhoudt, past u de chirurgische positie van de pin handmatig aan onder het derde middenvoetsbeentje.
      OPMERKING: Een goed interessegebied (ROI) is er een waar de cellen niet in en uit het vlak/focus bewegen. Beweging in de x- en y-richtingen kan worden aangepast voor nabewerking met behulp van de plug-in voor sjabloonmatching op ImageJ.
  5. Voer z-stack- of t-serie-beeldvorming uit met belasting volgens het experimentele ontwerp om respectievelijk morfometrische of dynamische door belasting geïnduceerde signaleringsgebeurtenissen vast te leggen.
    1. Stel de excitatiegolflengte voor de fluorescerende indicator in (bijv. 920 nm voor GCaMP6f). Gebruik voor z-stack een resolutie die laag genoeg is om kenmerken van de osteocyten vast te leggen, zoals stappen van 0,25-1 μm. Gebruik voor de t-serie instellingen om ten minste 6x de laadsnelheid te samplen. Voor een laadsnelheid van 1 Hz vertegenwoordigt beeldvorming met 6 frames per seconde (FPS) de minimaal geschikte opnamesnelheid (Afbeelding 3, Galvo/Resonance Scanner Control).
    2. Verzamel voor laden en live beeldvorming niet-geladen basislijngegevens bij elke aanval. In deze studie heeft 60 s niet-belaste beeldvorming gevolgd door 60 s belasting en beeldvorming de voorkeur. Ontwerp de laad- en beeldvormingsprotocollen dienovereenkomstig. Als u gegevens wilt verzamelen, drukt u op Capture (Afbeelding 3, tabblad bovenaan, naast Capture Setup).
      1. De refractaire periode voor een volledige calciumsignaleringsrespons in botcellen wordt geschat op ongeveer 15 minutenen 28. Wacht minstens zo lang tussen opeenvolgende laadperiodes bij het verzamelen van dynamische signaleringsgegevens.
      2. Laat het dier tijdens het hele experiment niet onbeheerd achter om ervoor te zorgen dat het niet onverwachts wakker wordt uit de anesthesie of angst ervaart zonder de mogelijkheid om in te grijpen.
        OPMERKING: Euthanasie aan het einde van de procedure moet worden uitgevoerd via cervicale dislocatie of andere passende maatregelen in overeenstemming met door de IACUC goedgekeurde methoden. Dit is een niet-overlevingsprotocol, wat betekent dat alle dieren na beeldvorming worden geëuthanaseerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier rapporteren we een methodologie voor het bestuderen van calciumsignalering in ingebedde osteocyten in vivo met behulp van acute chirurgische voorbereiding en multifoton fluorescerende beeldvorming. Groen fluorescerend signaal kan worden waargenomen aan de hand van genetisch gecodeerde calciumindicatoren in osteocyten via DMP1-Cre-expressie. Figuur 4 is een single-plane beeld van ingebedde osteocyten. Merk op dat alle cellen zijn gelabe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het is moeilijk om osteocyten experimenteel te bestuderen vanwege hun ingebedde positie in de matrix van hard weefsel, waarnaar ze snel verslechteren of dedifferentiëren bij verwijdering van deze niche. Het onderzoek naar osteocyten heeft de afgelopen 3 decennia een enorme vindingrijkheid gevergd, zoals het creëren van osteocytachtige lijnen 29,30,31, het opstellen van protocollen om primaire osteocyten te isoleren

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
#3 Handle scalpelElectron Microscopy Sciences72040-03Chirurgische benodigdheden
20x Water immersion objectiveOlympusXLUMPLFLN20XWDit is een 20x objectief, maar 40x kan ook worden gebruikt voor dit protocol. We raden waterimmersies aan omdat ze tijdens het beeldvormen in het bad moeten worden gedompeld, dus open-air objectieven kunnen aberraties veroorzaken
A.M. Bickford Omnicon F/AIRAM Bickford80120Een verstandig antwoord op anesthesiegasproblemen in de operatiekamer, de F/AIR-anesthesiegasfilter is specifiek ontworpen om afval-anesthesiegassen zoals Isoflurane, Halothane, Enflurane, etc. uit de operatieomgeving te verwijderen.
A.M. Bickford Omnicon F/AIR Kit AM Bickford80000Een compleet kit met buis en adapters om F/AIR aan te sluaten
B6J.Cg-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze/MwarJThe Jackson Laboratory28865GCaMP6f muizen voor kruisbestuiving met Dmp1-Cre muizen
B6N.FVB-Tg(Dmp1-cre)1Jqfe/BwdJThe Jackson Laboratory23047Dmp1-Cre muizen voor kruisbestuiving met GCaMP6f  muizen
Compression load cellFUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.905898LCM100, 1000 g, Sub-miniatuur spanning & compressie belastingscel (Miniatuur/Inline Geschroefd), RoHS loodvrij, Materiaal - 17-4 PH S.S., M3x0.5-draad, 34 Awg 4 geleider gevlochten polyester kabel, 5 ft Lang
Corning 500 mL DPBS (Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing), 1x [+] calcium, magnesiumVWR International21-030-CVIonisch gebalanceerd bad dat calcium bevat, dompelt de metatarsus onder tijdens het beeldvormen
Dental pick toolElectron Microscopy SciencesChirurgische benodigdheden
Ethyl alcohol pure 200 proof ACS reagens >99.5%Sigma AldrichSIAL-459844-500MLSterilisatiedoeleinden
Fulcrum pinFathomN/AVervaardigd door direct 3D laser sinteren van roestvrij staal (PH1 legering) van 3D SolidWorks STL-bestanden. Originele leverancier was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, nu overgenomen door FATHOM, specificaties worden gegeven in het eerder gepubliceerde document
High resolution and speed USB220 output kitFUTEK Advanced Sensor Technology, Inc.717435Wordt gebruikt om de belastingscel op de laptop aan te sluiten
ImageJ 1.53t met Java 1.8.0_172 (voor Windows 64-bit)NIHN/AInstalleer hier https://imagej.nih.gov/ij/
IsofluranePiramal Critical Care66794-013-25100% inhalatie damp vloeistof
Loading bracketFathomN/AVervaardigd door direct 3D laser sinteren van roestvrij staal (PH1 legering) van 3D SolidWorks STL-bestanden. Originele leverancier was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, nu overgenomen door FATHOM, specificaties worden gegeven in het eerder gepubliceerde document
MATLAB R2019aMathWorksVoor het gebruik van het laadapparaat
Matrx VIP 3000 vaporizer well fill isofluraneButler Schein Animal Health14309Verdamper voor anesthesie
Nonin pulse oximeter Model 2500A Vet2500A Vet
Piezo servo controllerPI-USAE-625Elektronisch onderdeel aanbevolen door het bedrijf om te worden gebruikt met de actuator
PiezoMove high-stijfheid lineaire piezo actuatorPI-USAP-602.5SLActuator voor het laadapparaat
Scalpel blades, No. 10 voor handle No. 3, pak van 100Electron Microscopy Sciences72044-10Chirurgische benodigdheden
Roestvrijstalen pincet met scherpe, fijne uiteinden. Lengte: 120 mmElectron Microscopy Sciences78326-42Chirurgische benodigdheden
Thorlabs Bergamo multifotonmicroscoopThorLabsN/ADit is alleen het beeldvormingssysteem en heeft de laser niet inbegrepen, hoewel ThorLabs laseropties heeft indien gewenst
Titanium-Saphire Chameleon Discovery NX met Total Power Control (TPC)CoherentN/ADit systeem heeft technisch gezien twee lasers, zowel een afstembare als een vaste laser. Voor het protocol is echter alleen de afstembare nodig. 
Vannas spring schaar - 4 mm snijkantFine Science Tools15018-10Chirurgische benodigdheden
Water bathFathomN/AVervaardigd door direct 3D laser sinteren van roestvrij staal (PH1 legering) van 3D SolidWorks STL-bestanden. Originele leverancier was GPI Prototype & Manufacturing Services, Inc, nu overgenomen door FATHOM, specificaties worden gegeven in het eerder gepubliceerde document

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lu, X. L., Huo, B., Park, M., Guo, X. E. Calcium response in osteocytic networks under steady and oscillatory fluid. Bone. 51 (3), 466-473 (2012).
  2. Wu, D., Schaffler, M. B., Weinbaum, S., Spray, D. C. Matrix-dependent adhesion mediates network responses to physiological stimulation of the osteocyte cell process. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12096-12101 (2013).
  3. Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. Fluid flow in the osteocyte mechanical environment: A fluid-structure interaction approach. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (1), 85-97 (2013).
  4. Genetos, D. C., Kephart, C. J., Zhang, Y., Yellowley, C. E., Donahue, H. J. Oscillating fluid flow activation of gap junction hemichannels induces atp release from MLO-Y4 osteocytes. Journal of Cellular Physiology. 212 (1), 207-214 (2007).
  5. Lu, X. L., Huo, B., Chiang, V., Guo, X. E. Osteocytic network is more responsive in calcium signaling than osteoblastic network under fluid flow. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (3), 563-574 (2012).
  6. Schaffler, M. B., Kennedy, O. D. Osteocyte signaling in bone. Current Osteoporosis Reports. 10 (2), 118-125 (2012).
  7. Kramer, I., et al. Osteocyte Wnt/ -Catenin signaling is required for normal bone homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).
  8. Nakashima, T., et al. Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression. Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).
  9. Kennedy, O. D., et al. Activation of resorption in fatigue-loaded bone involves both apoptosis and active pro-osteoclastogenic signaling by distinct osteocyte populations. Bone. 50 (5), 1115-1122 (2012).
  10. Rawlinson, S. C. F., Wheeler-Jones, C. P. D., Lanyon, L. E. Arachidonic acid for loading induced prostacyclin and prostaglandin E2 release from osteoblasts and osteocytes is derived from the activities of different forms of phospholipase A2. Bone. 27 (2), 241-247 (2000).
  11. David, V., et al. Ex vivo bone formation in bovine trabecular bone cultured in a dynamic 3D bioreactor is enhanced by compressive mechanical strain. Tissue Engineering Part A. 14 (1), 117-126 (2008).
  12. Davies, C. M., et al. Mechanically loaded ex vivo bone culture system "Zetos": systems and culture preparation. European Cell & Materials. 11, 57-75 (2006).
  13. Adachi, T., et al. Osteocyte calcium signaling response to bone matrix deformation. Journal of Biomechanics. 42 (15), 2507-2512 (2009).
  14. Huo, B., Lu, X. L., Guo, X. E. Intercellular calcium wave propagation in linear and circuit-like bone cell networks. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 368 (1912), 617-633 (2010).
  15. Morrell, A. E., et al. Mechanically induced Ca2+ oscillations in osteocytes release extracellular vesicles and enhance bone formation. Bone Research. 6, 6(2018).
  16. Jing, D., et al. In situ intracellular calcium oscillations in osteocytes in intact mouse long bones under dynamic mechanical loading. FASEB Journal. 28 (4), 1582-1592 (2014).
  17. Chen, T. -W., Wardill, T. J., Sun, Y., Pulver, S. R., Renninger, S. L. Ultra-sensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  18. Jacobs, C. R., Temiyasathit, S., Castillo, A. B. Osteocyte mechanobiology and pericellular mechanics. Annual Review of Biomedical Engineering. 12, 369-400 (2010).
  19. Jing, D., et al. Spatiotemporal properties of intracellular calcium signaling in osteocytic and osteoblastic cell networks under fluid. Bone. 53 (2), 531-540 (2013).
  20. Thi, M. M., Suadicani, S. O., Schaffler, M. B., Weinbaum, S., Spray, D. C. Mechanosensory responses of osteocytes to physiological forces occur along processes and not cell body and require αVβ3 integrin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21012-21017 (2013).
  21. Wang, Y., McNamara, L. M., Schaffler, M. B., Weinbaum, S. A model for the role of integrins in flow induced mechanotransduction in osteyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15941-15946 (2007).
  22. McNamara, L. M., Majeska, R. J., Weinbaum, S., Friedrich, V., Schaffler, M. B. Attachment of osteocyte cell processes to the bone matrix. The Anatomical Record. 292 (3), 355-363 (2009).
  23. Franz-Odendaal, T. A., Hall, B. K., Witten, P. E. Buried alive: How osteoblasts become osteocytes. Developmental Dynamics. 235 (1), 176-190 (2005).
  24. Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
  25. Lewis, K. J., et al. Osteocyte calcium signals encode strain magnitude and loading frequency in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (44), 11775-11780 (2017).
  26. Lu, Y., et al. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. Journal of Dental Research. 86 (4), 320-325 (2007).
  27. Rubin, C. T., Lanyon, L. E. Dynamic strain similarity in vertebrates; an alternative to allometric limb bone scaling. Journal of Theoretical Biology. 107 (2), 321-327 (1984).
  28. Jacobs, C. R., et al. Differential effect of steady versus oscillating flow on bone cells. Journal of Biomechanics. 31 (11), 969-976 (1998).
  29. Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. Establishment of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).
  30. Kato, Y., et al. Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).
  31. Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
  32. vander Plas, A., Nijweide, P. J. Isolation and purification of osteocytes. Journal of Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).
  33. Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).
  34. Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. Bone. 45 (4), 682-692 (2009).
  35. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  36. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Osteocyt calciumsignaleringtweefotonmicroscopiemechanische belastingsresponsbotmechanobiologiecalciumindicatormuizendriepuntsbuigingbelastingsge nduceerde signaleringin vivo imaging

Gerelateerde artikelen