Bepaling van in vitro en cellulaire inschakelkinetiek voor fluorogene RNA-aptameren

Samenvatting

Het protocol presenteert twee methoden om de kinetiek van de fluorogene RNA-aptameren Spinazie2 en Broccoli te bepalen. De eerste methode beschrijft hoe fluorogene aptamerkinetiek in vitro kan worden gemeten met een platenlezer, terwijl de tweede methode de meting van fluorogene aptamerkinetiek in cellen door flowcytometrie beschrijft.

Samenvatting

Fluorogene RNA-aptameren zijn toegepast in levende cellen om RNA's te taggen en te visualiseren, te rapporteren over genexpressie en fluorescerende biosensoren te activeren die niveaus van metabolieten en signaalmoleculen detecteren. Om dynamische veranderingen in elk van deze systemen te bestuderen, is het wenselijk om real-time metingen te verkrijgen, maar de nauwkeurigheid van de metingen hangt af van het feit of de kinetiek van de fluorogene reactie sneller is dan de bemonsteringsfrequentie. Hier beschrijven we methoden om de in vitro en cellulaire turn-on kinetiek voor fluorogene RNA-aptameren te bepalen met behulp van een platenlezer uitgerust met respectievelijk een monsterinjector en een flowcytometer. We tonen aan dat de in vitro kinetiek voor de fluorescentieactivering van de Spinazie2- en Broccoli-aptameren kan worden gemodelleerd als tweefasige associatiereacties en verschillende snelle fasesnelheidsconstanten heeft van respectievelijk 0,56 s⁻¹ en 0,35 s⁻¹. Bovendien tonen we aan dat de cellulaire kinetiek voor de fluorescentieactivering van Spinazie2 in Escherichia coli, die verder wordt beperkt door kleurstofdiffusie in de Gram-negatieve bacteriën, nog steeds voldoende snel is om een nauwkeurige bemonsteringsfrequentie op de minuuttijdschaal mogelijk te maken. Deze methoden om fluorescentieactiveringskinetiek te analyseren zijn van toepassing op andere fluorogene RNA-aptameren die zijn ontwikkeld.

Inleiding

Fluorogene reacties zijn chemische reacties die een fluorescentiesignaal genereren. Fluorogene RNA-aptameren vervullen deze functie meestal door een kleine molecuulkleurstof te binden om de fluorescentie-kwantumopbrengst te verbeteren (figuur 1A)¹. Verschillende fluorogene RNA aptamer systemen zijn ontwikkeld en bestaan uit specifieke RNA aptamer sequenties en de bijbehorende kleurstof liganden¹. Fluorogene RNA-aptameren zijn toegevoegd aan RNA-transcripten als fluorescerende tags die live cell imaging van mRNA's en niet-coderende RNA's^{mogelijk maken 2,3,4}. Ze zijn ook geplaatst na promotorsequenties als fluorescerende melders van genexpressie, vergelijkbaar met het gebruik van groen fluorescerend eiwit (GFP) als verslaggever, behalve dat de rapportagefunctie zich op het RNA-niveau ^{5,6 bevindt}. Ten slotte zijn fluorogene RNA-aptameren opgenomen in op RNA gebaseerde fluorescerende biosensoren, die zijn ontworpen om de fluorogene reactie te activeren als reactie op een specifiek klein molecuul. RNA-gebaseerde fluorescerende biosensoren zijn ontwikkeld voor live cell imaging van verschillende niet-fluorescerende metabolieten en signaalmoleculen 7,8,9,10,11.

Er is een groeiende belangstelling voor de ontwikkeling van fluorogene RNA-aptameren om dynamische veranderingen in RNA-lokalisatie, genexpressie en kleine molecuulsignalen te visualiseren. Voor elk van deze toepassingen is het wenselijk om real-time metingen te verkrijgen, maar de nauwkeurigheid van de metingen hangt af van het feit of de kinetiek van de fluorogene reactie sneller is dan de bemonsteringsfrequentie. Hier beschrijven we methoden om de in vitro kinetiek voor fluorogene RNA-aptameren Spinazie2¹² en Broccoli¹³ te bepalen met behulp van een platenlezer uitgerust met een monsterinjector en om de cellulaire turn-on kinetiek voor Spinazie2 uitgedrukt in Escherichia coli te bepalen met behulp van een flowcytometer. Deze twee RNA-aptameren werden gekozen omdat ze zijn toegepast om RNA-lokalisatie te bestuderen ^2,3,4, ze zijn gebruikt in reporters ^5,6 en biosensoren ^7,8,9,10,11, en de overeenkomstige kleurstofliganden (DFHBI of DFHBI-1T) zijn in de handel verkrijgbaar. Een samenvatting van hun in vitro eigenschappen bepaald in de literatuur is opgenomen in tabel 1 ^4,13,14, die ten grondslag lag aan de ontwikkeling van het protocol (bv. de gebruikte golflengten en kleurstofconcentraties). Deze resultaten tonen aan dat de fluorogene reacties die worden beïnvloed door RNA-aptameren snel zijn en nauwkeurige metingen voor de gewenste celbiologische toepassingen niet mogen belemmeren.

Protocol

1. In vitro kinetisch experiment

1. Voorbereiding van DNA-sjablonen door PCR
   1. PCR-reactie(s) instellen: Om PCR-reacties voor te bereiden, combineert u de volgende reagentia in een dunwandige PCR-buis:
      33 μL dubbel gedestilleerd water (ddH₂O)
      10 μL 5x buffer voor high-fidelity DNA polymerase
      5 μL van 2 mM per desoxyribonucleosidetrifosfaat (dNTP)
      0,5 μL van 40 μM voorwaartse primer
      0,5 μL omgekeerde primer van 40 μM
      0,5 μL (10-100 ng) DNA-sjabloon (alleen voor Spinazie2 PCR; Broccoli primers overlappen elkaar)
      0,5 μL high-fidelity DNA polymerase (laatste toevoegen)
      OPMERKING: Synthetische oligonucleotiden worden vaak droog verzonden. Om voorraadoplossingen te bereiden, voegt u een bekend volume (100 μL aanbevolen) van ddH₂O toe en meet u de A₂₆₀ van die oplossing om de concentratie te bepalen volgens de wet van Beer, waarbij de extinctiecoëfficiënt kan worden berekend door de regels van de naaste buren online. Deze stamoplossing kan vervolgens worden gebruikt om verdunningen geschikt te maken voor gebruik in PCR.
   2. Voer het thermocycler-protocol uit.
      1. Gebruik het volgende thermocycler-protocol om spinazie2- en broccoli-DNA-sjablonen van volledige lengte te versterken:
         Initiële denaturatie: 98 °C gedurende 2 min
         35 cycli:
         Denaturatie: 98 ° C denaturatie voor 15 s
         Gloeien:72 °C gedurende 30 s
         Extensie:72 °C gedurende 30 s
         Laatste verlenging: 72 °C gedurende 5 min.
      2. Analyseer na de reactie een kleine aliquot van het product door 2% agarose-gel samen met een laagmoleculaire gewichtsladder (groottebereik: 25-766 nucleotiden) om de aanwezigheid van het gewenste DNA-product te bevestigen.
      3. Zuiver het product door in de handel verkrijgbare gelextractie- of PCR-reinigingskits en eluuteer met ddH₂O of de buffer die door de fabrikant is verstrekt.
         OPMERKING: Zorg ervoor dat bij het kiezen van een PCR-opruimkit dat de kolommoleculaire gewichtsafsnijding laag genoeg is om T7-Broccoli (81 nucleotiden) te behouden, anders gaat het PCR-product verloren.
         OPMERKING: Optioneel pauzepunt: bewaar het DNA bij −20 °C.
2. Bereiding van spinazie2 en broccoli RNA door in vitro transcriptie (IVT)
   1. Stel de transcriptiereactie(s) in.
      1. Om een transcriptiereactie van 100 μL te bereiden, combineert u de volgende reagentia in een microcentrifugebuis van 1,5 ml: 10 μL 10x transcriptiebuffer + 20 μL ribonucleosidetrifosfaten (rNTP's) + 1-64 μL DNA-sjabloon (totaal 1 μg) + 2 μL anorganische pyrofosfatase + ddH₂O tot 98 μL + 2 μL T7 RNA-polymerase (laatste toevoegen).
      2. Incubeer deze reactie gedurende 4 uur bij 37 °C. Doof de reactie door toevoeging van 100 μL 2x ureumgel laadbuffer (2x ULB), samengesteld uit 20% sucrose, 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS), 1x Tris-Borate-EDTA (1x TBE) buffer en ~18 M ureum.
         OPMERKING: Optioneel pauzepunt: bewaar de gebluste reactie bij −20 °C.
3. Polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) zuivering van RNA
   1. PAGE zuivering van Spinazie2 en Broccoli RNA
      LET OP: Niet-gepolymeriseerd (vloeibaar of poedervormig) acrylamide is extreem giftig. Als u acrylamide in poedervorm weegt, doe dit dan in een zuurkast. Draag altijd de juiste beschermingsmiddelen en verwijder handschoenen die besmet zijn met acrylamidepoeder of -oplossing onmiddellijk en was de handen grondig. Als acrylamide in direct contact komt met de huid, was het blootgestelde gebied dan gedurende ten minste 15 minuten met water en zeep. Als acrylamide in direct contact komt met de ogen, spoel ze dan gedurende 15 minuten met water.
      1. Bereid de PAGE-gel voor: Om ongewenste abortieve transcripties en niet-gereageerde rNTPs van het volledige product te verwijderen, bereidt u een 6% ureum-polyacrylamidegel. Over het algemeen kunnen gels van 28 cm x 16,5 cm x 1,5 mm worden gebruikt met een kam met 8 putten. Stel de gel- en elektroforeseapparatuur in met behulp van 1x TBE-buffer om de reservoirs te vullen.
      2. Laad RNA-monster(s) in de PAGE-gel: Laad de gel met één uitgedoofde reactie van 200 μL per baan. Laad in een aparte baan 2x ULB met trackerkleurstoffen xyleencyyanol en broomfenolblauw, die in de gel migreren bij respectievelijk 106 nucleotiden en 26 nucleotiden, respectievelijk¹⁵. Laat een lege rijstrook tussen elk monster om mogelijke besmetting in de volgende stappen te voorkomen.
      3. Voer de PAGE-gel uit: Om 95-nt Spinazie2 en 49-nt Broccoli van hun respectieve afgeknotte producten te scheiden, voert u de gel gedurende 1,5-2 uur uit op 25 W, waarna de broomfenolblauwe kleurstof ~ 5/6 van de gellengte is gemigreerd.
      4. Visualiseer de RNA-monster(s) in de PAGE-gel: demonteer de glasplaten rond de gel en bedek de gel aan beide zijden met plasticfolie, waarbij de banen op de wikkel worden geëtiketteerd. Visualiseer RNA-banden in een donkere kamer door UV-schaduwing door de ingepakte gel op een fluorescerende TLC-plaat onder UV-licht te plaatsen. Schets snel de rand van de RNA-banden die overeenkomen met het product met een marker en schakel de UV-lamp uit om schade door UV-blootstelling te minimaliseren.
      5. Accijns en extraheer de RNA-monster(s) uit de PAGE-gel: Snijd met een vers scheermesje voor elk monster de gewenste productbanden weg, snijd in blokjes van ~ 1 mm en voeg de gelstukken toe aan een microcentrifugebuis van 2 ml met 500 μL crush soak buffer om RNA op een rotator te extraheren gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT) of een nacht bij 4 °C.
         OPMERKING: Optioneel pauzepunt: het monster kan worden bewaard bij −20 °C.
      6. Het RNA neerslaan
         1. Om de gelstukken van het geëxtraheerde RNA in buffer te scheiden, centrifugeert u het monster bij 13.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C en gebruikt u vervolgens een pipet met smalle punt om het supernatant te extraheren en in een nieuwe microcentrifugebuis van 2 ml te laden.
         2. Om het RNA neer te slaan, voegt u 1,5 ml ijskoude ethanol en 1 μL glycogeen, vortex toe en bewaart u deze gedurende ten minste 1 uur bij −20 °C of −80 °C.
            OPMERKING: Optioneel pauzepunt: het RNA kan een paar maanden bij −20 °C worden bewaard.
      7. Verzameling van RNA-neerslag: Pelleteer het neergeslagen RNA door centrifugatie bij 13.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant en laat de resterende ethanol verdampen onder open lucht (~1 h) voordat de pellet wordt geresuspendeerd in 30 μL ddH₂O of 1x TE buffer.
         OPMERKING: Dit proces resulteert meestal in een uiteindelijke RNA-concentratie van ~ 10 μM.
         OPMERKING: Optioneel pauzepunt: het RNA-monster kan enkele maanden bij −20 °C worden bewaard.
   2. Bepaal de RNA-voorraadconcentraties.
      1. Bereid een RNA-aliquot voor de hydrolysereactie voor.
         1. Om deze test uit te voeren, gebruikt u eerst een UV / Vis nanospectrofotometer om de A₂₆₀ van het voorraad-RNA-monster te bepalen en een verdunde aliquot van het monster te maken tot ~ 10 absorptie-eenheden (AU) in ddH₂O.
         2. Bereid de volgende reactie voor in een PCR-buis van 0,5 ml: 16 μL ddH₂O + 2 μL 10x Na₂CO_3-buffer + 2 μL RNA-aliquot verdund tot ~10 AU. Incubeer de reactie gedurende 90 minuten bij 95 °C en laat deze vervolgens afkoelen tot RT.
      2. Bepaal de RNA-concentratie met behulp van nucleotide-absorpties: Meet de A₂₆₀ van dit monster met een UV/Vis nanospectrofotometer en bereken de RNA-concentratie met behulp van de volgende formule:
         
         waarbij c de concentratie van RNA is, b de padlengte, i het specifieke nucleotide (A, C, G of U), n_i de frequentie van nucleotide i in de RNA-sequentie en ε_i de molaire extinctiecoëfficiënt van nucleotide i is. Om de oorspronkelijke voorraad-RNA-concentratie te bepalen, vermenigvuldigt u c met de verdunningsfactor.
         OPMERKING: Optioneel pauzepunt: Het RNA kan een paar maanden bij −20 °C worden bewaard.
4. Het uitvoeren van een in vitro kinetische test van de plaatlezer
   1. Het RNA-renaturatieprogramma instellen: Maak het volgende thermocyclerprotocol door Nieuw programma maken > Nieuwe fase toevoegen meerdere keren > Nieuwe stap toevoegen te selecteren om elk van de volgende stappen toe te voegen voordat u op Opslaan drukt:
      70 °C gedurende 3 min
      65 °C gedurende 45 s
      60 °C gedurende 45 s
      55 °C gedurende 45 s
      50 °C gedurende 45 s
      45 °C gedurende 45 s
      40 °C gedurende 45 s
      35 °C gedurende 45 s
      30 °C gedurende 45 s
   2. Renature het RNA: Om Spinazie2 en Broccoli RNA's te renatureren, bereidt u 2 μM-voorraden van elk RNA in ddH₂O in een 0,5 ml dunwandige PCR-buis en voegt u vervolgens een gelijk volume van 2x renaturatiebuffer toe (80 mM HEPES, pH 7,5 [KOH], 250 mM KCl, 6 mM MgCl₂) om 1 μM RNA-oplossingen te maken. Voeg de buizen toe aan de thermocycler, open het opgeslagen renaturatieprogramma en druk op Uitvoeren.
      OPMERKING: Als een thermocycler niet beschikbaar is, kunnen de RNA's in plaats daarvan gedurende 3 minuten worden geïncubeerd op een warmteblok van 70 °C en vervolgens langzaam worden afgekoeld tot RT op de bank.
   3. Bereid de bindingsreactiebuffer voor: Om de buffer voor te bereiden op één aptamer-kleurstofbindingsreactie, maakt u een hoofdmengsel met buffercomponenten (69,5 μL ddH₂O + 4 μL van 1 M HEPES, pH 7,5 [KOH] + 6,2 μL van 2 M KCl + 0,3 μL van 1 M MgCl₂). Afhankelijk van het aantal monsters en replicaties dat nodig is, vermenigvuldigt u deze waarden met het aantal monsters plus één. Over het algemeen is drie replicaties per RNA-monster bevredigend.
   4. Bereid de plaatlezer voor.
      1. Het injectorprogramma voor de platenlezer instellen: Selecteer op de fluorescentieplaatlezer Temp en stel de gewenste temperatuur in op 37 °C, zorg ervoor dat de temperatuur ruim voordat kinetische experimenten worden gestart, op deze waarde is afgestemd. Open de software voor de kaartlezer, selecteer Instellingen > acquisitieweergave en voer het volgende programma in voor kinetische metingen:
         Lus: Voor elke put
         Basislijninstelling: 60 basislijnwaarden
         SmartInject-instellingen: 10 μL-injectie (wat zal gebeuren nadat de basislijn is gelezen)
         Fluorescentie (of FL) luidt:
         Excitatie: 448 nm (bandbreedte: 9 nm)
         Emissie: 506 nm (bandbreedte: 15 nm)
         Patroon: MONO (s/n 3297)
         Timing:
         Totale leestijd: 10 min
         Leesinterval: 0,5 s
         PMT en optica: 6 flitsen per leeshoek
         Loop: Volgende put
      2. Bereid de injector voor
         1. Was en ontlucht de injector: Om de injector van de platenlezer voor te bereiden, selecteert u eerst Injecteren op de plaatlezer, levert u een afvalverzamelplaat aan de platenlezer wanneer deze wordt gericht en selecteert u vervolgens Wassen en reinigt u de injectiebuis volgens de instructies op de plaatlezer met 1 ml volumes ddH₂O, 75% ethanol in ddH₂O, en dan ddH₂O. Selecteer vervolgens Aspirate, zodat de injector overtollige vloeistof kan uitwerpen.
         2. Prime de injector: Nadat u naar het vorige scherm bent gegaan, selecteert u Prime om de injector voor te bereiden met twee 260 μL-volumes ligand die moeten worden geïnjecteerd om ervoor te zorgen dat zuiver, geconcentreerd ligand tijdens experimenten aan monsters wordt toegevoegd - in dit geval prime met 100 μM DFHBI in ddH₂O.
   5. Voer in vitro kinetische experimenten uit: Om één kinetisch experiment uit te voeren, voegt u eerst 80 μL eerder bereide bindingsbuffermastermix toe aan één put van een 96-well clear-bottom plaat, gevolgd door 10 μL gereatureerd RNA. Laat deze plaat en de DFHBI-oplossing in de injector gedurende 15 minuten in de plaatlezer in evenwicht brengen tot 37 °C.
   6. Selecteer in de instellingen van de plaatlezersoftware onder Leesgebied de put die moet worden geanalyseerd en selecteer vervolgens op het tabblad Start uitvoeren om het eerder beschreven kinetische programma uit te voeren. Herhaal dit proces totdat alle experimenten zijn voltooid.
      OPMERKING: Kritisch gezien moeten kinetische experimenten één goed tegelijk worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de RNA-kinetiek wordt gemeten onder identieke omstandigheden tussen replicaties en monsters.
   7. Was de injector: Om de resterende DFHBI-oplossing uit de injectiebuis te verwijderen, wast u de injectiebuis zoals beschreven in stap 1.4.4.2.1 met 1 ml volumes ddH₂O, 75% ethanol in ddH₂O en vervolgens ddH₂O.
      OPMERKING: Optioneel pauzepunt.
5. Analyse van de in vitro kinetiek van fluorogene RNA-aptameren.
   1. Voer gegevens in de analysesoftware in: exporteer experimentele gegevens als een spreadsheet om de gegevens eenvoudig te kopiëren voor verwerking. Maak in de analysesoftware een nieuwe gegevenstabel in XY-indeling. Voer in de X-kolom elk leestijdpunt in, waarbij t = 0 de tijd van DFHBI-injectie is. Voer in de kolom Y de gemiddelde fluorescentiewaarden in tussen replicaties op dat respectieve tijdstip vanaf t = 0.
   2. Normaliseer en grafiek van de gegevens: Om de fluorescentiewaarden te normaliseren, klikt u op Analyseren > gegevensverwerking > Normaliseren en klikt u vervolgens op OK. Kies ervoor om de kleinste en grootste waarden van de gegevensset te gebruiken voor normalisatie, om resultaten als breuken weer te geven en om de resultaten in een grafiek weer te geven en klik vervolgens op OK. Als u een grafiek wilt maken van de genormaliseerde gemiddelde fluorescentie in de loop van de tijd, klikt u op het pictogram Normaliseren van [Naam van dataset] en selecteert u Graph Family: XY met alleen punten.
      OPMERKING: Foutbalken kunnen handig zijn om te zien in gevallen waarin een klein aantal tijdspunten in een grafiek is weergegeven. Als deze gewenst zijn, selecteert u bij het kiezen van een gegevenstabel in XY-indeling de optie onder "Y" om replicatiewaarden in kolommen naast elkaar in te voeren. Als u de resulterende tabel in een grafiek weergeeft met de standaardopties geselecteerd, wordt een grafiek met foutbalken gegenereerd.
   3. Curve fitting uitvoeren om kinetische parameters te verkrijgen: Om een curve aan de kinetische gegevens aan te passen, klikt u op Analyseren > Gegevens analyseren en selecteert u Niet-lineaire regressie (Curve Fit) onder het tabblad XY-analyses . Klik op het tabblad Model op Exponentiële > tweefasenassociatie om de kinetische gegevens te koppelen aan de volgende tweefasige associatievergelijking:
      
      waarbij Y de fluorescentie is op tijdstip X, Y₀ de fluorescentie bij t = 0, K_Fast en K_Slow zijn respectievelijk snelle en langzame snelheidsconstanten en SpanFast en SpanSlow zijn de bereiken van fluorescentie-inschakeling die respectievelijk door de snelle en langzame snelheden worden verklaard (zie representatieve resultaten, figuur 1). Klik op het tabblad Nonlin Fit om snelheidsconstanten, t_1/2-waarden en PercentFast-waarden te bekijken.
      OPMERKING: Om een standaarddeviatie voor al deze waarden te verkrijgen, kunnen individuele replicaties van plaatlezersexperimenten op dezelfde manier worden verwerkt als hierboven beschreven.

2. Cellulair kinetisch experiment

1. Bereiding van E. coli stammen
   1. Transformeer BL21 Star (DE3) E. coli-cellen met ~100 ng pET31b tRNA-Spinazie2-construct volgens het protocol van de fabrikant.
      OPMERKING: Plasmide constructie is in de handel verkrijgbaar (Plasmid #79783).
   2. Plaats de cellen op LB-agar die carbenicilline (Carb: 50 mg / ml) platen bevat en incubeer bij 37 °C gedurende 12-16 uur. Cellen die plasmiden bevatten, groeien als kolonies op de plaat.
      OPMERKING: Optioneel pauzepunt: Getransformeerde BL21 Stercellen op platen kunnen gedurende 1 week bij 4 °C in parafilm worden bewaard.
2. Cellen laten groeien en de expressie van fluorogeen RNA-aptamer induceren
   1. Ent een 2 ml cultuur van niet-inducerende media (NI) die carbenicilline bevatten (Carb: 50 mg / ml) met een enkele kolonie van de getransformeerde BL21-stercellen. Herhaal dit voor ten minste drie biologische replicaties. Incubeer de culturen bij 37 °C in een incubator/shaker bij 250 rpm gedurende 22-24 uur.
      OPMERKING: Optioneel pauzepunt: Cellen gekweekt in NI-media behouden het plasmide en kunnen gedurende 1 week bij 4 °C worden bewaard.
   2. Na groei in NI-media, verdun de cultuur 100x tot een verse 3 ml ZYP-5052 auto-inductiemedia (AI) die carbenicilline bevatten (Carb: 50 mg / ml). Laat de cellen groeien bij 37 °C in een incubator/shaker bij 250 rpm gedurende 16-18 uur om expressie te induceren.
      OPMERKING: De typische OD₆₀₀ voor culturen varieert van 2,0-3,3 na 18 uur groei. De optimale celdichtheid ligt tussen 2,5-3,0.
3. Het uitvoeren van het cellulaire kinetische experiment
   1. Stel de flowcytometer in.
      1. Schakel de flowcytometer en computer in die op het instrument zijn aangesloten. Eenmaal ingelogd in de software voor de flowcytometer, klikt u onder het tabblad Instrument op het opstartpictogram . Volg de stappen die op het softwarescherm worden aangegeven om de juiste initialisatie van de instrumentatie te garanderen.
         OPMERKING: Sommige flowcytometers noemen de opstartsequentie priming van het instrument. Zorg ervoor dat u het protocol van de fabrikant volgt voor de flowcytometer die voor het experiment in gebruik zal zijn.
      2. Voer een prestatietest uit (indien van toepassing). Klik onder het tabblad Hoofdmenu op Prestatietest. Voeg in een kweekbuis drie druppels van de prestatietrackingparels van de fabrikant toe aan 3 ml scherpstelvloeistof.
      3. Plaats de kweekbuis in de monsterbuisheffer en til de lifter op. Voordat u op Prestatietest uitvoeren klikt, moet u ervoor zorgen dat de partij # van de buis van de trackingkralen hetzelfde is als wat wordt aangegeven op het scherm Prestatietest instellen . Klik op Prestatietest om de test uit te voeren.
      4. Stel de flowcytometersoftware voor dit experiment in met de volgende acquisitieparameters voor eencellige fluorescentie:
         Excitatie Laser: 488 nm
         Emissiekanaal: GFP (ook wel FITC genoemd)
         Acquisitievolume: 40 μL (met een totaal drawvolume van 90 μL)
         Debiet: 200 μL/ min
         Celtellingen voor elke meting: 30.000
         Instrumentinstellingen:
         Spanning:
         FSC: 480 V
         SSC: 400 V
         BL1: 540 V
         BL2: 392 V
         BL3: 422 V
   2. Stel de experimentele bestanden in.
      1. Maak een nieuw experimentbestand op het tabblad Experimentverkenner door met de rechtermuisknop op de gebruikersnaam van de flowcytometer te klikken. Selecteer Nieuw experiment in het vervolgkeuzevenster. Wanneer er een nieuw venster op het computerscherm verschijnt, selecteert u OK.
      2. Klik in het nieuwe experimentbestand met de rechtermuisknop op de map "Groep" en selecteer Nieuwe voorbeeldbuis toevoegen. Label de voorbeeldbuizen voor elk specifiek tijdstip en repliceer door met de rechtermuisknop op Voorbeeld te klikken en Naam wijzigen te selecteren in het vervolgkeuzemenu. Herhaal deze stap voor het totale aantal replicaties en tijdspunten voor het beoogde tijdsverloop van het onderzoek.
   3. Bereid een verdunde celoplossing: Voeg in een nieuwe kweekbuis 1,5 ml 1x PBS-oplossing toe. Voeg vervolgens 3 μL geïnduceerde cellen in AI-media toe aan de 1x PBS-oplossing om een verdunde celoplossing te maken. Herhaal deze stap voor elke biologische replicaat in verschillende kweekbuizen.
   4. Meet de achtergrondfluorescentie van de cellen: Voordat u kleurstof toevoegt, neemt u metingen van elke biologische replicaatcultuurbuis die cellen bevat in 1x PBS-oplossing. Dit is zo dat de fluorescerende achtergrond van de cellen wordt gemeten om te zien dat de vouw in de loop van de tijd wordt ingeschakeld zodra de kleurstof is toegevoegd.
      1. Om een meting uit te voeren, plaatst u de kweekbuis in de monsterbuisheffer en tilt u de lifter met de hand op naar de injectienaald van het monster. Selecteer het juiste voorbeeldbestand op het tabblad Collectiepaneel en klik op Opnemen.
      2. Wanneer de run is voltooid, laat u de monsterbuisheffer met de kweekbuis met de hand zakken. Dit zal een spoelstap initiëren die het vloeistofsysteem zal spoelen en de overdracht tussen elk biologisch replicatiemonster zal minimaliseren. De gegevens worden automatisch opgeslagen op de computer nadat de uitvoering is voltooid.
      3. Herhaal de stappen binnen 2.3.4 om de cellulaire fluorescerende achtergrond te meten voor ten minste drie biologische replicaties. Als u naar het volgende voorbeeldbestand wilt gaan, selecteert u het volgende voorbeeldbestand door op het pijlpictogram naar rechts te klikken bij de naam van de voorbeeldbuis onder het recordpictogram .
   5. Meet fluorescentie op tijdstippen voor cellen met kleurstof.
      1. Voeg 1,4 μL geconcentreerde kleurstof (50 mM DFHBI-1T in DMSO) toe aan 1x PBS-oplossing met cellen om een eindconcentratie van 50 μM DFBHI-1T te verkrijgen. Bevestig vervolgens het deksel van de kweekbuis en keer vervolgens 3x-5x kweekbuizen om om de oplossing gelijkmatig te mengen voordat u de eerste keerpuntmeting doet.
         OPMERKING: Het totale percentage DMSO in de kweekbuizen voor E. coli mag niet hoger zijn dan 10%, omdat dit de levensvatbaarheid van de cel kan beïnvloeden¹⁶.
      2. Verwijder het deksel en plaats de kweekbuis in de monsterbuisheffer. Til de houder met de hand naar de injectienaald van het monster en klik onder het juiste monsterbestand op het pictogram Opnemen . Start bovendien een timer door op Start te drukken voor het experiment.
      3. Laat de buisheffer met de hand zakken nadat de run is voltooid en herhaal stap 2.3.5.1-2.3.5.2. (met de timer draaiend) door 1,4 μL van de geconcentreerde DFHBI-1T toe te voegen, de kweekbuizen om te keren en metingen te doen voor alle resterende biologische replicaties. Deze eerste opnames zijn de metingen verkregen op 0 min voor alle biologische replicaties. Doe dit één voor één voor elke biologische replicaat.
         OPMERKING: Noteer het tijdstip waarop de acquisitie van de recordstroomcytometrie wordt ingedrukt. Houd u aan deze tijdsspreiding voor tijdspunten in de loop van het experiment.
      4. Blijf metingen uitvoeren door de kweekbuizen in de monsterbuislifter naar de monsterinjectienaald te brengen, het juiste monsterbestand te selecteren, op Opnemen te klikken en de lifter met de hand te laten zakken nadat elke run is voltooid. Doe dit voor alle extra tijdspunten en biologische replicaties die worden getest. Herhaal de stappen totdat het experiment is voltooid.
         OPMERKING: Houd de monsters uit het licht om fotobleaching van DFHBI-1T in oplossing te voorkomen door de monsters te bedekken met aluminiumfolie.
   6. Meet fluorescentie op tijdstippen voor cellen zonder kleurstof (Control).
      1. Voer de juiste reinigingsprotocollen voor de flowcytometer uit voordat u het experiment opnieuw herhaalt met negatieve controles volgens het protocol van de fabrikant. Dit wordt gedaan om eventuele overdracht van het vorige experiment naar het experiment met controletijdpuntanalyse te minimaliseren. Hieronder staan de stappen die worden gevolgd voor de flowcytometer tussen experimenten:
         1. Plaats een lege kweekbuis met de hand in de buisheffer, til de buishouder op en klik op het pictogram Ontstoppen op het tabblad Instrument . Dit zal een backflush in het fluidics-systeem uitvoeren om eventuele kleverige monsters op te ruimen. Laat de buishouder met de hand zakken en verwijder de buis zodra de Unclog-reeks is voltooid.
         2. Voeg met een nieuwe kweekbuis 3 ml van een 10% bleekoplossing toe, plaats de kweekbuis in de buishouder en til de houder met de hand op naar de injectienaald van het monster. Plaats bovendien een schone 96-well plaat in de autosampler indien van toepassing op de flowcytometer.
         3. Klik op het pictogram Sanitize SIP/Sanitize Autosampler SIP om een reinigingsvolgorde uit te voeren met 10% bleekmiddel in het fluidics-systeem. Laat de buishouder zakken om de reinigingsvolgorde te voltooien.
      2. Stel de voorbeeldbestanden in voor de controletijdpuntanalyse volgens de aanwijzingen in stap 2.3.3.
      3. Bereid in een nieuwe kweekbuis een verdunde celoplossing in 1,5 ml 1x PBS-oplossing. Voeg 3 μL van de geïnduceerde cellen in AI-media toe aan de 1x PBS-oplossing om een verdunde celoplossing te maken. Herhaal deze stap voor elke biologische replicaat.
      4. Voeg één voor één 1,4 μL DMSO toe aan de kweekbuis aan de 1x PBS-oplossing met cellen en test dezelfde tijdstippen. Bevestig het deksel van de kweekbuis en keer vervolgens 3x-5x kweekbuizen om de oplossing gelijkmatig te mengen voordat u het eerste tijdstip leest. Doe dit één voor één voor elke biologische replicaat.
      5. Volg hetzelfde protocol voor de analyse van controlecellen als voor cellen met kleurstof, met behulp van stappen 2.3.5.2-2.3.5.4.
   7. Sluit de flowcytometer af: Volg het protocol van de fabrikant voor de juiste uitschakeling van de instrumentatie. Voor de flowcytometer wordt het instrument op de volgende manier voorbereid op uitschakeling:
      1. Voer het initiële reinigingsprotocol voor de flowcytometer uit volgens de stappen 2.3.6.1.1-2.3.6.1.3.
      2. Vervang de kweekbuis door 10% bleekoplossing door een kweekbuis met 3 ml focusvloeistof. Til de buishouder met de hand op en klik onder het pictogram Afsluiten op het vervolgkeuzemenu en selecteer Grondig.
         OPMERKING: Optioneel pauzepunt.
4. Analyse van de flowcytometriegegevens
   1. Exporteer alle FCS-bestanden voor analyse. Open de FCS-bestanden met een flowcytometrie-analysesoftware.
   2. Gebruik een van de CELL-only FCS-bestanden en genereer een poort van de forward scatter (FSC) en side scatter (SSC) dot plot (FSC-Area/SSC-Area), waarbij beide logassen worden gebruikt om signalen van puin uit te sluiten. Om deze poort te maken, klikt u op het AutoGate-pictogram op de flowcytometrie-analysesoftware en noemt u deze Gate 1. Pas dezelfde poort toe op alle voorbeelden die zijn getest op het tabblad Alle voorbeelden in de werkruimte voor gegevensverwerking. Dit zal resulteren in Gate 1 onder alle FCS-bestanden die worden verwerkt.
   3. Maak een nieuw subsetbestand met het FCS-bestand Alleen cel dat in stap 2.4.2 is gebruikt door erop te dubbelklikken. Wijzig de asinstellingen in FSC-gebied/FSC-hoogte, waarbij beide logassen gebruiken. Klik op het AutoGate-pictogram op de flowcytometrie-analysesoftware om een ovale poort te genereren, die gate 2 wordt genoemd. Pas deze poort toe als een subset onder de poortset in stap 2.4.2 op alle geteste monsters. Dit zal ertoe leiden dat alle monsters Gate 1 > Gate 2 hebben gekoppeld aan elk FCS-bestand.
   4. Maak nog een subsetbestand met beide poorten ingesteld in stap 2.4.2 en stap 2.4.3 toegepast door te dubbelklikken op Gate 2. Wijzig de asinstellingen in FSC-gebied/histogram. Pas deze histogrampoort toe als een subset op alle geteste monsters, wat resulteert in alle monsters met Gate 1 > Gate 2 > Gate 2 die aan elk FCS-bestand is gekoppeld.
      OPMERKING: De histogrammen kunnen worden hernoemd van Gate 2 naar Histogram om te helpen bij het verplaatsen van de histogrammen naar het lay-outvenster en om meer organisatie te creëren met de gegevensverwerking.
   5. Als u de MFI-waarden (Mean Fluorescence Intensity) wilt analyseren, opent u het lay-outvenster. Klik en sleep de histogrampoorten voor elk tijdstip naar het lay-outvenster.
   6. Voer een statistische analyse uit voor "∑ Mean: BL1-A" (GFP) voor elk getest monster om de MFI-resultaten in het lay-outvenster weer te geven.
   7. Bereken de standaarddeviatie voor de MFI-waarden per tijdspuntanalyse voor ten minste drie onafhankelijke biologische replicaties.
   8. Sla de histogrammen en MFI-waarden voor elk tijdstip op door het lay-outvenster als pdf-bestand te exporteren.
      OPMERKING: Optioneel pauzepunt.
5. Grafiek flow cytometrie gegevens
   1. Open het PDF-bestand met de histogrammen en MFI-waarden voor elk tijdstip. De MFI-waarden worden gekopieerd naar een data-analysesoftware. Maak in software voor gegevensgrafieken een nieuwe gegevenstabel in de XY-indeling.
      1. Selecteer deze optie om een XY-tabel te maken met het volgende geselecteerd:
         Gegevenstabel: gegevens invoeren of importeren in een nieuwe tabel
         Opties:
         X: Verstreken tijden
         Y: Voer (drie tot vier) replicatiewaarden in naast elkaar liggende subkolommen in
      2. Label op de X-as alle tijdspunten voor het experiment en het besturingselement wordt uitgevoerd.
      3. Voer in groep A de MFI-waarden in voor alle biologische replicaties in elk tijdstip voor fluorescentieanalyse van de cellen waaraan de kleurstof is toegevoegd.
      4. Voer in groep B de MFI-waarden voor alle biologische replicaties in elk tijdstip in voor analyse van de cellen waaraan geen kleurstof (DMSO) is toegevoegd.
      5. Om de resultaten te bekijken, klikt u op [Naam gegevensset invoegen] onder het tabblad Grafieken . Hiermee worden de gegevenspunten weergegeven als middelen, met foutbalken die de standaarddeviatie (s.d.) op elk tijdstip vertegenwoordigen. De X-as vertegenwoordigt de verstreken tijd en de Y-as vertegenwoordigt de MFI-waarden.

Resultaten

In vitro kinetiek
De sequenties van de DNA-sjablonen en primers, die worden gekocht als synthetische oligonucleotiden, zijn weergegeven in tabel 2 en de reagensrecepten worden weergegeven in aanvullend bestand 1. PCR-amplificatie wordt gebruikt om de hoeveelheid DNA-sjabloon op te schalen met de T7-promotor, die nodig is voor de daaropvolgende in vitro transcriptie (IVT) -reactie. Bovendien kan PCR-amplificatie voor twee doeleinden i...

Discussie

Voor het in vitro kinetische experiment kan hetzelfde algemene protocol worden gewijzigd om de in vitro kinetiek te meten van een op RNA gebaseerde fluorescerende biosensor die zowel een ligandbindend als fluorofoorbindend domein bevat⁸. In dit geval moet het RNA worden geïncubeerd met de fluorofoor voorafgaand aan metingen bij het injecteren van het ligand om ligandresponskinetiek te verkrijgen. Als er een hoge variabiliteit wordt waargenomen tussen de replicaties, kan men probl...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agarose	Thermo Fischer Scientific	BP160500
Agarose gel electrophoresis equipment	Thermo Fischer Scientific	B1A-BP
Alpha D-(+)-lactose monohydrate	Thermo Fischer Scientific	18-600-440
Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes	Thermo Fischer Scientific	22431021
Ammonium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)	Sigma-Aldrich	A4418
Attune NxT Flow cytometer	Thermo Fischer Scientific	A24861
Attune 1x Focusing Fluid	Thermo Fischer Scientific	A24904
Attune Shutdown Solution	Thermo Fischer Scientific	A24975
Attune Performance Tracking Beads	Thermo Fischer Scientific	4449754
Attune Wash Solution	Thermo Fischer Scientific	J24974
Boric acid	Sigma-Aldrich	B6768
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126
Carbenicillin disodium salt	Sigma-Aldrich	C3416
Chlorine Bleach	Amazon	B07J6FJR8D
Corning Costar 96-well plate	Daigger Scientific	EF86610A
Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap	Globe Scientific	05-402-31
DFHBI	Sigma-Aldrich	SML1627
DFHBI-1T	Sigma-Aldrich	SML2697
D-Glucose (anhydrous)	Acros Organics	AC410955000
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	DTT-RO
DNA loading dye	New England Biolabs	B7025S
DNA LoBind Tubes (2.0 mL)	Eppendorf	22431048
dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP	New England Biolabs	N0446S
EDTA, pH 8.0	Gibco, Life Technologies	AM9260G
Ethanol (EtOH)	Sigma-Aldrich	E7023
Filter-tip micropipettor tips	Thermo Fischer Scientific	AM12635, AM12648, AM12655, AM12665
FlowJo Software	BD Biosciences	N/A	FlowJo v10 Software
Fluorescent plate reader with heating control	VWR	10014-924
Gel electrophoresis power supply	Thermo Fischer Scientific	EC3000XL2
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Glycogen AM95010	Thermo Fischer Scientific	AM95010
GraphPad Prism	Dotmatics	N/A	Analysis software from Academic Group License
Heat block	Thomas Scientific	1159Z11
HEPES	Sigma-Aldrich	H-4034
Inorganic pyrophosphatase	Sigma-Aldrich	I1643-500UN
Low Molecular Weight DNA Ladder	New England Biolabs	N3233L	Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025).
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M2670
Magnesium sulfate (MgSO4)	Fisher Scientific	MFCD00011110
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Eppendorf	22363204
Microcentrifuge with temperature control	Marshall Scientific	EP-5415R
Micropipettors	Gilson	FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M
Micropipettor tips	Sigma-Aldrich	Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR
Millipore water filter with BioPak unit	Sigma-Aldrich	CDUFBI001, ZRQSVR3WW
Narrow micropipettor pipette tips	DOT Scientific	RN005R-LRS
PBS, 10x	Thermo Fischer Scientific	BP39920
PCR clean-up kit	Qiagen	28181
PCR primers and templates	Integrated DNA technologies
PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes	Bio-Rad	1851148
PCR thermocycler for 0.5 mL tubes	Techne	5PRIME/C
pET31b-T7-Spinach2 Plasmid	Addgene	Plasmid #79783
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0530L	Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions.
Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific	C.B.S. Scientific	VGC-1508
Polyacrylamide gel electrophoresis equipment	C.B.S. Scientific	ASG-250
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Razor blades	Genesee Scientific	38-101
rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP	New England Biolabs	N0450L
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
Short wave UV light source	Thermo Fischer Scientific	11758221
Sodium carbonate (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S7795
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
Sodium phosphate dibasic, anhydrous	Thermo Fischer Scientific	S375-500
SoftMax Pro	Molecular Devices	N/A	SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License
Sterile filter units	Thermo Fischer Scientific	09-