Method Article

Bepaling van in vitro en cellulaire inschakelkinetiek voor fluorogene RNA-aptameren

DOI:

10.3791/64367

⸱

August 9th, 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry and Henry Eyring Center for Cell & Genome Science, University of Utah

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol presenteert twee methoden om de kinetiek van de fluorogene RNA-aptameren Spinazie2 en Broccoli te bepalen. De eerste methode beschrijft hoe fluorogene aptamerkinetiek in vitro kan worden gemeten met een platenlezer, terwijl de tweede methode de meting van fluorogene aptamerkinetiek in cellen door flowcytometrie beschrijft.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorogene RNA-aptameren zijn toegepast in levende cellen om RNA's te taggen en te visualiseren, te rapporteren over genexpressie en fluorescerende biosensoren te activeren die niveaus van metabolieten en signaalmoleculen detecteren. Om dynamische veranderingen in elk van deze systemen te bestuderen, is het wenselijk om real-time metingen te verkrijgen, maar de nauwkeurigheid van de metingen hangt af van het feit of de kinetiek van de fluorogene reactie sneller is dan de bemonsteringsfrequentie. Hier beschrijven we methoden om de in vitro en cellulaire turn-on kinetiek voor fluorogene RNA-aptameren te bepalen met behulp van een platenlezer uitgerust met respectievelijk een monsterinjector en een flowcytometer. We tonen aan dat de in vitro kinetiek voor de fluorescentieactivering van de Spinazie2- en Broccoli-aptameren kan worden gemodelleerd als tweefasige associatiereacties en verschillende snelle fasesnelheidsconstanten heeft van respectievelijk 0,56 s−1 en 0,35 s−1. Bovendien tonen we aan dat de cellulaire kinetiek voor de fluorescentieactivering van Spinazie2 in Escherichia coli, die verder wordt beperkt door kleurstofdiffusie in de Gram-negatieve bacteriën, nog steeds voldoende snel is om een nauwkeurige bemonsteringsfrequentie op de minuuttijdschaal mogelijk te maken. Deze methoden om fluorescentieactiveringskinetiek te analyseren zijn van toepassing op andere fluorogene RNA-aptameren die zijn ontwikkeld.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorogene reacties zijn chemische reacties die een fluorescentiesignaal genereren. Fluorogene RNA-aptameren vervullen deze functie meestal door een kleine molecuulkleurstof te binden om de fluorescentie-kwantumopbrengst te verbeteren (figuur 1A)1. Verschillende fluorogene RNA aptamer systemen zijn ontwikkeld en bestaan uit specifieke RNA aptamer sequenties en de bijbehorende kleurstof liganden1. Fluorogene RNA-aptameren zijn toegevoegd aan RNA-transcripten als fluorescerende tags die live cell imaging van mRNA's en niet-coderende RNA'smogelijk maken

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. In vitro kinetisch experiment

  1. Voorbereiding van DNA-sjablonen door PCR
    1. PCR-reactie(s) instellen: Om PCR-reacties voor te bereiden, combineert u de volgende reagentia in een dunwandige PCR-buis:
      33 μL dubbel gedestilleerd water (ddH2O)
      10 μL 5x buffer voor high-fidelity DNA polymerase
      5 μL van 2 mM per desoxyribonucleosidetrifosfaat (dNTP)
      0,5 μL van 40 μM voorwaartse primer
      0,5 μL omgekeerde primer van 40 μM
      0,5 μL (10-100 ng) DNA-sjabloon (alleen voor Spinazie2 PCR; Broccoli primers overlappen elkaar)
      0,5 μL high-fidelity DNA polymerase (laatste toevoegen)
      OPMERKING: Synthetische oligonu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro kinetiek
De sequenties van de DNA-sjablonen en primers, die worden gekocht als synthetische oligonucleotiden, zijn weergegeven in tabel 2 en de reagensrecepten worden weergegeven in aanvullend bestand 1. PCR-amplificatie wordt gebruikt om de hoeveelheid DNA-sjabloon op te schalen met de T7-promotor, die nodig is voor de daaropvolgende in vitro transcriptie (IVT) -reactie. Bovendien kan PCR-amplificatie voor twee doeleinden i.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor het in vitro kinetische experiment kan hetzelfde algemene protocol worden gewijzigd om de in vitro kinetiek te meten van een op RNA gebaseerde fluorescerende biosensor die zowel een ligandbindend als fluorofoorbindend domein bevat8. In dit geval moet het RNA worden geïncubeerd met de fluorofoor voorafgaand aan metingen bij het injecteren van het ligand om ligandresponskinetiek te verkrijgen. Als er een hoge variabiliteit wordt waargenomen tussen de replicaties, kan men probl.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies aan MCH: NSF-BSF 1815508 en NIH R01 GM124589. MRM werd gedeeltelijk ondersteund door opleidingsbeurs NIH T32 GM122740.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseThermo Fischer ScientificBP160500
Agarose gel electrophoresis equipmentThermo Fischer ScientificB1A-BP
Alpha D-(+)-lactose monohydrateThermo Fischer Scientific18-600-440
Amber 1.5 mL microcentrifuge tubesThermo Fischer Scientific22431021
Ammonium persulfate (APS)Sigma-AldrichA3678
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)Sigma-AldrichA4418
Attune NxT Flow cytometerThermo Fischer ScientificA24861
Attune 1x Focusing FluidThermo Fischer ScientificA24904
Attune Shutdown SolutionThermo Fischer ScientificA24975
Attune Performance Tracking BeadsThermo Fischer Scientific4449754
Attune Wash SolutionThermo Fischer Scientific J24974
Boric acidSigma-AldrichB6768
Bromophenol blueSigma-AldrichB0126
Carbenicillin disodium saltSigma-AldrichC3416
Chlorine BleachAmazonB07J6FJR8D
Corning Costar 96-well plateDaigger ScientificEF86610A
Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position capGlobe Scientific05-402-31
DFHBISigma-AldrichSML1627
DFHBI-1TSigma-AldrichSML2697
D-Glucose (anhydrous)Acros OrganicsAC410955000
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Dithiothreitol (DTT)Sigma-AldrichDTT-RO
DNA loading dyeNew England BiolabsB7025S
DNA LoBind Tubes (2.0 mL)Eppendorf22431048
dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTPNew England BiolabsN0446S
EDTA, pH 8.0Gibco, Life TechnologiesAM9260G
Ethanol (EtOH)Sigma-AldrichE7023
Filter-tip micropipettor tipsThermo Fischer ScientificAM12635, AM12648, AM12655, AM12665
FlowJo SoftwareBD BiosciencesN/AFlowJo v10 Software
Fluorescent plate reader with heating controlVWR10014-924
Gel electrophoresis power supplyThermo Fischer ScientificEC3000XL2
GlycerolSigma-AldrichG5516
Glycogen AM95010Thermo Fischer ScientificAM95010
GraphPad PrismDotmaticsN/AAnalysis software from Academic Group License 
Heat block Thomas Scientific1159Z11
HEPESSigma-AldrichH-4034
Inorganic pyrophosphataseSigma-AldrichI1643-500UN
Low Molecular Weight DNA LadderNew England BiolabsN3233LSupplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025).
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2)Sigma-AldrichM2670
Magnesium sulfate (MgSO4)Fisher ScientificMFCD00011110
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)Eppendorf22363204
Microcentrifuge with temperature controlMarshall ScientificEP-5415R
MicropipettorsGilsonFA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M
Micropipettor tipsSigma-AldrichZ369004, AXYT200CR, AXYT1000CR
Millipore water filter with BioPak unitSigma-AldrichCDUFBI001, ZRQSVR3WW
Narrow micropipettor pipette tipsDOT ScientificRN005R-LRS
PBS, 10xThermo Fischer ScientificBP39920
PCR clean-up kitQiagen28181
PCR primers and templatesIntegrated DNA technologies
PCR thermocycler for thin-walled PCR tubesBio-Rad1851148
PCR thermocycler for 0.5 mL tubesTechne5PRIME/C
pET31b-T7-Spinach2 PlasmidAddgenePlasmid #79783
Phusion High-Fidelity DNA polymerase New England BiolabsM0530LPurchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions.
Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. ScientificC.B.S. ScientificVGC-1508
Polyacrylamide gel electrophoresis equipmentC.B.S. ScientificASG-250
Potassium chloride (KCl)Sigma-AldrichP9333
Potassium phosphate monobasicSigma-AldrichP5655
Razor bladesGenesee Scientific38-101
rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTPNew England BiolabsN0450L
SDSSigma-AldrichL3771
Short wave UV light sourceThermo Fischer Scientific11758221
Sodium carbonate (Na2CO3)Sigma-AldrichS7795
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS7653
Sodium hydroxide (NaOH)Sigma-AldrichS8045
Sodium phosphate dibasic, anhydrousThermo Fischer ScientificS375-500
SoftMax ProMolecular DevicesN/ASoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License
Sterile filter unitsThermo Fischer Scientific09-741-88
SucroseSigma-AldrichS0389
SYBR Safe DNA gel stainThermo Fischer ScientificS33102
TAE buffer for agarose gel electrophoresisThermo Fischer ScientificAM9869
Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma-AldrichT9281
Tris baseSigma-AldrichTRIS-RO
Tryptone (granulated)Thermo Fischer ScientificM0251S
T7 RNA polymeraseNew England BiolabsM0251S
Urea-PAGE Gel system National DiagnosticsEC-833
UV fluorescent TLC plateSigma-Aldrich1.05789.0001
UV/Vis spectrophotometerThermo Fischer ScientificND-8000-GL
Vortex mixerThermo Fischer Scientific2215415
Xylene cyanolSigma-AldrichX4126
Yeast Extract (Granulated)Thermo Fischer ScientificBP9727-2

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Su, Y., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs. Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).
  2. Zhang, J., et al. Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorogenic RNA AptamersTurn On KineticsIn Vitro KineticsCellular KineticsFluorescence ActivationPlate ReaderFlow CytometrySpinach2 AptamerBroccoli AptamerRNA Based Biosensors

Related Articles