Het protocol presenteert twee methoden om de kinetiek van de fluorogene RNA-aptameren Spinazie2 en Broccoli te bepalen. De eerste methode beschrijft hoe fluorogene aptamerkinetiek in vitro kan worden gemeten met een platenlezer, terwijl de tweede methode de meting van fluorogene aptamerkinetiek in cellen door flowcytometrie beschrijft.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bepaling van in vitro en cellulaire inschakelkinetiek voor fluorogene RNA-aptameren
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Fluorogene RNA-aptameren zijn toegepast in levende cellen om RNA's te taggen en te visualiseren, te rapporteren over genexpressie en fluorescerende biosensoren te activeren die niveaus van metabolieten en signaalmoleculen detecteren. Om dynamische veranderingen in elk van deze systemen te bestuderen, is het wenselijk om real-time metingen te verkrijgen, maar de nauwkeurigheid van de metingen hangt af van het feit of de kinetiek van de fluorogene reactie sneller is dan de bemonsteringsfrequentie. Hier beschrijven we methoden om de in vitro en cellulaire turn-on kinetiek voor fluorogene RNA-aptameren te bepalen met behulp van een platenlezer uitgerust met respectievelijk een monsterinjector en een flowcytometer. We tonen aan dat de in vitro kinetiek voor de fluorescentieactivering van de Spinazie2- en Broccoli-aptameren kan worden gemodelleerd als tweefasige associatiereacties en verschillende snelle fasesnelheidsconstanten heeft van respectievelijk 0,56 s−1 en 0,35 s−1. Bovendien tonen we aan dat de cellulaire kinetiek voor de fluorescentieactivering van Spinazie2 in Escherichia coli, die verder wordt beperkt door kleurstofdiffusie in de Gram-negatieve bacteriën, nog steeds voldoende snel is om een nauwkeurige bemonsteringsfrequentie op de minuuttijdschaal mogelijk te maken. Deze methoden om fluorescentieactiveringskinetiek te analyseren zijn van toepassing op andere fluorogene RNA-aptameren die zijn ontwikkeld.
Inleiding
Fluorogene reacties zijn chemische reacties die een fluorescentiesignaal genereren. Fluorogene RNA-aptameren vervullen deze functie meestal door een kleine molecuulkleurstof te binden om de fluorescentie-kwantumopbrengst te verbeteren (figuur 1A)1. Verschillende fluorogene RNA aptamer systemen zijn ontwikkeld en bestaan uit specifieke RNA aptamer sequenties en de bijbehorende kleurstof liganden1. Fluorogene RNA-aptameren zijn toegevoegd aan RNA-transcripten als fluorescerende tags die live cell imaging van mRNA's en niet-coderende RNA'smogelijk maken
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. In vitro kinetisch experiment
- Voorbereiding van DNA-sjablonen door PCR
- PCR-reactie(s) instellen: Om PCR-reacties voor te bereiden, combineert u de volgende reagentia in een dunwandige PCR-buis:
33 μL dubbel gedestilleerd water (ddH2O)
10 μL 5x buffer voor high-fidelity DNA polymerase
5 μL van 2 mM per desoxyribonucleosidetrifosfaat (dNTP)
0,5 μL van 40 μM voorwaartse primer
0,5 μL omgekeerde primer van 40 μM
0,5 μL (10-100 ng) DNA-sjabloon (alleen voor Spinazie2 PCR; Broccoli primers overlappen elkaar)
0,5 μL high-fidelity DNA polymerase (laatste toevoegen)
OPMERKING: Synthetische oligonu....
- PCR-reactie(s) instellen: Om PCR-reacties voor te bereiden, combineert u de volgende reagentia in een dunwandige PCR-buis:
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In vitro kinetiek
De sequenties van de DNA-sjablonen en primers, die worden gekocht als synthetische oligonucleotiden, zijn weergegeven in tabel 2 en de reagensrecepten worden weergegeven in aanvullend bestand 1. PCR-amplificatie wordt gebruikt om de hoeveelheid DNA-sjabloon op te schalen met de T7-promotor, die nodig is voor de daaropvolgende in vitro transcriptie (IVT) -reactie. Bovendien kan PCR-amplificatie voor twee doeleinden i.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Voor het in vitro kinetische experiment kan hetzelfde algemene protocol worden gewijzigd om de in vitro kinetiek te meten van een op RNA gebaseerde fluorescerende biosensor die zowel een ligandbindend als fluorofoorbindend domein bevat8. In dit geval moet het RNA worden geïncubeerd met de fluorofoor voorafgaand aan metingen bij het injecteren van het ligand om ligandresponskinetiek te verkrijgen. Als er een hoge variabiliteit wordt waargenomen tussen de replicaties, kan men probl.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies aan MCH: NSF-BSF 1815508 en NIH R01 GM124589. MRM werd gedeeltelijk ondersteund door opleidingsbeurs NIH T32 GM122740.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Agarose | Thermo Fischer Scientific | BP160500 | |
| Agarose gel electrophoresis equipment | Thermo Fischer Scientific | B1A-BP | |
| Alpha D-(+)-lactose monohydrate | Thermo Fischer Scientific | 18-600-440 | |
| Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | 22431021 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| Attune NxT Flow cytometer | Thermo Fischer Scientific | A24861 | |
| Attune 1x Focusing Fluid | Thermo Fischer Scientific | A24904 | |
| Attune Shutdown Solution | Thermo Fischer Scientific | A24975 | |
| Attune Performance Tracking Beads | Thermo Fischer Scientific | 4449754 | |
| Attune Wash Solution | Thermo Fischer Scientific | J24974 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C3416 | |
| Chlorine Bleach | Amazon | B07J6FJR8D | |
| Corning Costar 96-well plate | Daigger Scientific | EF86610A | |
| Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap | Globe Scientific | 05-402-31 | |
| DFHBI | Sigma-Aldrich | SML1627 | |
| DFHBI-1T | Sigma-Aldrich | SML2697 | |
| D-Glucose (anhydrous) | Acros Organics | AC410955000 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| DNA loading dye | New England Biolabs | B7025S | |
| DNA LoBind Tubes (2.0 mL) | Eppendorf | 22431048 | |
| dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP | New England Biolabs | N0446S | |
| EDTA, pH 8.0 | Gibco, Life Technologies | AM9260G | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Filter-tip micropipettor tips | Thermo Fischer Scientific | AM12635, AM12648, AM12655, AM12665 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | N/A | FlowJo v10 Software |
| Fluorescent plate reader with heating control | VWR | 10014-924 | |
| Gel electrophoresis power supply | Thermo Fischer Scientific | EC3000XL2 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycogen AM95010 | Thermo Fischer Scientific | AM95010 | |
| GraphPad Prism | Dotmatics | N/A | Analysis software from Academic Group License |
| Heat block | Thomas Scientific | 1159Z11 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma-Aldrich | I1643-500UN | |
| Low Molecular Weight DNA Ladder | New England Biolabs | N3233L | Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025). |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher Scientific | MFCD00011110 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
| Microcentrifuge with temperature control | Marshall Scientific | EP-5415R | |
| Micropipettors | Gilson | FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M | |
| Micropipettor tips | Sigma-Aldrich | Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR | |
| Millipore water filter with BioPak unit | Sigma-Aldrich | CDUFBI001, ZRQSVR3WW | |
| Narrow micropipettor pipette tips | DOT Scientific | RN005R-LRS | |
| PBS, 10x | Thermo Fischer Scientific | BP39920 | |
| PCR clean-up kit | Qiagen | 28181 | |
| PCR primers and templates | Integrated DNA technologies | ||
| PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes | Bio-Rad | 1851148 | |
| PCR thermocycler for 0.5 mL tubes | Techne | 5PRIME/C | |
| pET31b-T7-Spinach2 Plasmid | Addgene | Plasmid #79783 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530L | Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions. |
| Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific | C.B.S. Scientific | VGC-1508 | |
| Polyacrylamide gel electrophoresis equipment | C.B.S. Scientific | ASG-250 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Razor blades | Genesee Scientific | 38-101 | |
| rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP | New England Biolabs | N0450L | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Short wave UV light source | Thermo Fischer Scientific | 11758221 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Thermo Fischer Scientific | S375-500 | |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License |
| Sterile filter units | Thermo Fischer Scientific | 09- |
Referenties
- Su, Y., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs. Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).
- Zhang, J., et al. Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
