Methodenartikel

Identificatie en isolatie van burst-forming unit en kolonievormende eenheid Erytroïde voorlopers uit muizenweefsel door flowcytometrie

3.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64373

⸱

4 november 2022

 ,  ,  , 
1Department of Molecular, Cell and Cancer Biology, UMASS Chan Medical School

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een nieuwe flowcytometrische methode voor prospectieve isolatie van vroege burst-forming unit erythroid (BFU-e) en kolonievormende unit erythroid (CFU-e) voorlopers rechtstreeks uit vers beenmerg en milt van muizen. Dit protocol, ontwikkeld op basis van eencellige transcriptomische gegevens, is het eerste dat alle erytroïde voorlopercellen van het weefsel met een hoge zuiverheid isoleert.

Samenvatting

Vroege erytroïde voorlopers werden oorspronkelijk gedefinieerd door hun kolonievormende potentieel in vitro en ingedeeld in burst-vormende en kolonievormende "eenheden" bekend als BFU-e en CFU-e. Tot voor kort waren methoden voor de directe prospectieve en volledige isolatie van zuivere BFU-e en CFU-e voorlopers uit vers geïsoleerd volwassen muizenbeenmerg niet beschikbaar. Om deze kloof aan te pakken, werd een eencellige RNA-seq (scRNAseq) dataset van het beenmerg van muizen geanalyseerd op de expressie van genen die coderen voor celoppervlakmarkers. Deze analyse werd gecombineerd met cel lot assays, waardoor de ontwikkeling van een nieuwe flowcytometrische benadering mogelijk werd die volledige en zuivere subsets van BFU-e en CFU-e voorlopers in het beenmerg of de milt van muizen identificeert en mogelijk maakt. Deze benadering identificeert ook andere voorlopersubsets, waaronder subsets verrijkt voor basofielen / mestcellen en megakaryocytische potentialen. De methode bestaat uit het labelen van verse beenmerg- of miltcellen met antilichamen gericht op Kit en CD55. Voorlopers die beide markers uitdrukken, worden vervolgens onderverdeeld in vijf hoofdpopulaties. Populatie 1 (P1 of CFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71med/high) bevat alle CFU-e voorlopers en kan verder worden onderverdeeld in respectievelijk P1-low (CD71med CD150high) en P1-hi (CD71high CD150low), overeenkomend met respectievelijk vroege en late CFU-e; Populatie 2 (P2 of BFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71low CD150high) bevat alle BFU-e voorlopers; Populatie P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150low CD41low) is verrijkt voor basofiele/mestcelvoorlopers; Populatie 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150high CD41+) is verrijkt voor megakaryocytische voorlopers; en Populatie 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150high CD41-) bevat voorlopers met erytroïde, basofiele/mestcel en megakaryocytisch potentieel (EBMP) en erytroïde/ megakaryocytische/ basofiel-bevooroordeelde multipotentiële voorlopers (MPP's). Deze nieuwe benadering maakt een grotere precisie mogelijk bij het analyseren van erytroïde en andere hematopoëtische voorlopers en maakt ook verwijzing naar transcriptoominformatie mogelijk voor elke flowcytometrisch gedefinieerde populatie.

Inleiding

Erytropoëse kan worden onderverdeeld in twee hoofdfasen: vroege erytropoëse en erytroïde terminale differentiatie (figuur 1)1,2,3. In vroege erytropoëse binden hematopoëtische stamcellen zich aan de erytroïde afstamming en geven ze aanleiding tot vroege erytroïde voorlopers, die voor het eerst werden geïdentificeerd in de jaren 1970 op basis van hun kolonievormend potentieel in halfvast medium 4,5,6,7,8,9 . In grote lijnen zijn erytroïde voorlopers verdeeld in twee categorieën: eerdere voorlopercellen die elk aanleiding geven tot een "burst" (een groot aggregaat van kleinere erytroïde celclusters), genaamd "burst-forming unit erythroid" of BFU-e 4,5,6; en hun nakomelingen, die elk een enkele, kleine erytroïde celcluster of kolonie vormen, genaamd "kolonievormende eenheid erytroïde" of CFU-e 7,8,9. BFU-e en CFU-e brengen nog geen terminale erytroïde genen tot expressie en zijn morfologisch niet herkenbaar. Na een aantal zelfvernieuwings- of expansieceldelingen ondergaat de CFU-e een transcriptionele schakelaar waarbij erytroïde genen zoals globines worden geïnduceerd, waardoor deze overgaat in erytroïde terminale differentiatie (ETD)1,10. Tijdens ETD ondergaan erytroblasten drie tot vijf rijpingsceldelingen voordat ze enucleeren om reticulocyten te vormen, die rijpen tot rode bloedcellen.

Erytroblasten tijdens terminale differentiatie werden oorspronkelijk geclassificeerd op basis van hun morfologie in proerytroblasten, basofiele, polychromatische en orthochromatische. De komst van flowcytometrie maakte hun prospectieve sortering en isolatie mogelijk op basis van celgrootte (gemeten door voorwaartse spreiding, FSC) en twee celoppervlakmarkers, CD71 en Ter11911,12,13 (figuur 1). Deze en soortgelijke flowcytometrische benaderingen14 hebben een revolutie teweeggebracht in het onderzoek naar de moleculaire en cellulaire aspecten van ETD, waardoor ontwikkelingsstadiumspecifieke analyse van erytroblasten in vivo en in vitro 10,15,16,17,18,19,20 mogelijk is. De CD71/Ter119-benadering wordt nu routinematig gebruikt bij de analyse van erytroïde precursoren.

Tot voor kort is een vergelijkbare, toegankelijke flowcytometrische benadering voor directe, zeer zuivere prospectieve isolatie van CFU-e en BFU-e uit muizenweefsel onderzoekers ontgaan. In plaats daarvan hebben onderzoekers flowcytometrische strategieën gebruikt die slechts een fractie van deze voorlopers isoleren, vaak in de aanwezigheid van niet-erytroïde cellen die co-zuiveren binnen dezelfde flowcytometrische subsets21. Bijgevolg was het onderzoek van BFU-e en CFU-e beperkt tot in vitro differentiatiesystemen die BFU-e en CFU-e afleiden en versterken van eerdere beenmergvoorlopers. Het is dan mogelijk om flowcytometrische strategieën toe te passen die CFU-e onderscheiden van BFU-e in deze erytroïde voorloperverrijkte culturen22,23. Een alternatieve benadering maakt gebruik van foetale CFU-e en BFU-e, die sterk verrijkt zijn in de Ter119-negatieve fractie van de foetale lever van de muis halverwege de zwangerschap 10,24,25. Geen van deze benaderingen maakt echter het onderzoek van volwassen BFU-e en CFU-e in hun fysiologische toestand in vivo mogelijk. De omvang van de uitdaging kan worden gewaardeerd wanneer eraan wordt herinnerd dat, op basis van kolonievormingstests, deze cellen aanwezig zijn in het volwassen beenmerg met een frequentie van respectievelijk slechts 0,025% en 0,3%6.

Het hier beschreven protocol is een nieuwe flowcytometrische benadering op basis van eencellige transcriptomische analyse van vers geoogste Kit+ beenmergcellen van muizen (Kit wordt uitgedrukt door alle vroege voorloperpopulaties van het beenmerg)1. Onze aanpak bevat enkele celoppervlakmarkers die al in gebruik waren door Pronk et al.21,26. Eencellige transcriptomen werden gebruikt om combinaties van celoppervlakmarkers te bepalen die erytroïde en andere vroege hematopoëtische voorlopercellen identificeren (figuur 2). In het bijzonder kan de CD55+ fractie van lineage-negatieve (Lin-) Kit+ cellen worden onderverdeeld in vijf populaties, waarvan er drie aaneengesloten segmenten van het erytroïde traject opleveren (figuur 2). De transcriptomische identiteiten van elk van deze populaties werden bevestigd door sortering, gevolgd door scRNAseq en projectie van de gesorteerde eencellige transcriptomen terug op de oorspronkelijke transcriptomische kaart (de genexpressie in elk van de vijf populaties en de volledige beenmergdataset kan worden onderzocht in https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . Het potentieel van het lot van elk van de populaties werd bevestigd met behulp van traditionele kolonievormingstests (figuur 2), evenals een nieuwe high-throughput single-cell fate assay 1,27. Deze analyses tonen aan dat de nieuwe flowcytometrische benadering resulteert in een zeer zuivere isolatie van alle BFU-e en CFU-e voorlopers van vers volwassen beenmerg en milt. In het bijzonder bevat populatie 1 (P1) alleen CFU-e en geen andere hematopoëtische voorlopers, en populatie 2 (P2) bevat alle BFU-e-voorlopers van het beenmerg en een klein aantal CFU-e, maar geen andere voorlopers1. Het gedetailleerde protocol hieronder wordt verder geïllustreerd met een voorbeeldexperiment bij muizen die werden geïnjecteerd met een zoutoplossing of met het erytropoësestimulerend hormoon erytropoëtine (Epo).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de dierprotocollen A-1586 en 202200017 goedgekeurd door de Chan Medical School Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Massachusetts.

OPMERKING: Twee protocollen worden hier beschreven: ten eerste, flowcytometrische analyse (sectie 1), gevolgd door protocolaanpassingen voor flowcytometrische sortering (sectie 2). Het onderstaande protocol maakt gebruik van een flowcytometer/sorteerder met 10 kanalen. Een voorbeeldopstelling is te vinden in tabel 1, waarnaar wordt verwezen in stap 1.14.5. Het is ook mogelijk om dit protocol met slechts negen kanalen uit te voeren; zie de legenda in tabel 2.

1. Flowcytometrische analyse

  1. Euthanasie volwassen (>6 weken oud) Balb/C- of C57BL6-muizen met behulp van een geschikte methode die is goedgekeurd door uw Institutional Animal Care and Use Committee (bijv. CO 2-inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie). Voor flowcytometrische analyse is beenmerg (BM) van een enkele muis voldoende. Voor het sorteren is het aantal muizen afhankelijk van de downstream-toepassingen. De celopbrengst voor elke populatie wordt hieronder gegeven (stap 2.3.3).
  2. Weefseloogst:
    1. Bereid 5 ml fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) buizen met 3 ml koude (4 °C) kleuringsbuffer ("SB5": fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), 0,2% runderserumalbumine (BSA), 0,08% glucose, 5 mM EDTA) op ijs. Gebruik dit om geoogste weefsels te plaatsen.
    2. Bereid afzonderlijke buizen voor elk weefsel dat van elke muis is ontleed. Pool geen weefsels van meerdere muizen.
    3. Oogst zowel dijbenen als beide tibia's. Verwijder alle spieren van de botten voordat u ze in de buis plaatst met SB5.
    4. Ontleed de milt via een incisie aan de linkerkant van de buik.
  3. Beenmergcelextractie:
    1. Plaats de vers ontlede dijbenen en tibia's direct in koude kleuringsbuffer (SB5) en houd de buisjes op ijs totdat ze klaar zijn om het beenmerg (BM) te extraheren. Leg een schone gesteriliseerde mortel op ijs in een emmer. Breng de botten over op de mortel samen met de SB5 uit de buis.
    2. Knip ongeveer 1 mm van de uiteinden van elk bot af met een dissectieschaar, zodat de opening van het bot net zichtbaar wordt.
    3. Gebruik een naald van 26 G en een spuit van 3 ml gevuld met SB5 om het merg uit de botten te spoelen en in de mortel te verzamelen. Herhaal het proces 3-5 keer met behulp van een nieuwe buffer elke keer totdat de botten kleurloos lijken.
    4. Filter het gespoelde merg door een 100μm mesh filter en verzamel de cellen in een 50 ml centrifugebuis die op ijs is geplaatst.
    5. Gebruik de vijzel en stamper om de gespoelde botten in 5-10 ml SB5 te verpletteren. Filtreer het mengsel van gemalen botten en buffer door de 100 μm celzeef en pool met cellen verzameld in stap 1.3.4.
  4. Miltcelextractie:
    1. Plaats een 100 μm mesh filter op een lege 50 ml centrifuge buis geplaatst op ijs. Plaats een enkele milt op het gaasfilter.
    2. Voeg 0,5-1 ml SB5 toe aan de milt om ervoor te zorgen dat deze niet droogt.
    3. Gebruik de rubberen kant van een 3 ml of 5 ml spuitzuiger en pureer de milt door het gaas. Voeg meer SB5 toe, 5 ml per keer, en blijf pureren totdat alle cellen in de buis zijn verzameld.
  5. Vanaf dit punt worden het beenmerg en de miltcellen op dezelfde manier behandeld.
  6. Draai de cellen af bij 900 x g, 4 °C gedurende 10 minuten. Aspirateer het supernatant met behulp van een vacuümaspiratie-opstelling.
  7. Om een eencellige suspensie te maken, resuspenseert u de cellen in 2 ml SB5 en pipet u 50 keer op en neer met behulp van een P1000 met een grote openingpunt (zie Materiaaltabel). Deze hebben brede tipopeningen om schade aan fragiele cellen te voorkomen.
  8. Om de cellen te tellen, resuspendeer je door 20 keer op en neer te pipetteren. Verdun de cellen in een verhouding van 1:100 in SB5. Meng 10 μL van de verdunde cellen met 10 μL trypan blue en tel op een hemocytometer en/of celteller.
  9. Draai de cellen af bij 900 x g, 4 °C gedurende 10 minuten. Aspirateer het supernatant en resuspendeer de cellen op 33 x 106 levende cellen / ml in SB5.
  10. Bereid de Lin-FITC-cocktail door gelijke volumes van elk antilichaam in tabel 3 te mengen.
  11. Bereid de cellen voor op besturingselementen voor één kleur en FMO-besturingselementen (Fluorescentie minus één). Voer stap 1.11-1.12 uit parallel met de bereiding en kleuring van de monstercellen in stap 1.14 (monsters voor flowcytometrische analyse) en/of stap 2.1 (flowcytometrische sortering).
    1. Bereid de cellen voor op een niet-gekleurde celcontrole door 50 μL (1,6 x 106 cellen) van de celsuspensie over te brengen in een FACS-buis op ijs. Bereid de cellen voor op elke afzonderlijke kleurcontrole (11 buizen) door 50 μL (1,6 x 106 cellen) van de celsuspensie over te brengen in een FACS-buis op ijs.
    2. Bereid FMO-besturingselementen voor op de volgende kleuren (Kit, CD41, CD150, CD49f [vier buizen]) door 300 μL (10 x 106 cellen) van de celsuspensie over te brengen in een afzonderlijke FACS-buis op ijs.
    3. Draai de cellen op 900 x g, 4 °C gedurende 10 minuten en adem het supernatant op.
  12. Antilichaamkleuring van FMO's en controles met één kleur
    1. Kleur de FMO's op 33 x 106 cellen/ml (in een totaal volume van 300 μL) in FACS-buizen. Voeg voor elke controle alle antilichamen toe, behalve het gelijknamige antilichaam van de FMO. Laat bijvoorbeeld voor de Kit FMO het Kit-antilichaam weg. Gebruik voor elk antilichaam de verdunning en de eindconcentratie zoals in tabel 2.
    2. Kleur de enkele kleurregelaars op 20 x 106 cellen / ml (in een totaal volume van 50 μL) in FACS-buizen; voeg voor elke controle één antilichaam toe in de in tabel 2 vermelde concentratie.
    3. Vortex elke controlebuis voor 2-3 s bij 3.000 tpm (rotaties per minuut), en incubeer vervolgens bij 4 ° C, schommelend gedurende 2,5 uur in het donker, beschermd tegen licht. Schommel de buizen met een rotatieas evenwijdig aan de lengte van de buis, tussen ongeveer een hoek van 10° en 60° vanaf het horizontale vlak, zodat de inhoud de dop niet raakt.
    4. Was de cellen met SB5: Vul het volume van de celsuspensie aan op 4 ml met SB5. Draai de cellen af op 900 x g, 4 °C gedurende 10 minuten, en adem het supernatant op.
  13. Cel resuspensie:
    1. Resuspendeer de niet-gekleurde en alle enkele kleurregelaars (behalve de DAPI-regeling) in 300 μL SB5 en filter door een filtergaas van 40 μm in een nieuwe FACS-buis.
    2. Maak een DAPI/SB5-oplossing door de DAPI-voorraad (1 mg/ml in 100% ethanol) te verdunnen bij 1:10.000 in SB5.
    3. Resuspendeer de FMO's in 1,8 ml DAPI/SB5 en filter door een filtergaas van 40 μm in een nieuwe FACS-buis
    4. Resuspendeer de DAPI single color control in 300 μL DAPI/SB5 en filter door een 40 μm filter mesh in een nieuwe 4 mL FACS buis.
  14. Monstervoorbereiding: Als de cellen worden voorbereid voor flowcytometrische analyse, gaat u naar stap 1.14. Als u de cellen voorbereidt voor het sorteren, gaat u verder met stap 2.1.
  15. Kleur de flowcytometrische analysemonsters op 33 x 106 cel/ml in een totaal volume van 300 μL (10 x 106 cellen) in FACS-buizen:
    1. Bereid de antilichaam master mix. Bepaal het volume van de mastermix door het aantal monsters, met 300 μL per monster. Maak de mastermix door alle in tabel 2 vermelde antilichamen te verdunnen bij de aangegeven verdunning in SB5. De Rabbit IgG in de mastermix dient als Fc-blok.
    2. Vortex elke buis voor 2-3 s bij 3.000 tpm, en incubeer vervolgens bij 4 ° C, schommelend gedurende 2,5 uur in het donker, beschermd tegen licht.
    3. Was de cellen met SB5: Vul het volume van de celsuspensie aan op 4 ml met SB5. Draai de cellen af op 900 x g, 4 °C gedurende 10 minuten, en adem het supernatant op.
    4. Resuspensie van de monsters voor flowcytometrische analyse in 1,8 ml DAPI/SB5 zoals bereid in stap 1.12.5.2 en filter door een filtergaas van 40 μm in een FACS-buis.
    5. Analyseer de monsters op een cytometer met 10 kanalen om de antilichaamconjugaten in tabel 2 en de levensvatbaarheidskleurstof DAPI te accommoderen. Tabel 1 geeft een voorbeeld van de kanaalopstelling. Het is ook mogelijk om slechts negen kanalen te gebruiken; zie de legenda van tabel 2 .
    6. Gebruik tijdens de analyse van de flowcytometriegegevens standaard spectrale compensatiebenaderingen met behulp van de enkele kleurregelaars en FMO-controles zoals beschreven in stap 2.4.

2. Protocolaanpassingen voor flowcytometrisch sorteren

  1. Bereiding van Lin-
    1. Pool alle geëxtraheerde cellen uit hetzelfde weefsel (BM of milt) van 10 muizen in een buis van 50 ml. Resuspendeer elk gepoold monster door te pipetteren met behulp van een P1000 met een grote openingpunt.
    2. Draai de cellen op 900 x g, 4 °C gedurende 10 minuten en adem het supernatant op.
    3. Bereid besturingselementen voor één kleur en FMO voor zoals beschreven in sectie 1 met behulp van niet-verrijkte cellen.
    4. Verrijk Lin-cellen voor sortering met behulp van magnetische kraalverrijking van Lin-cellen :
    5. Resuspensieer de cellen op 1 x 108 cellen / ml met SB5 en breng ze over naar een buis van 15 ml. Voeg normaal rattenserum en de in tabel 4 vermelde gebiotinyleerde antilichamen toe en incubeer gedurende 1 uur met schommelen bij 4 °C.
    6. Draai de cellen af op 900 x g, 4 °C gedurende 10 minuten en adem het supernatant op. Resuspendeer de cellen in 15 ml koude SB5.
    7. Draai de cellen af op 900 x g, 4 °C gedurende 10 minuten en adem het supernatant op. Resuspendeer de cellen op 1 x 108 cellen / ml in koude SB5 en houd ze op ijs.
    8. Vortex de magnetische nanokralen bij 3.000 rpm voor 5-10 s. Neem 1 ml magnetische nanokralen voor elke 10 ml cellen.
    9. Was de nanokralen in een FACS-buis van 5 ml. Vul het volume aan tot 4 ml met SB5, draai op 900 x g, 4 °C gedurende 5 minuten en adem het supernatant op.
    10. Resuspenseer de nanokralen in 500 μL SB5 en meng met de cellen bereid in stap 2.1.7. Incubeer bij 4 °C met schommelen gedurende 15 min.
    11. Draai de cellen af op 900 x g, 4 °C gedurende 10 minuten en adem het supernatant op. Resuspendeer de cellen op 1 x 108 cellen /ml met SB5.
    12. Plaats de buis op een magneet bij 4 °C gedurende 5 min.
    13. Giet het supernatant voorzichtig in een nieuwe buis van 15 ml.
    14. Plaats de buis met het supernatant uit stap 2.1.13 gedurende 5 minuten op een magneet bij 4 °C. Giet het supernatant voorzichtig in een nieuwe buis van 15 ml.
    15. Draai de cellen van het supernatant in stap 2.1.14 bij 900 x g, 4 °C gedurende 10 minuten en adem het supernatant op.
    16. Resuspendeer de Lin-verrijkte cellen in 1 ml SB5.
    17. Verdun 10 μL van de cellen op 1:100 in SB5. Meng 10 μL van de verdunde cellen met 10 μL trypan blue en tel op een hemocytometer en/of celteller.
    18. Op basis van het aantal cellen in stap 2.1.17, resuspendeer de Lin-verrijkte cellen op 33 x 106 cellen / ml.
  2. Kleuring van verrijkte cellen:
    1. Kleur de verrijkte celmonsters op 33 x 106 cellen/ml in FACS-buizen door alle antilichamen toe te voegen die in tabel 2 zijn vermeld. Vortex elke buis voor 2-3 s bij 3.000 tpm, en incubeer vervolgens bij 4 ° C, schommelend gedurende 2,5 uur in het donker, beschermd tegen licht.
    2. Was de cellen met SB5: Vul het volume van de FACS-buizen aan op 4 ml met SB5. Draai de cellen af op 900 x g, 4°C gedurende 10 minuten, en verwijder het supernatant.
    3. Resuspendeer de monsters voor flowcytometrische analyse in 4-6 ml DAPI/SB5 zoals bereid in stap 1.12.5.2 en filter door een filtergaas van 40 μm in een nieuwe FACS-buis van 4 ml.
  3. Sorteren van monsters:
    1. Sorteer de monsters met een groot mondstuk en lage druk om de CFU-e-opbrengst te maximaliseren, omdat CFU-e-cellen gemakkelijk worden beschadigd onder hoge druk. Gebruik voor de flowcytometer die in dit onderzoek wordt gebruikt 14 psi en een 100 μm nozzle of 12 psi met een 130 μm nozzle. Stel de sorteerpoorten in zoals beschreven in stap 2.4 hieronder.
    2. Bereid de verzamelbuffer voor: Voeg 20% foetaal runderserum toe aan PBS.
    3. Om de zuiverheid van de gesorteerde populaties te controleren, voert u een kleine aliquot van elke gesorteerde populatie opnieuw uit in een buffer die DAPI bevat, zoals beschreven in stap 1.12.5.2.
      OPMERKING: Typisch, BM van een totaal van 10 muizen (ongeveer 1 x 109 cellen) levert ten minste 50.000-100.000 cellen op voor elk van de P1-hi, P1-low en P2 populaties met een levensvatbaarheid van ongeveer 70%.
  4. Gebruik de gatingstrategie in figuur 3 voor analyse of het instellen van de sorteerpoorten.
    1. Gebruik de forward-scatter (FSC)-parameter om het vuil te verwijderen op basis van grootte. Gebruik het FSC-hoogte versus FSC-gebied histogram om celaggregaten uit te sluiten en afzonderlijke cellen te selecteren; herhaal met het side-scatter (SSC)-hoogte versus SSC-gebied histogram.
    2. Sluit de dode cellen uit door de cellen die positief zijn voor de DNA-kleurstof DAPI, waarvoor levensvatbare cellen ondoordringbaar zijn, uit te splitsen.
    3. Selecteer Lin-Ter119-Kit+-cellen en selecteer daaruit een subpopulatie die CD55 uitdrukt.
    4. Verdeel de Lin- Ter119-Kit+CD55+ cellen onder in twee hoofdpopulaties, P6 en P7, op basis van de expressie van CD49f en CD105.
    5. Op basis van de expressie van CD150 en CD41, verdeel P6 verder in P3 (basofiele of mestcelvoorlopers), P4 (megakaryocytische voorlopers) en P5 (EBMP en erytroïde-biased MPP).
    6. Op basis van de expressie van CD150 en CD71, verdeel P7 verder in P2 (BFU-e), vroege CFU-e (P1-laag) en late CFU-e (P1-hi).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het protocol beschrijft een flowcytometrische benadering om BFU-es en CFU-es te identificeren in vers geoogst beenmerg- en miltcellen. Het begint met het oogsten van verse BM en milt van muizen en het onmiddellijk op ijs leggen van het weefsel. Alle procedures worden in de kou uitgevoerd om de levensvatbaarheid van de cel te behouden. Cellen worden gelabeld met een "lineage" antilichaamcocktail die de uitsluiting mogelijk maakt van alle cellen die markers van gedifferentieerde bloedlijnen tot expressie brengen (de FITC-L...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het vermogen om BFU-e en CFU-e voorlopers prospectief te isoleren rechtstreeks uit vers weefsel met hoge zuiverheid was eerder onderzoekers ontgaan. Onze nieuwe aanpak, gevalideerd met scRNAseq en cell fate assays 1,27, biedt nu de tools om dit te doen.

Er zijn een aantal belangrijke punten voor het succesvol uitvoeren van zowel de sorteer- als de analytische protocollen. Eerst moeten de cellen worden gesponnen bij 900 x g om ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund door NIH-subsidies R01DK130498, R01DK120639 en R01HL141402

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5 M EDTA, pH 8.0Life Technologies15575020
1000 µL large orifice tipsUSA sceintific1011-9000
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) AntibodyBioLegend131806
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) AntibodyBioLegend105826
Biotin-CD11bBD Biosciences557395M1/70 (clone)
Biotin-CD19BD Biosciences5537841D3 (clone)
Biotin-CD4BD BiosciencesBDB553045RM4-5 (clone)
Biotin-CD8aBD BiosciencesBDB55302953-6.7 (clone)
Biotin-F4/80Biolegend123106BM8 (clone)
Biotin-Ly-6G and Ly-6CBD Biosciences553125RB6-8C5 (clone)
Biotin-TER-119BD Biosciences553672TER-119 (clone)
Bovine Serum AlbuminSigma aldritchA1470
Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f AntibodyBioLegend313624
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 AntibodyBioLegend133921
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) AntibodyBioLegend115931
BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid CellsBD Biosciences563827
ChromPure Rabbit IgG, whole moleculeJackson ImmunoResearch Laboratories011-000-003
DAPI (4'6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Life TechnologiesD1306
Digital DIVA hardware and software for LSR IIBD Biosciences
FITC anti-mouse F4/80 AntibodyBioLegend123108
FITC Rat Anti-CD11bBD Biosciences557396
FITC Rat Anti-Mouse CD19BD Biosciences553785
FITC Rat Anti-Mouse CD4BD Biosciences553047
FITC Rat Anti-Mouse CD8aBD Biosciences553031
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6CBD Biosciences553127
FlowJo software FlowJoversion 10Flow cytometer analysis software
LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzerBD BiosciencesFlow cytometer 
NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle SetAmazon
Normal rat serumStem Cell Technologies13551
PE anti-mouse CD105 AntibodyBioLegend120408
PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 AntibodyBioLegend113812
Phosphate Buffered Saline, 10x SolutionFisher scientificBP3994
Streptavidin NanobeadsBioLegend480016Magnetic beads

Referenties

  1. Tusi, B. K., et al. Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies. Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).
  2. Socolovsky, M. The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing. International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).
  3. Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504(2021).
  4. Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S. Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro. Hemopoiesis in Culture. Robinson, W. A. , National Institutes of Health, US Government Printing Office. (1974).
  5. Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation. Blood. 47 (5), 777-792 (1976).
  6. Iscove, N. N., Sieber, F. Erythroid progenitors in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture. Experimental Hematology. 3 (1), 32-43 (1975).
  7. Gregory, C. J., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: State of differentiation. Journal of Cell Physiology. 81 (3), 411-420 (1973).
  8. Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron. Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).
  9. Gregory, C. J. Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture. Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).
  10. Pop, R., et al. A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression. PLoS Biology. 8 (9), 1000484(2010).
  11. Koulnis, M., et al. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. Journal of Visualized Experiments. (54), e2809(2011).
  12. Liu, Y., et al. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo. Blood. 108 (1), 123-133 (2006).
  13. Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
  14. Chen, K., et al. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17413-17418 (2009).
  15. Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504(2020).
  16. Hidalgo, D., et al. EpoR stimulates rapid cycling and larger red cells during mouse and human erythropoiesis. Nature Communications. 12 (1), 7334(2021).
  17. Porpiglia, E., Hidalgo, D., Koulnis, M., Tzafriri, A. R., Socolovsky, M. Stat5 signaling specifies basal versus stress erythropoietic responses through distinct binary and graded dynamic modalities. PLoS Biology. 10 (8), 1001383(2012).
  18. Koulnis, M., et al. Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways. Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).
  19. Shearstone, J. R., et al. Global DNA demethylation during mouse erythropoiesis in vivo. Science. 334 (6057), 799-802 (2011).
  20. Koulnis, M., Liu, Y., Hallstrom, K., Socolovsky, M. Negative autoregulation by Fas stabilizes adult erythropoiesis and accelerates its stress response. PLoS One. 6 (7), 21192(2011).
  21. Pronk, C. J., et al. Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy. Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).
  22. Dolznig, H., et al. Expansion and differentiation of immature mouse and human hematopoietic progenitors. Methods in Molecular Medicine. 105, 323-344 (2005).
  23. Li, J., et al. Isolation and transcriptome analyses of human erythroid progenitors: BFU-E and CFU-E. Blood. 124 (24), 3636-3645 (2014).
  24. Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: Functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
  25. Flygare, J., Rayon Estrada, V., Shin, C., Gupta, S., Lodish, H. F. HIF1alpha synergizes with glucocorticoids to promote BFU-E progenitor self-renewal. Blood. 117 (12), 3435-3444 (2011).
  26. Pronk, C. J., Attema, J., Rossi, D. J., Sigvardsson, M., Bryder, D. Deciphering developmental stages of adult myelopoiesis. Cell Cycle. 7 (6), 706-713 (2008).
  27. Khoramian Tusi, B., Socolovsky, M. High-throughput single-cell fate potential assay of murine hematopoietic progenitors in vitro. Experimental Hematology. 60, 21-29 (2018).
  28. Erslev, A. J., Caro, J. Erythropoietin titers in response to anemia or hypoxia. Blood Cells. 13 (1-2), 207-216 (1987).
  29. Koury, M. J., Bondurant, M. C. The molecular mechanism of erythropoietin action. European Journal of Biochemistry. 210 (3), 649-663 (1992).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van erythro de progenitorcellenBFU E progenitorenCFU E progenitorenmuizenbeenmergsingle cell suspensieceloppervlaktemarkerscolony assayantilichaamlabelingerytropo tine stimulatie

Gerelateerde artikelen