CRISPR/Cas9-gemedieerde zeer efficiënte gentargeting in embryonale stamcellen voor het ontwikkelen van gen-gemanipuleerde muismodellen

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het ontwikkelen van genetisch gemodificeerde muismodellen met behulp van embryonale stamcellen, vooral voor grote DNA knock-in (KI). Dit protocol is afgestemd met behulp van CRISPR / Cas9-genoombewerking, wat resulteert in een aanzienlijk verbeterde KI-efficiëntie in vergelijking met de conventionele homologe recombinatie-gemedieerde lineaire DNA-targetingmethode.

Samenvatting

Het CRISPR/Cas9-systeem heeft het mogelijk gemaakt om genetisch gemodificeerde muizen te ontwikkelen door directe genoombewerking met behulp van bevruchte zygoten. Hoewel de efficiëntie bij het ontwikkelen van gen-knock-out muizen door het induceren van kleine indelmutatie voldoende zou zijn, is de efficiëntie van embryo-genoombewerking voor het maken van groot formaat DNA knock-in (KI) nog steeds laag. Daarom heeft, in tegenstelling tot de directe KI-methode bij embryo's, gentargeting met behulp van embryonale stamcellen (SER's) gevolgd door embryo-injectie om chimaeramuizen te ontwikkelen nog steeds verschillende voordelen (bijv. high throughput targeting in vitro, multi-allel manipulatie en Cre - en flox-genmanipulatie kan in een korte periode worden uitgevoerd). Daarnaast kunnen stammen met moeilijk te hanteren embryo's in vitro, zoals BALB/c, ook worden gebruikt voor ESC-targeting. Dit protocol beschrijft de geoptimaliseerde methode voor groot formaat DNA (enkele kb) KI in SER's door CRISPR / Cas9-gemedieerde genoombewerking toe te passen, gevolgd door chimaeramuizenproductie om gen-gemanipuleerde muismodellen te ontwikkelen.

Inleiding

Het produceren van genetisch gemodificeerde muizen en het analyseren van hun fenotype stelt ons in staat om specifieke genfuncties in detail te begrijpen, in vivo. Tal van belangrijke bevindingen zijn ontdekt met behulp van gen-gemodificeerde diermodellen op het gebied van life science. Bovendien is sinds het rapport van genoombewerkingstechnologie met CRISPR / Cas9¹, onderzoek met genetisch gemodificeerde muizen snel verspreid naar vele laboratoria ^2,3. Genoombewerking van muiszygoten door CRISPR/Cas9 heeft een aanvaardbare efficiëntie bereikt voor het ontwikkelen van korte DNA-modificatie, zoals indelmutatie-georiënteerde gen knock-out⁴, enkele nucleotidevervanging of korte peptide-tag insertie met behulp van enkelstrengs oligonucleotiden (ssODN's) als knock-in (KI) donoren⁵. Aan de andere kant blijft de KI van grote DNA-fragmenten in zygoten door genoombewerking op een lage efficiëntie in vergelijking met de dna-modificatie op korte schaal ^6,7. Bovendien is het moeilijk om muizenstammen zoals BALB/c, een belangrijke stam voor specifieke onderzoeksgebieden zoals immunologie, te gebruiken voor op zygote gebaseerde genoombewerking omdat hun pre-implantatieembryo's gevoelig zijn voor in vitro manipulatie.

Een andere manier om genetisch gemodificeerde muismodellen te ontwikkelen, is door de embryonale stamcel (ESC) targetingtechniek te gebruiken, gevolgd door ESC-injectie in het pre-implantatieembryo om chimaera's ^8,9,10 te produceren, die nog steeds routinematig wordt gebruikt als een conventionele methode. Hoewel de acquisitiesnelheid voor het verkrijgen van nauwkeurige KI-ESC-klonen niet erg hoog is in conventionele ESC-targetingmethoden, biedt ESC-targeting enkele voordelen in vergelijking met zygote-genoombewerking, vooral voor lang DNA KI. De KI-efficiëntie van lange DNA-fragmenten (> enkele kb) in het zygote-genoom is bijvoorbeeld minder duidelijk ^6,7, en veel zygoten zijn nodig om zelfs maar één lijn KI-muis te ontwikkelen, wat ongewenst is in het huidige perspectief van dierproeven. In tegenstelling tot zygote genoombewerking, heeft lange DNA-targeting op SER's gevolgd door chimaeraproductie aanzienlijk minder embryo's nodig dan zygote-genoombewerking. Bovendien kunnen de pre-implantatieembryo's van BALB/c gevoelig zijn voor in vitro manipulatie, hun SER's in vitro¹¹ worden onderhouden en behandeld als andere competente 129- of F1-achtergrond-SER's, die daarom van toepassing zijn op chimaeraproducties. Hoewel een targetingvector 5' en 3' homologe armen en medicijnresistentiegencassettes voor positieve of negatieve selectie bevat, is de conventionele KI-efficiëntie van SER's over het algemeen onvoldoende, vanwege de hoge frequentie van willekeurige genomische integratie ^8,10, Dus is een verbeterde methode met nauwkeurige ESC-targetingefficiëntie vereist. Onlangs rapporteerden we een afgestemde ESC KI-methode met crispr/ cas9-gebaseerde genoombewerking om een hogere KI-efficiëntie te bereiken dan conventionele targetingmethoden¹¹. De methode die we hier beschrijven is gebaseerd op deze procedure die lange DNA (> enkele tot 10 kb) KI naar SER's mogelijk maakt met aanvaardbare efficiëntie voor routinematige werken zonder medicijnselectie; de vectorconstructieprocedure zou dus veel eenvoudiger zijn en een kortere periode nodig hebben, of de celkweekperiode zou ook aanzienlijk korter worden.

Protocol

Alle muisexperimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Tokio (goedkeuringsnummer PA17-63) en Osaka University (goedkeuringsnummer Biken-AP-H30-01) en uitgevoerd volgens hun richtlijnen en de ARRIVE-richtlijnen (https://arriveguidelines.org).

1. Vectorconstructie richten

1. Amplify een KI-cassette (CreERT hier, sjabloon-DNA voor de PCR is oorspronkelijk van een commercieel gensynthesebedrijf) en een ongeveer 1 kb fragment van 5'- of 3'-homologiearmen door PCR. Voeg voor DNA-klonen (stap 1.3) 15-mer overlapsequenties toe aan het 5'-uiteinde van elke PCR-primer. Zuiver de PCR DNA-fragmenten door agarose gel-elektroforese, gevolgd door extractie van het DNA-fragment met behulp van een DNA-zuiveringskit.
2. Lineariseer het backbone plasmide (bijv. pUC19 of pBS) met behulp van een geschikt restrictie-enzym (en) dat op unieke wijze ergens op de multi-kloonplaats verteert voor klonen. Zuiver vervolgens het verteerde plasmide met behulp van een DNA-zuiveringskit.
3. Kloon elk PCR-fragment (bijv. 5'-homologiearm, 3'-homologiearm) en KI-sequentie tegelijkertijd in het verteerde plasmide met behulp van een DNA-kloonkit volgens de instructies van de fabrikant.
4. Transformeer de competente cellen met behulp van het geconstrueerde plasmide (stap 1.3) door gedurende 1 minuut in een waterbad op 42 °C te verwarmen en zaai ze vervolgens op een LB-plaat met de juiste concentratie antibiotica zoals ampicilline of kanamycine. Kweek ze 's nachts voor resistente kloonselecties.
5. Pak verschillende (vier tot acht) individuele kolonies op met behulp van 200 μL pipetpunten en breng de tips over in 3 ml vloeibare LB met geschikte antibiotica (100 μg / ml ampicilline of 20 μL / ml kanamycine) en kweek 's nachts bij 37 ° C met schudden.
6. Zuiver het plasmide de volgende dag met behulp van een endotoxinevrije commerciële plasmidezuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant. Bevestig de gekloonde sequentie in het plasmide door Sanger-sequencing. Stel de plasmideconcentratie in op 1 μg DNA/μL met nucleasevrij water. Gebruik het plasmide als de gen-targeting vector.

2. Bereiding van de embryonale fibroblast (MEF) van de muis als feedercellen voor ESC

1. Offer 8-10 weken oude zwangere ICR vrouwelijke muizen (14,5 dagen postcoitum) door cervicale dislocatie. Veeg de buik goed af met 70% (v / v) ethanol voor sterilisatie, knip de buik door met een orbitale schaar en tang en herstel de foetusbevattende baarmoeder.
2. Plaats de baarmoeder in een schaal van 100 mm met 10 ml fosfaatrunderenserum (PBS) met 100 U / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine. Verwijder de placenta's en extra-embryonale weefsels van de foetussen met behulp van een orbitale schaar en tang. Gehakt de foetussen met behulp van een orbitale schaar en breng de PBS-oplossing met de gehakte foetale cellen over naar een conische buis van 50 ml.
3. Centrifugeer bij 280 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant door aspiratie weg. Voeg 10 ml trypsine-EDTA-oplossing van 0,25% (w/v) toe, meng goed door te pipetteren en incubeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 37 °C met behulp van een waterbad voor trypsinevertering.
4. Voeg 20 ml MEF-medium (DMEM met 10% (v/v) foetaal runderserum, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine) toe om de enzymatische reactie te stoppen, meng goed door zachte inversie en centrifugeer bij 280 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg door aspiratie, voeg 10 ml MEF-medium toe en meng goed door te pipetteren.
5. Zaai de celsuspensie in verschillende nieuwe 100 mm-gerechten (bereid hetzelfde aantal gerechten als het aantal foetussen met 10 ml MEF-medium voor één schaal van 100 mm). Verander het medium 4 tot 5 uur na het zaaien om niet-vastgemaakte cellen te verwijderen en laat de bijgevoegde MEF groeien. Passeer de cellen wanneer ze ~ 80% samenvloeiing bereiken met behulp van trypsine.
6. Plaats de kweekschalen met de woekerende MEF in MEF-medium, ongeveer 12-15 dagen na het zaaien, in een röntgenbestralingsapparaat. Stel de MEF bloot met een röntgenfoto van 50 Gy (totaal) om de celcyclus te stoppen volgens de instructies van de fabrikant.
7. Trypsinize de bestraalde MEF door 2 ml 0,25% trypsine-EDTA toe te voegen voor één schotel van 100 mm gedurende 5 minuten bij 37 °C, voeg vervolgens 4 ml MEF-medium toe om de trypsinevertering te stoppen en verzamel de celsuspensie in een nieuwe buis van 50 ml.
8. Was de MEF met een vers MEF-medium door centrifugeren bij 280 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, tel het aantal cellen met behulp van een celteller met trypanblauwe kleuring en vries ze in op 1,6 x 10⁶ cellen/buis in een celbevriezingsmedium. Bewaren tot gebruik; cellen kunnen gedurende meerdere jaren stabiel worden opgeslagen in vloeibare stikstof.

3. Cas9-RNP-DNA mengselbereiding

1. Los tracrRNA en crisprRNA op in verdunningsbuffer (elke RNA-concentratie bij 200 μM) door pipetteren. Meng de tracrRNA-oplossing, crisprRNA-oplossing en verdunningsbuffer (volumeverhouding bij 2:2:5) door elk RNA zachtjes te tikken en te gloeien met behulp van een thermische cycler bij 95 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 1 °C/min stepdown-cycli totdat de temperatuur 4 °C bereikt.
   OPMERKING: De gRNA-sequentie is ontworpen met CRISPOR, http://crispor.tefor.net.
2. Incubeer de gegloeide RNA's, 10 μg/μL Cas9-nuclease en de elektroporatiebuffer gemengd in een volumeverhouding van 5:3:2 bij 37 °C gedurende 20 minuten om het Cas9-RNP-complex te vormen. Meng en incubeer bij routinewerk 1,25 μL gegloeid RNA, 0,75 μL Cas9-nuclease en 0,5 μL van de elektroporatiebuffer voor één locusgenoombewerking.
3. Meng de volgende materialen in een buis van 1,5 ml: 10 μL elektroporatiebuffer, 1 μL Cas9-RNP-complex (stap 3.2) en 1 μL cirkelvormige richtvector (1 μg/μL, stap 1.6). De totale hoeveelheid Cas9-RNP-DNA mengsel is 12 μL. Houd het Cas9-RNP-DNA mengsel op ijs tot elektroporatie.
   OPMERKING: Om te voorkomen dat het gRNA na KI opnieuw wordt gesplitst, ontwerpt u het gRNA op een positie waar de gRNA-herkenningssequentie wordt gesplitst door de integratie van de KI-donor. Als het gRNA niet op een dergelijke locatie kan worden ontworpen, worden verschillende nucleotide stille mutaties, waardoor de aminozuursequentie niet verandert, opgenomen in het plasmide van de KI-donor.

4. Gentargeting van SER's

1. Om de met gelatine omhulde celcultuurschalen te bereiden, voegt u 0,1% (w / v) gelatine-oplossing toe op 2 ml voor een schaal van 60 mm, 500 μL voor een 24-well plaat, 100 μL voor een 96-well plaat en incubeer gedurende 2 uur in een vochtige incubator. Verwijder de gelatine-oplossing, was tweemaal met dezelfde hoeveelheid PBS en bewaar bij kamertemperatuur tot gebruik.
2. Ontdooi mitotisch geïnactiveerde bevroren MEF-bouillon (stap 2.2) met behulp van een waterbad van 37 °C gedurende 1 minuut en plaats de MEF op een met gelatine beklede schaal van 60 mm (één bevroren voorraadbuis MEF met 1,6 x 10⁶ cellen voor twee gerechten van 60 mm, stap 2.2) 1 dag vóór het zaaien van ESC.
3. Ontdooi een bevroren ESC-voorraadbuis (bewaard op 2 x 10⁵ SER's/buis; celtelling werd uitgevoerd met behulp van een celteller) met behulp van een waterbad van 37 °C gedurende 1 minuut en plaats 1 x 10⁵ SER's op een schaal van 60 mm met voorgezaaide MEF (stap 4.1).
4. Kweek in 4 ml ESC-kweekmedium (ESCM, gemodificeerd medium op basis van DMEM met 15% (v/v) foetaal runderserum, 2 mM L-glutaminesubstraat, 100 U/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine, 0,1 mM 2-mercaptoethanol, leukemie remmende factor en t2i (0,2 μM PD0325901 en 3 μM CHIR99021) die de pluripotentie van ESC¹¹ handhaaft bij 37 °C met 5% CO₂ totdat de ESC 50% tot 70% samenvloeiing bereikt.
   OPMERKING: We gebruiken drie verschillende lijnen van ESC: JM8. A3 van B6N, V6.5 van B6-129 F1 en in eigen huis ontwikkelde BALB/c ESC. Dezelfde KI-protocollen in dit manuscript worden gebruikt voor alle ESC-regels.
5. Was de kweek-ESC met 4 ml PBS en behandel vervolgens met 800 μL 0,25% trypsine-EDTA-oplossing gedurende 5 minuten bij 37 °C voor de spijsvertering. Voeg 1 ml ESCM toe om het trypsine te inactiveren en dissociëer de SER's naar enkele cellen door te pipetteren.
6. Centrifugeer de ESC-bevattende oplossing gedurende 5 minuten bij 280 x g, gooi het supernatant weg, resuspendeer SER's in verse 1 ml ESCM en tel het aantal cellen met behulp van een celteller met trypanblauwe kleuring. Breng 1 x 10⁵ SER's over in een nieuwe buis van 1,5 ml en was ze drie keer met PBS door centrifugeren bij 500 x g, 4 °C.
7. Resuspendeer de ESC-pellet in 12 μL Cas9-RNP-DNA-mengsel (stap 3.3) en meng goed door voorzichtig pipetteren om borrelen te voorkomen. Serveer de resuspended ESC voor elektroporatie. Het elektroporatiesysteem gebruikt een enkele puls bij 1.400 V en 30 ms voor Cas9-RNP-DNA-transductie (figuur 1).
8. Kweek de geëlektropoeerde SER's in een schaal van 60 mm met 4 ml ESCM met mitotisch geïnactiveerde MEF (punt 4.2). Verander het medium elke dag.
9. Was de SER's met 4 ml PBS 3 tot 5 dagen na de elektroporatie, behandel vervolgens met 800 μL van 0,25% trypsine-EDTA en kweek op 37 °C gedurende 5 minuten in een vochtige incubator voor de spijsvertering. Voeg 2 ml ESCM toe om de trypsinevergisting te stoppen en centrifugeer het celmengsel gedurende 5 minuten bij 280 x g .
10. Gooi het supernatant weg, resuspenseer de SER's in 1 ml verse ESCM en tel de celconcentratie met behulp van een celteller met trypanblauwe kleuring. Passeer de SER's op 1 x 10^{3 SER's} per schotel van 60 mm met ESCM en feeder MEF. Verander het medium elke dag totdat de kolonie opkrabbelt.
    OPMERKING: De reden waarom de ESC eenmaal wordt doorgegeven voordat het wordt opgehaald, was dat genoombewerking kan blijven plaatsvinden na ESC-deling, dus de eerste kolonie is in veel gevallen niet altijd de kloon. Daarom is de eerste passage van ESC voordat de kolonie wordt opgehaald een essentiële stap om enkele klonen op te halen.

5. PCR-genotypering van gerichte SER's

1. Aspirateer ESCM uit de ESC-kweekschaal 5 tot 7 dagen na de eerste passage (stap 4.9) en voeg 4 ml PBS toe. Pak enkele ESC-kolonies op met 5 μL PBS met behulp van een pipet van 20 μL onder een stereomicroscoop (30x tot 40x vergroting). Plaats de afzonderlijke kolonies in een putje van een ronde bodemplaat met 96 putten met 15 μL 0,25% trypsine-EDTA-oplossing.
2. Houd de 96-well plaat op ijs totdat 48 individuele kolonies zijn opgepikt. Incubeer de 96-well plaat gedurende 5 minuten in een 37 ° C vochtige 5% CO_2-incubator , voeg vervolgens 80 μL ESCM toe om de trypsinevertering te stoppen en dissociëer ESC-kolonies in enkele cellen door te pipetteren.
   OPMERKING: Aangezien de KI-efficiëntie van deze methode meestal 10% -50% is, pakken we routinematig 48 klonen op en voeren we eerst genotypering uit met behulp van 24 van hen. Als er op dit moment niet meerdere KI-klonen kunnen worden verkregen, screenen we verder op KI met behulp van de resterende 24 klonen.
3. Breng 40 μL ESC-suspensie (stap 5) over naar een gelatinegecoate feedervrije 96-wellsplaat met 50 μL ESCM per putje voor PCR-genotypering. Breng de resterende 60 μL ESC-suspensie over in een putje in een met gelatine beklede 24-wellsplaat, die 500 μL ESCM en feeder MEF bevat, om de bevroren ESC-bouillon te maken.
4. Stock individuele ESC-klonen gekweekt in de 24-well plaat (stap 5.3) totdat ze 60% tot 80% samenvloeiing bereiken. Herstel individuele ESC-klonen door trypsinisatie zoals hierboven vermeld, verzamel cellen in een nieuwe buis van 1,5 ml en centrifugeer bij 280 x g gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weg, resuspenseer de cellen in 500 μL celbevriezingsmedium en vries ze in met een -80 °C diepvriezer.
5. Voor PCR-genotypering kweekt ESC-klonen in de 96-well feedervrije plaat (stap 5.3) totdat de ESC meer dan 90% samenvloeiing bereikt. Verwijder ESCM uit elk putje door aspiratie en was tweemaal met 100 μL PBS.
6. Adem de PBS aan en voeg 100 μL lysisbuffer met proteïnase K toe, meng goed en breng het ESC-lysaat over in een nieuwe buis van 1,5 ml. Verwarm het ESC-lysaat op 65 °C gedurende ten minste 1 uur met behulp van een warmtekamer. Extraheer en zuiver het genomische DNA met behulp van een conventionele fenol-chloroform DNA-zuiveringsmethode gevolgd door ethanolprecipitatie.
7. Los het neergeslagen DNA op in 20 μL DNase-vrij water en bepaal de zuiverheid en concentratie van DNA met behulp van een spectrofotometer. Voer genomische PCR uit met behulp van locusspecifieke primersets om het doelgebied te versterken. Controleer vervolgens de volgorde en kies de ESC-klonen met de gewenste KI-sequenties.

6. Voorbereiding van embryo's in acht cellen en micro-injectie van SER's

1. Injecteer 5 IE serumgonadotrofine (PMSG) intraperitoneaal in volwassen ICR-vrouwtjes. Injecteer na 48 uur 5 IE humaan choriongonadotrofine (hCG) in dezelfde vrouwtjes en koppel vervolgens de met hormonen behandelde vrouwtjes met de ICR-mannetjes. Controleer de copulatorische plug in de vagina de volgende dag (embryonale dag 0,5, ED0,5).
   OPMERKING: Om chimerisme te evalueren op basis van vachtkleurverhoudingen, gebruikt u blastocyst van de ICR-stam als ontvanger voor een ESC met een zwarte of agouti-vachtkleurachtergrond, of blastocyst van de C57BL / 6-stam als ontvanger voor een ESC met de albino-achtergrond.
2. Verzamel de eileider bij ED1,5 en plaats deze in HEPES gebufferde medium (FHM) druppels. Herstel de embryo's van twee of vier cellen door de eileider met FHM te spoelen met behulp van een spoelnaald die in het infundibulum is ingebracht.
3. Was de verzamelde embryo's door ze met een mondpipet in verschillende verse FHM-druppels te verplaatsen. Kweek de embryo's in 50 μL KSOM druppel op een 35 mm celkweekschaal bedekt met minerale olie bij 37 °C, 5% CO₂ incubator gedurende 1 dag totdat het achtcellige of morulastadium (ED2,5) is bereikt.
4. Als de embryo's de volgende verzameldag niet worden gebruikt, vries ze dan in door vitrificatie volgens het CARD-protocol (http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/ebvitri.html) en bewaar ze in vloeibare stikstof tot gebruik.
5. Bereid glazen pipetten voor op het vasthouden van de embryo's (80-100 μm buitendiameter) en ESC-injectie (ongeveer 13 μm diameter) met behulp van een trekker en microforge.
6. Integreer een holdingpipet met FHM in een capillaire houder die is aangesloten op een micro-injector en aan de linkerkant van de micromanipulator is opgesteld. Sluit een injectiepipet aan op een andere microinjector en plaats deze aan de rechterkant. Lijn de twee pipetten recht uit in het gezichtsveld van de microscoop.
7. Doseer 5 μL druppels van 12% (w/v) polyvinylpyrrolidon (PVP) in FHM medium en 5 μL druppels FHM op hetzelfde deksel van een 60 mm schaal naast elkaar en bedek de druppels met minerale olie. Breng embryo's over in de FHM-druppel van 5 μL en voeg 1-5 μL van de ESC-suspensie toe aan de FHM-druppel die embryo's bevat.
   OPMERKING: Laat de ESC- en MEF-suspensie 30 minuten in de 4 ml ESM op een kweekschaal van 60 mm staan voordat u de druppel bereidt. Omdat MEF's sneller aan de bodem kleven dan SER's, zorgt deze incubatie van 30 minuten voor de concentratie van niet-vastgemaakte ES-cellen in het supernatant.
8. Was in de injectiepipet met PVP en ga vervolgens naar de druppel met de embryo's en SER's.
9. Pak drie individuele ECS-doubletten op die net klaar zijn met hun celdeling (zes cellen) in de injectiepipet. Houd een embryo met acht cellen of morulastadium vast, dat de verdichting heeft voltooid, met de vasthoudende pipet door aspiratie. Maak een gat in de zona pellucida met een piëzo-elektrische puls (intensiteit: 3; snelheid: 3). Verwijder de zescellige ESC in de zona pellucida en trek de pipet uit de embryo's.
10. Was de ESC-geïnjecteerde embryo's met verschillende KSOM-druppels voorzichtig met behulp van een mondpipet en incubeer ze in een nieuwe KSOM-druppel van 50 μL bedekt met minerale olie bij 37 °C, 5% CO₂ totdat de embryo's zich ontwikkelen tot het blastocyststadium.
11. Breng de 10 ESC-geïnjecteerde blastocysten over in elke baarmoederhoorn van pseudopregnante vrouwelijke muizen (2,5 dagen postcoitum, 20 blastocysten per hoofd).
12. Nadat de draagmoeder is bevallen, selecteert u ten minste twee mannelijke chimaera's met de hoogste chimerismeratio (70% of hoger zoals bevestigd door de vachtkleur) en paart u ze vervolgens met geschikte stamvrouwtjes om F1 heterozygote KI te verkrijgen.
13. Fok individuele KI-muizen met geschikte partners om muizen te verkrijgen met wenselijke genotype(n) of genetische achtergronden die geschikt zijn voor onderzoek.

Resultaten

We hebben ons gericht op specifieke gen(en) in de ESC gevolgd door chimaeraproductie om gen-gemanipuleerde muisproductie te ontwikkelen volgens ons vorige manuscript¹¹. ESC-genotypering (beschreven in rubriek 4) wordt routinematig uitgevoerd door PCR met behulp van primers. De primers zijn ontworpen op genomische sequenties buiten de homologiearmen en de specifieke sequenties in het KI DNA-fragment (figuur 2A). In dat geval wordt geen wild-type allel versterkt, terwijl een PCR-amplicon van een specifieke grootte alleen wordt gedetecteerd wanneer het beoogde exogene DNA KI is op de doellocatie. Representatieve genotypering PCR-resultaten zijn weergegeven in figuur 2B. Negen van de 22 klonen (40,9%) vertoonden in dit geval een KI-specifieke band. Drie representatieve targetingresultaten, waaronder het resultaat in figuur 2, zijn weergegeven in tabel 1. Deze resultaten geven aan dat de hier getoonde methode efficiënt en reproduceerbaar is voor gen KI zonder medicijnselecties.

ESC wordt opgepikt in een injectiepipet, vervolgens wordt een gat in de zona pellucida gemaakt met behulp van een piëzo-elektrische plus en wordt de ESC vrijgegeven tussen de embryonale cellen (figuur 3). Technisch gezien is dit protocol om een ESC te injecteren in een embryo met acht cellen of morulastadium vergelijkbaar met het protocol voor ESC-injectie in een blastocyst dat vaak wordt gebruikt in veel muisfaciliteiten. Representatieve chimere muizen zijn weergegeven in figuur 4. Voor vachtkleurevaluatie van chimerisme werd het embryo van de ICR-stam (albino, wit haar) gebruikt als ontvanger van B6 of B6-129 F1 ESC en werden B6-embryo's gebruikt als ontvanger van BALB / c SER's (figuur 4).

Figuur 1: Een schema van CRISPR/Cas9 ribonucleoproteïne (RNP)-gemedieerde circulaire plasmide-integratie in de specifieke locus van een ESC-genoom. Electroporation introduceert een circulair plasmide als richtvector in SER's met Cas9-RNP. Afkortingen: GOI = gen van belang, HA = homologiearm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Genomische PCR-analyses voor KI-screening van gerichte ESC-klonen. (A) KI-specifieke PCR-primers zijn ontworpen op genomische sequenties buiten de homologiearmen (voorwaarts) en in de specifieke sequenties in het KI-DNA-fragment (omgekeerd). (B) Representatieve pcr-resultaten van genotypering. Een wild-type genoom werd gebruikt als een negatieve controle. Afkortingen: GOI = gen van belang, HA = homologiearm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Representatieve beelden van embryo-injectie in acht cellen. (A) Voor micro-injectie worden drie doubletten van SER's (zes cellen, pijlpunten) opgepikt. (B) Een gat in de zona pellucida wordt gemaakt met een piëzo-elektrische puls en SER's worden tussen elk blastomere uitgestoten. De getoonde schaalbalk is 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Representatieve beelden van chimaeramuizen. (A,B) De ESC is afgeleid van C57BL/6N (JM8. A3, Agouti haar; A) of B6-129 F1 (Agouti-haar; B) worden geïnjecteerd in ICR (albino, wit haar) embryo's, gevolgd door het overbrengen van de embryo's naar de moeder surrogaten. (C) De ESC afgeleid van BALB/c (albino, wit haar) wordt geïnjecteerd in C57BL/6J (zwart haar) embryo's, gevolgd door het overbrengen van de embryo's naar moeder-surrogaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Project-id	Choromosome	5'HA lengte (bp)	3'HA lengte (bp)	Insert grootte (bp)	Aantal geanalyseerde klonen	Aantal KI-klonen	Efficiëntie (%)	Opmerkingen
R26-cc*	Chr6	965	1006	5321	23	2	8.7%	-
R4-03	Chr8	1000	997	3070	22	6	27.3%	-
P4-01	Chr15	1000	1000	2569	22	9	40.9%	Weergegeven in figuur 2

Tabel 1: KI-efficiëntieverbeteringen in drie onafhankelijke genomische loci in het ESC. *Deze projecten zijn tot nu toe niet gepubliceerd. De naam van deze genen zal in de toekomst in onafhankelijke manuscripten worden onthuld.

Discussie

Gentargeting van SER's gevolgd door chimaeraproductie is conventioneel gebruikt voor het ontwikkelen van gen-gemanipuleerde muizen. Niettemin blijft de efficiëntie van de gen knock-in laag, ook al bevat de targetingvector lange (> verschillende kb in de gebruikelijke) homologiearmen met positieve of negatieve medicijnselectiegencassettes. Ons protocol introduceerde een afgestemde ESC KI-methode van lang exogene DNA met behulp van een circulair plasmide zonder medicijnselectiecassettes als een targetingvector vergezeld van Cas9-RNP-gemedieerde genoombewerking met een acceptabele efficiëntie voor routinewerkzaamheden. Dit protocol zou dus kunnen helpen om de hoeveelheid tijd die nodig is voor het produceren van genetisch gemodificeerde chimere muizen aanzienlijk te verminderen in vergelijking met de conventionele ESC-targeting.

In dit protocol gebruikten we CRISPR/Cas9-RNP om site-specifieke dubbelstrengsbreuken in het genoom te induceren, en een circulair plasmide werd gebruikt als de targetingvector in plaats van een lineaire. Lineaire plasmiden worden conventioneel gebruikt als richtvector voor gen KI vanwege hun verhoogde efficiëntie van genomische integratie ^8,9,10. Veel genomische integraties zijn echter niet-specifiek, hoewel de vector homologe armen⁹ bevat. Aan de andere kant worden circulaire plasmiden zelden gebruikt als targetingvectoren vanwege hun moeilijk te integreren kenmerk in het genoom van SER's¹² of fibroblasten¹³. Het zou dus mogelijk zijn dat het toepassen van een circulair plasmide als een targetingvector vergezeld van CRISPR / Cas9-gemedieerde genoombewerking niet-specifieke willekeurige integratie minimaliseert, maar de sitespecifieke integratie in het ESC-genoom maximaliseert. Het zou opmerkelijk zijn dat de inductie-efficiëntie van de dubbelstrengsbreuk door CRISPR / Cas9 vrij belangrijk is¹⁴, dus het zou essentieel zijn om gRNA te gebruiken dat een dubbelstrengsbreuk induceert bij hoge efficiëntie. Het moet worden overwogen om gRNA opnieuw te ontwerpen wanneer de KI-efficiëntie te laag is. In het geval in figuur 2 vertoonde 40,9% van de ESC-klonen een KI-specifieke band. In feite, als het kernlaboratorium van het instituut, voeren we routinematig gentargeting uit met behulp van SER's volgens de hier beschreven methode en hebben we KI-efficiënties van 10% -50% bereikt voor 1-2 kb-sequenties zoals Cre, CreERT of fluorescerende reporters, hoewel er enkele variaties zijn afhankelijk van de genlocus. De langste DNA-sequenties die we met succes KI hebben met behulp van deze methode is ongeveer 11,2 kb in de Rosa26-locus en de efficiëntie was 12,2% (vijf KI-kolonies van de 41 geanalyseerde kolonies).

Het zou ook van belang zijn dat dit protocol achtcellige of morulastadiumembryo's gebruikt als ontvangers voor ESC-micro-injectie, maar geen blastocyststadiumembryo's. Hoewel we in dit artikel geen vergelijkingsexperimenten hebben uitgevoerd, hebben verschillende rapporten aangetoond dat injectie van SER's in embryo's met acht cellen of morulastadium de efficiëntie van ESC-bijdrage aan chimere nakomelingen aanzienlijk verbetert in vergelijking met de ESC-injectie in blastocysten 15,16,17,18 . Esc-injecties van verschillende ESC-lijnen, waaronder C57BL/6, B6-129 F1 en BALB/c, resulteerden vaak in een hoge vachtkleur chimera ontwikkeling bij sommige, maar niet alle, nakomelingen (zie figuur 4). De beperking van de methode is dat de SER's die in het pre-implantatieembryo worden geïnjecteerd, niet altijd konden bijdragen aan geslachtscellen in een chimaera^19,20. Kiembaantransmissie van SER's zou afhangen van de kwaliteit van elke ESC-kloon¹⁹. Daarom zou het voordelig zijn om meerdere ESC-kloonlijnen te ontwikkelen als back-up voor stabiele chimere muisproductie. Kortom, de hier gepresenteerde protocollen gebruiken eenvoudige targetingvectoren die alleen elke homologiearm en het gen van belang voor KI omvatten zonder een medicijnresistente cassette. Daarom zou de vectorconstructie veel eenvoudiger zijn en zou de kweekperiode kunnen worden verkort in vergelijking met de conventionele ESC-targetingtechniek. Dit zou helpen bij het snel en faciliterend produceren van verschillende soorten genetisch gemodificeerde muizen voor toekomstige analyse in de biowetenschappen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BALB/c ESC	-	-	ESC ontwikkeld uit BALB/c-stam
Bambanker	Nippon Genetics	CS-02-001	Cel-invriest medium. Sectie 2.6 en elders
Cas9 Nuclease V3	IDT	1081059	Sectie 3.2 en elders.
CHIR99021	FUJIFILM Wako	038-23101	Sectie 4.3
CreERT genfragment	GeneWiz		Sectie 1.1.
CRISPR-Cas9 crisprRNA	IDT		crisprRNA. Sectie 3.1 en elders.
CRISPR-Cas9 tracrRNA	IDT	1072534	tracrRNA. Sectie 3.1 en elders.
DMEM	Nacalai	08458-45	MEF-medium. Sectie 2.3 en elders
Duplex buffer	IDT	1072534	RNA-verdunningsbuffer. Sectie 3.1 en elders.
FastGene Gel/PCR Extractie Kit	Nippon Genetics	FG-91302	Sectie 1.1 en 1.2.
GlutaMax	Thermo Fisher	35-050-061	L-glutatine substraat
hCG	ASKA Animal Health		Sectie 6.1.
In-Fusion HD Cloning Kit	Clontech	639648	DNA-kloneringskit. Sectie 1.3 en elders
JM8.A3 ESC	EuMMCR	-	ESC ontwikkeld uit C57BL/6N-stam
Knock-out DMEM	Thermo Fisher	10829018	Sectie 4.3 en elders, DMEM-gebaseerd gemodificeerd commercieel medium.
KSOM	Merck	MR-121-D	Sectie 6.3 en 6.9.
Leukemie-remmende factor	FUJIFILM Wako	125-05603	Sectie 4.3. Er worden geen gegevens over eenheidsconcentratie geleverd door de aanbieder. Er wordt een 1.000-voudige verdunning in dit protocol gebruikt.
Neon Elektroporatiesysteem	Thermo Fisher	MPK5000	Sectie 3.2, 4.5 en elders. Het systeem bevat elektroporatiebuffer, eveneens gebruikt in sectie 3.2.
NucleoSpin Plasmid Transfectiekwaliteit	Takara	U0490B	Sectie 1.6.
PD0325901	FUJIFILM Wako	162-25291	Sectie 4.3
PMSG	ASKA Animal Health		Sectie 6.1.
Staartlysebuffer	Nacalai	06169-95	Sectie 5.5.
Trypsine-EDTA	Nacalai	32777-15	Sectie 2.2 en elders
V6.5 ESC	-	-	ESC ontwikkeld uit B6J-129 F1-stam
X-ray bestralingsapparaat	Hitachi	MBR-1618R-BE	Sectie 2.6.