Isolatie van gentherapievectoren van de volgende generatie door middel van engineering, barcoding en screening van adeno-geassocieerde virus (AAV) capsid-varianten

Samenvatting

AAV-peptideweergavebibliotheek generatie en daaropvolgende validatie door de barcodering van kandidaten met nieuwe eigenschappen voor het maken van AAV's van de volgende generatie.

Samenvatting

Genafgiftevectoren afgeleid van Adeno-geassocieerd virus (AAV) zijn een van de meest veelbelovende hulpmiddelen voor de behandeling van genetische ziekten, wat blijkt uit bemoedigende klinische gegevens en de goedkeuring van verschillende AAV-gentherapieën. Twee belangrijke redenen voor het succes van AAV-vectoren zijn (i) de voorafgaande isolatie van verschillende natuurlijk voorkomende virale serotypen met verschillende eigenschappen, en (ii) de daaropvolgende vestiging van krachtige technologieën voor hun moleculaire engineering en herbestemming in hoge doorvoer. Het potentieel van deze technieken wordt verder vergroot door recent geïmplementeerde strategieën voor het barcoderen van geselecteerde AAV-capsiden op DNA- en RNA-niveau, waardoor hun uitgebreide en parallelle in vivo stratificatie in alle belangrijke organen en celtypen in een enkel dier mogelijk wordt. Hier presenteren we een basispijplijn die deze reeks complementaire wegen omvat, met behulp van AAV-peptideweergave om het gevarieerde arsenaal aan beschikbare capsid-engineeringtechnologieën te vertegenwoordigen. Dienovereenkomstig beschrijven we eerst de cruciale stappen voor het genereren van een AAV-peptideweergavebibliotheek voor de in vivo selectie van kandidaten met gewenste eigenschappen, gevolgd door een demonstratie van hoe de meest interessante capside-varianten voor secundaire in vivo screening kunnen worden gebarcodeerd. Vervolgens illustreren we de methodologie voor het maken van bibliotheken voor next-generation sequencing (NGS), inclusief barcodeversterking en adapterligatie, voordat we afsluiten met een overzicht van de meest kritieke stappen tijdens NGS-gegevensanalyse. Omdat de hier gerapporteerde protocollen veelzijdig en aanpasbaar zijn, kunnen onderzoekers ze gemakkelijk gebruiken om de optimale AAV-capside-varianten in hun favoriete ziektemodel en voor gentherapietoepassingen te verrijken.

Inleiding

Genoverdrachtstherapie is de introductie van genetisch materiaal in cellen om het cellulaire genetische materiaal te repareren, te vervangen of te veranderen om ziekten te voorkomen, behandelen, genezen of verbeteren. Genoverdracht, zowel in vivo als ex vivo, is afhankelijk van verschillende toedieningssystemen, niet-viraal en viraal. Virussen zijn op natuurlijke wijze geëvolueerd om hun doelcellen efficiënt te transduceren en kunnen worden gebruikt als leveringsvectoren. Onder de verschillende soorten virale vectoren die bij gentherapie worden gebruikt, worden adeno-geassocieerde virussen in toenemende mate gebruikt, vanwege hun gebrek aan pathogeniciteit, veiligheid, lage immunogeniciteit en vooral hun vermogen om langdurige, niet-integrerende expressie te ondersteunen ^1,2,3. AAV-gentherapie heeft het afgelopen decennium aanzienlijke resultaten opgeleverd; drie therapieën zijn goedgekeurd door het Europees Geneesmiddelenbureau en de Amerikaanse Food and Drug Administration voor gebruik bij mensen ^3,4. Verschillende klinische onderzoeken zijn ook aan de gang om een verscheidenheid aan ziekten te behandelen, zoals hemofilie, spier-, hart- en neurologische aandoeningen, zoals elders besproken³. Ondanks tientallen jaren van vooruitgang heeft het gebied van gentherapie de afgelopen jaren een reeks tegenslagen ervaren⁴, vooral sterfgevallen in klinische onderzoeken⁵ die in de wacht zijn gezet vanwege dosisbeperkende toxiciteiten, met name voor weefsels die enorm zijn, zoals spieren, of moeilijk te bereiken, zoals hersenen⁶.

De AAV-vectoren die momenteel in klinische onderzoeken worden gebruikt, behoren tot de natuurlijke serotypen, op enkele uitzonderingen^{na 1}. AAV-engineering biedt de mogelijkheid om vectoren te ontwikkelen met superieure orgaan- of celspecificiteit en efficiëntie. In de afgelopen twee decennia zijn verschillende benaderingen met succes toegepast, zoals peptideweergave, loop-swap, capsid DNA-schuifelen, foutgevoelige PCR en gericht ontwerp, om individuele AAV-varianten of bibliotheken daarvan met verschillende eigenschappen te genereren⁷. Deze worden vervolgens onderworpen aan meerdere rondes van gerichte evolutie om de varianten erin te selecteren met de gewenste eigenschappen, zoals elders besproken ^1,3. Van alle capsid-evolutiestrategieën zijn peptide-display AAV-bibliotheken het meest gebruikt, vanwege enkele unieke eigenschappen: ze zijn relatief eenvoudig te genereren en ze kunnen een hoge diversiteit en high-throughput sequencing bereiken, waardoor ze hun evolutie kunnen volgen.

De eerste succesvolle peptide insertie AAV-bibliotheken werden bijna 20 jaar geleden beschreven. In een van de eerste construeerden Perabo et ^al.8 een bibliotheek van gemodificeerde AAV2-capsiden, waarin een pool van willekeurig gegenereerde oligonucleotiden in een plasmide werd ingebracht op een positie die overeenkomt met aminozuur 587 van het VP1 capside-eiwit, in de drievoudige as die uit de capside steekt. Met behulp van adenovirus co-infectie werd de AAV-bibliotheek ontwikkeld door meerdere selectierondes en de uiteindelijke re-targeted varianten bleken in staat te zijn om cellijnen refractair te transduceren naar de ouderlijke AAV2⁸. Kort daarna introduceerden Müller et ^al.9 het tweestappensysteem voor bibliotheekproductie, een aanzienlijke verbetering van het protocol. Aanvankelijk wordt de plasmidebibliotheek, samen met een adenoviraal helperplasmide, gebruikt om een AAV-bibliotheek te produceren die chimere capsiden bevat. Deze AAV-shuttlebibliotheek wordt gebruikt om cellen met een lage multipliciteit van infectie (MOI) te infecteren, met als doel één viraal genoom per cel te introduceren. Co-infectie met adenovirus zorgt voor de productie van AAV's met een bijpassend genoom en capsid⁹. Ongeveer een decennium later gebruikte Dalkara¹⁰ in vivo gerichte evolutie om de 7m8-variant te creëren. Deze variant heeft een 10 aminozuurinbrenging (LALGETTRPA), waarvan er drie fungeren als linkers, en richt zich efficiënt op het buitenste netvlies na intravitreale injectie¹⁰. Deze engineered capsid is een uitzonderlijk succesverhaal, omdat het een van de weinige engineered capsids is die tot nu toe de kliniek heeft bereikt¹¹.

Het veld beleefde een tweede boost met de introductie van next-generation sequencing (NGS) technieken. Twee publicaties van Adachi et al.12 in 2014 en van Marsic et ^al.13 in 2015, toonden de kracht van NGS om de distributie van AAV-capsidbibliotheken met streepjescode met hoge nauwkeurigheid te volgen. Een paar jaar later werd de NGS van barcodegebieden aangepast aan het peptide-insertiegebied om de capside-evolutie te volgen. Körbelin et ^al.14 voerden een NGS-geleide screening uit om een pulmonaal gerichte AAV2-gebaseerde capsid te identificeren. De NGS-analyse hielp bij het berekenen van drie beoordelingsscores: de verrijkingsscore tussen selectierondes, de algemene specificiteitsscore om weefselspecificiteit te bepalen en ten slotte de gecombineerde score¹⁴. Het Gradinaru-lab¹⁵ publiceerde in hetzelfde jaar het op Cre-recombination gebaseerde AAV-gerichte evolutie (CREATE) -systeem, dat een celtypespecifieke selectie mogelijk maakt. In dit systeem draagt de capsid-bibliotheek een Cre-inverteerbare schakelaar, omdat het polyA-signaal wordt geflankeerd door twee loxP-sites. De AAV-bibliotheek wordt vervolgens geïnjecteerd in Cre-muizen, waar het polyA-signaal alleen in Cre + -cellen wordt omgekeerd, waardoor de sjabloon wordt geboden voor het binden van een omgekeerde PCR-primer met de voorwaartse primer in het capsid-gen. Deze zeer specifieke PCR-redding maakte de identificatie van de AAV-PHP mogelijk. B-variant die de bloed-hersenbarrière kan passeren¹⁵. Dit systeem werd verder ontwikkeld tot M-CREATE (Multiplexed-CREATE), waarbij NGS en synthetische bibliotheekgeneratie werden geïntegreerd in de pijplijn¹⁶.

Een verbeterde RNA-gebaseerde versie van dit systeem uit het Maguire-lab¹⁷, iTransduce, maakt selectie op DNA-niveau mogelijk van capsiden die functioneel cellen transduceren en hun genomen tot expressie brengen. Het virale genoom van de peptideweergavebibliotheek bestaat uit een Cre-gen onder controle van een alomtegenwoordige promotor en het capside-gen onder controle van de p41-promotor. De bibliotheek wordt geïnjecteerd bij muizen die een loxP-STOP-loxP-cassette hebben stroomopwaarts van tdTomato. Cellen getransduceerd met AAV-varianten die het virale genoom tot expressie brengen en dus Cre tdTomato tot expressie brengen en, in combinatie met celmarkers, kunnen worden gesorteerd en geselecteerd¹⁷. Evenzo plaatsten Nonnenmacher et al.18 en Tabebordbar et ^al.19 de capsid-genenbibliotheek onder controle van weefselspecifieke promotors. Na injectie in verschillende diermodellen werd viraal RNA gebruikt om de capsid-varianten te isoleren.

Een alternatieve benadering is om barcoding te gebruiken om capsid-bibliotheken te taggen. Het Björklund lab²⁰ gebruikte deze benadering voor barcode peptide insertion capsid libraries en ontwikkelde de barcoded rational AAV vector evolution (BRAVE). In één plasmide wordt de Rep2Cap-cassette gekloond naast een inverted terminal repeats (ITR)-geflankeerd, geel fluorescerend eiwit (YFP)-expresserend, barcode-gelabeld transgen. Met behulp van loxP-sites tussen het einde van de dop en het begin van de streepjescode, genereert een in vitro Cre-recombinatie een fragment dat klein genoeg is voor NGS, waardoor de associatie van peptide-insertie met de unieke streepjescode (look-up table, LUT) mogelijk wordt. AAV-productie wordt uitgevoerd met behulp van de plasmidebibliotheek en de barcodes uitgedrukt in het mRNA worden gescreend na in vivo toepassing, opnieuw met NGS²⁰. Wanneer de capsid-bibliotheken varianten van het hele capsid-gen bevatten (d.w.z. geschudde bibliotheken), moet long-read sequencing worden gebruikt. Verschillende groepen hebben barcodes gebruikt om deze diverse bibliotheken te taggen, waardoor NGS een hogere leesdiepte heeft. Het Kay lab²¹ tagde zeer diverse capsid shuffled bibliotheken met barcodes stroomafwaarts van het cap polyA signaal. In een eerste stap werd een plasmidebibliotheek met streepjescode gegenereerd en de geschudde capsid-genenbibliotheek werd erin gekloond. Vervolgens werd een combinatie van MiSeq (short read, hogere leesdiepte) en PacBio (long read, lagere leesdiepte) NGS en Sanger sequencing gebruikt om hun LUT²¹ te genereren. In 2019 hebben Ogden en collega's van het Church-lab²² de AAV2-capsid-geschiktheid voor meerdere functies afgebakend met behulp van bibliotheken met mutaties, inserties en deleties op één punt in elke positie, wat uiteindelijk machinegestuurd ontwerp mogelijk maakte. Voor de generatie van de bibliotheek werden kleinere fragmenten van het capsid-gen gesynthetiseerd, getagd met een barcode, de volgende generatie gesequenced en vervolgens gekloond in het volledige capsid-gen. De NGS-gegevens werden gebruikt om een LUT te genereren. De bibliotheek werd vervolgens gescreend met alleen de barcodes en short read sequencing, wat op zijn beurt een hogere leesdiepte²² mogelijk maakt.

Bibliotheken met streepjescodes zijn voornamelijk gebruikt om een pool van bekende, natuurlijke en technische varianten te screenen na verschillende selectierondes van capsid-bibliotheken of onafhankelijk van een capsid-evolutiestudie. Het voordeel van dergelijke bibliotheken is de mogelijkheid om meerdere capsiden te screenen, terwijl het aantal dieren wordt verminderd en de variatie tussen dieren wordt geminimaliseerd. De eerste studies die deze technologie introduceerden in het AAV-veld werden bijna tien jaar geleden gepubliceerd. Het Nakai-lab 12 tagde 191 dubbele alaninemutanten met aminozuren 356 tot 736 op de VP1 van AAV9 met een paar 12-nucleotide barcodes. Met behulp van NGS werd de bibliotheek in vivo gescreend op galactosebinding en andere eigenschappen¹². Marsic en collega's bakenden de biodistributie van AAV-varianten af met behulp van ook een dubbele barcorded analyse 1 jaar later¹³. Een meer recente studie bij niet-menselijke primaten vergeleek de biodistributie in het centrale zenuwstelsel van 29 capsiden met behulp van verschillende toedieningsroutes²³. Ons lab heeft onlangs AAV-bibliotheekschermen met streepjescode gepubliceerd van 183 varianten die natuurlijke en technische AAV's bevatten. Deze screenings op DNA- en RNA-niveau leidden tot de identificatie van een zeer myotrope AAV-variant²⁴ bij muizen en andere met een hoge celtypespecificiteit in het muizenbrein²⁵.

Hier beschrijven we de methodologie die in dit werk wordt gebruikt en breiden we deze uit met screening van AAV-peptideweergavebibliotheken. Dit omvat het genereren van AAV2-peptideweergavebibliotheken, een digitale druppel-PCR (dd-PCR) -methode voor kwantificering en ten slotte een NGS-pijplijn om de AAV-varianten te analyseren, deels gebaseerd op het werk van Weinmann en collega's²⁴. Ten slotte wordt een beschrijving gegeven van het genereren van AAV-bibliotheken met streepjescode en de NGS-pijplijn die in dezelfde publicatie wordt gebruikt.

Protocol

1. AAV2 willekeurige 7-mer peptide display bibliotheek voorbereiding

OPMERKING: Voor de voorbereiding van een AAV2 random peptide display library, synthetiseer de gedegenereerde oligonucleotiden als enkelstrengs DNA, zet het om in dubbelstrengs DNA, verteert, ligaat naar het acceptor plasmide en elektroporaat.

1. Ontwerp van gedegenereerde oligonucleotiden
   1. Ordenschik de gedegenereerde oligonucleotiden en vermijd codon bias. In het oligonucleotide 5' CAGTCGGCCAG AG W GGC (X01)⁷ GCCCAGGCGGCTGACGAG 3' komt X01 overeen met 20 codons, die elk coderen voor een van de 20 aminozuren. De W kan A of T zijn, waardoor de codons AGA of AGT worden geproduceerd, die coderen voor de aminozuren arginine (R) of serine (S).
   2. Bestel de versterkingsprimer: 5' CTCGTCAGCCGCCTGG 3' (zie figuur 1 voor details). Hierdoor ontstaat de volgende eiwitinzet: R/S G_{X 7}. De theoretische diversiteit wordt als volgt berekend: 1 x 2 x 20⁷ = 2,56 x 10⁹ unieke varianten.
      OPMERKING: Opgemerkt moet worden dat deze diversiteit kan worden beperkt door de transformatie-efficiëntie.
2. Tweede-strengs synthese
   1. Resuspensie van beide oligonucleotiden (gedegenereerde oligonucleotiden en amplificatieprimer) tot een eindconcentratie van 100 μM met TE-buffer.
      1. Stel voor de PCR-reactie een 50 μL-reactie in met 1 μL van elke primer, 10 μL van de buffer, 1,5 μL DMSO, 0,5 μL dNTPs (10 mM), 0,5 μL Hi-fidelity Hot Start Polymerase II en 35,5 μL nucleasevrij water.
      2. Breng de reactie over op een thermocycler en voer een pre-incubatiestap uit gedurende 10 s bij 98 °C, gevolgd door drie cycli van 10 s bij 98 °C, 30 s bij 59 °C en 10 s bij 72 °C, vervolgens 5 minuten bij 72 °C en een laatste koelstap.
   2. Zuiver de reactie met behulp van een nucleotideverwijderingskit en elueer in 100 μL nucleasevrij water.
   3. Bevestig de efficiëntie van de tweedestrengssynthese door analyse op een bioanalysator (zie figuur 2). Analyseer de grootte en zuiverheid van de dubbelstrengs insert door 1 μL van de reactie op een microfluïdische chip uit een DNA 1000-reagentiakit te laden volgens de instructies van de fabrikant. Deze kit is geoptimaliseerd om de grootte en concentratie van dubbelstrengs DNA-fragmenten van 25-1.000 bps te meten.
3. Vertering van insert en plasmidevector
   1. Ververs 85 μL van de gezuiverde insert met 10 μL 10x buffer en 5 μL BglI-enzym in een laatste reactievolume van 100 μL (zie figuur 1 voor details). Incubeer 's nachts bij 37 °C. Zuiver met behulp van een nucleotideverwijderingskit, elueer in 50 μL nucleasevrij water en kwantificeer met behulp van het type "Oligo DNA" in een spectrofotometer.
   2. Verteer 10 μg van een replicatie-competent AAV-plasmide (pRep2Cap2_)²⁶ (ITR-geflankeerd viraal genoom) met 20 μL 10x buffer en 10 μL SfiI-enzym in een laatste reactievolume van 200 μL (zie figuur 1 voor details). Incubeer 's nachts bij 50 °C. Zuiver de vector op een 1% agarose-gel met behulp van de gelextractiekit gevolgd door een extra zuiveringsstap met behulp van een DNA-zuiveringskit. Kwantificeer de concentratie in een spectrofotometer.
4. Ligatie van insert naar vector
   1. Ligate 955 ng plasmidevector met 45 ng insert met 2 μL buffer en 2 μL ligase in een ligatiereactie van 20 μL. Incubeer 's nachts bij 16 °C, gevolgd door 10 minuten bij 70 °C om de ligase te inactiveren.
5. Transformatie, complexiteitsberekening en voorbereiding van de plasmidebibliotheek
   1. Zuiver de reactie met een DNA-zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant. Elueer de reactie in ongeveer 80% van het startvolume nucleasevrij water en sla het op ijs op voor latere transformatie.
   2. Transformeer elektrocompetente cellen: ontdooi één injectieflacon met elektrocompetente cellen op ijs gedurende 10 minuten. Voeg vervolgens 1-2 μL van de gezuiverde ligatiereactie toe aan 30 μL (één injectieflacon) elektrocompetente cellen en meng door zachtjes te tikken. Pipetteer vervolgens het cel/DNA-mengsel voorzichtig tot een voorgekoelde elektroporatiecuvet met een opening van 1 mm zonder luchtbellen in te brengen.
   3. Elektroporaat met de volgende instellingen: 1800 V, 600 Ω en 10 μF. Voeg binnen 10 s na de elektroporatiepuls 970 μL voorverwarmde herstelmedia (voorzien van de elektrocompetente cellen) toe aan de cuvette en meng door pipetteren. Breng ten slotte de cellen over naar een microcentrifugebuis en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C bij 250 tpm. Om een gewenste diversiteit te bereiken, voert u 10-100 reacties uit en bundelt u na incubatie alle reacties in één buis.
   4. Bereken de diversiteit door 10 μL van de gepoolde transformaties 10-, 100- of 1.000-voudig in PBS te verdunnen en 100 μL te verspreiden over voedingsagarplaten die het juiste antibioticum bevatten (75 mg / ml ampicilline). Incubeer de agarplaten een nacht bij 37 °C en tel vervolgens de kolonies op de agarplaten.
   5. Bereken de theoretische diversiteit als volgt:
      Theoretische maximale diversiteit = 10 x verdunningsfactor x aantal kolonies x aantal elektroporatiereacties.
      OPMERKING: Om de kwaliteit van de bibliotheek te bevestigen, sequentieert u ten minste 20 kolonies door Sanger-sequencing. De meeste klonen moeten een insert bevatten en ze moeten allemaal uniek zijn.
   6. Ent 400-1.000 ml LB-medium met het juiste antibioticum met de rest van de gepoolde transformaties en incubeer 's nachts bij 37 °C, 180 tpm.
6. Voorbereiding van plasmidebibliotheek
   1. Bereid van de nachtkweek een glycerolbouillon (meng gelijke volumes bacteriecultuur en 50% glyceroloplossing in nucleasevrij water en vries in bij -80 °C) en zuiver de plasmidebibliotheek met behulp van een plasmide maxi-kit.
7. Productie van AAV virale bibliotheek
   1. Bereid de virale bibliotheek voor zoals eerder beschreven²⁷. Transfecteer de plasmidebibliotheek (pRep2Cap2_PI, peptide-insert) samen met een adeno-helperplasmide naar HEK293T-cellen met behulp van een transfectiereagens zoals polyethylenimine (PEI).
   2. Verzamel de cellen na 3 dagen en onderwerp ze aan drie cycli van bevriezen-dooi. Zuiver het virale lysaat met behulp van cesiumchloride gradiënt ultracentrifugatie, gevolgd door bufferuitwisseling naar PBS, en concentreer ten slotte de virale deeltjes.
8. AAV-vectortitratie met dd-PCR
   1. Verdun 2 μL van de AAV-vectorvoorraad serieel in 198 μL nucleasevrij water tot een 1:10⁶ eindverdunning. Meng elke keer grondig met een pipet van 200 μL. Voeg één besturingselement zonder sjabloon (NTC) toe als negatief besturingselement.
      OPMERKING: Aanvullende lagere of hogere verdunningen kunnen worden getest (1:10;^5-1:10;⁷).
   2. Bereid een 20x primer-probe mix. Voeg 3,6 μL van elk van de 100 μM primers (vooruit en achteruit, Rep2 en ITR), 1 μL elk van de 100 μM dd-PCR probes (Rep2 en ITR) en 3,6 μL nucleasevrij water toe aan een 1,5 ml centrifugebuis.
      OPMERKING: De AAV-bibliotheek wordt gemeten met behulp van een transgen-gerichte primer-probe set (Rep2) gedetecteerd met een FAM-gelabelde probe, en een ITR-gerichte primer-probe set gedetecteerd met een HEX-gelabelde probe.
   3. Bereid een PCR-reactie van 22 μl voor door toevoeging van 5,5 μl monster, 1,1 μl 20x primer-probe-mix, 11 μl dd-PCR-supermix voor sondes (geen dUTP) en 4,4 μl nucleasevrij water. Dit levert concentraties op van respectievelijk 900 nM en 250 nM voor de primers en de sonde.
   4. Genereer de druppels met behulp van een druppelgenerator, breng de reactie over op een plaat met 96 putten, plaats de plaat in een thermocycler en voer een denaturatiestap uit gedurende 10 minuten bij 94 °C, gevolgd door 40 cycli van 30 s bij 94 °C en 1 min bij 58 °C. Verwarm vervolgens het polymerase gedurende 10 minuten bij 98 °C en voeg een laatste koelstap toe. Lees de reacties in een druppellezer en ga verder met de analyse²⁸.
   5. Open het opgeslagen dd-PCR-plaatbestand met behulp van de analysesoftware. Gebruik het drempelgereedschap op het tabblad 1D-amplitude (fluorescentieamplitude versus gebeurtenisnummer) om de negatieve en positieve druppels voor elk kanaal te scheiden, met de NTC als leidraad, en exporteer de gegevens naar een csv-bestand.
   6. Om de vectorconcentratie te berekenen, berekent u eerst de correctiefactor CF met behulp van de formule:
      
      CF bepaalt het aandeel druppels positief voor het transgen [Positieven] dat positief is voor zowel transgen als ITR [Ch1+ Ch2⁺], om de detectie van functionele vectordeeltjes te garanderen. De uiteindelijke vectorconcentratie c kan nu worden berekend met behulp van de volgende vergelijking:
      
      DF is de verdunningsfactor (1:10;^5-1:10;⁷ zoals eerder bepaald). De kopieën per 20 μL/putreactie komen overeen met 5 μL van het verdunde monster. De factor 1.000 corrigeert de schaal naar VG/ml (viraal genoom/ml). Een voorbeeldig titratieresultaat is te zien in tabel 1 en figuur 3.
9. Analyse van de AAV virale bibliotheek door NGS
   1. Versterking van het 96-nucleotide peptide insertiefragment door een 20 μL PCR-reactie op te zetten met behulp van een proeflezende polymerasekit (2x; zie figuur 4). Voeg 1 μL AAV-bouillon met 1 x 10⁸ vg, 0,5 μL van elk van 100 μM primer (NGS_forward en NGS_reverse) en 10 μL van het enzymmengsel toe aan de reactie. Stel het uiteindelijke volume in op 20 μL met nucleasevrij water.
   2. Breng de reactie over op een thermocycler en voer een denaturatiestap uit gedurende 3 minuten bij 98 °C, gevolgd door 30-35 cycli van 10 s bij 98 °C, 10 s bij 59 °C en 20 s bij 72 °C, gevolgd door 5 minuten bij 72 °C en een laatste koelstap.
   3. Zuiver de monsters met behulp van een PCR-zuiveringskit. Kwantificeer de concentratie in een spectrofotometer en voer een agarose-gel van 3% uit om de zuiverheid en fragmentgrootte te controleren.
   4. Verwerk de PCR-fragmenten met behulp van het bibliotheeksysteem voor monsters met een lage complexiteit volgens de instructies van de fabrikant voor de voorbereiding van een NGS-bibliotheek. Voer de eindreparatiereactie uit met 30 ng PCR-fragment, gevolgd door adapterligatie en PCR-versterking gedurende 10 cycli. Gebruik de PCR-zuiveringskit voor de zuivering van de reacties.
   5. Verwerk de eindproducten op een Bioanalyzer om de grootte en zuiverheid te controleren, met behulp van een DNA-reagentiakit volgens de instructies van de fabrikant.
   6. Kwantificeer de amplicons met behulp van een fluorometer en pool ze. Kwantificeer de uiteindelijke gepoolde NGS-bibliotheek opnieuw op een fluorometer (volgens de instructies van de fabrikant) en controleer de kwaliteit op een Bioanalyzer.
   7. Sequentieer de NGS-bibliotheken in een single-end (SE) modus, met behulp van een 75-cyclus high output kit, met een leeslengte van 84 en een index 1 van 8.
      OPMERKING: Sequencing van de voorbeelden in dit artikel werd uitgevoerd in de GeneCore-faciliteit van EMBL Heidelberg (http://www.genecore.embl.de/).
   8. Analyseer de NGS-sequencinggegevens met Python 3 en biopython. De bestanden zijn te vinden op https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022 (alternatief op https://doi.org/10.5281/zenodo.7032215). De NGS-analyse bestaat uit twee stappen.
      1. Zoek in de eerste stap in de sequentiebestanden naar sequenties die aan bepaalde criteria voldoen (aanwezigheid van herkenningssequenties die de invoegplaats flankeren) (zie figuur 4, stap 1.9.8.5.). Dit wordt gedaan met behulp van een script (Script #1) en een configuratiebestand dat de benodigde informatie biedt. Zodra de juiste volgorde is geïdentificeerd, extraheert en slaat het programma de reeks op in het uitvoerbestand, een txt-bestand met dezelfde naam als het sequencingbestand.
      2. De tweede stap is de analyse van de uitvoerbestanden. De sequenties in de bibliotheek beginnen met een van de zes nucleotiden (AGWggc, W =A/T) in de negen aminozuurinzetstukken. Op basis van deze startvolgorde wordt het peptide vertaald. Dit genereert de uitvoerbestanden die de peptidevarianten (PV's) bevatten.
      3. Bereid twee mappen voor: Script en Gegevens. Kopieer naar de map Data de gzip-gecomprimeerde bestanden die het resultaat zijn van de sequencing. Kopieer naar de map Script de volgende bestanden, Python-bestand: Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py; Python-bestand: Script #2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py; Configuratiebestand: Barcode_Script_JoVE.conf; en LUT-bestand (Look-up table): Zuordnung.txt.
      4. Voordat u de scripts uitvoert, bewerkt u de volgende bestanden in de map Script. Open het bestand "Zuordnung.txt" en voeg in twee door tabs gescheiden kolommen de namen van de gzip-bestanden (kolom 1) en de gewenste eindnaam (kolom 2; door tabs gescheiden waarden) toe.
         OPMERKING: Voorbeeld txt-bestanden zijn te vinden in de GitHub-map "PV_analysis_script". De bestanden in de GitHub-map zijn voorbereid voor de analyse van drie voorbeeldgegevens uit de bovenstaande bibliotheek: xaa.txt.gz, xab.txt.gz en xac.txt.gz. De uitvoerbestanden zijn ook aanwezig.
      5. Wijzig de volgende variabelen in het configuratiebestand "Barcode_Script_JoVE.conf":
         my_dir = "~/Data/"
         filename_sample_file = "~/Script/Zuordnung.txt"
         De sequentiespecifieke variabelen: BCV_size = 27, BCV_links = TCCAGGGCCAG, BCV_rechts = GCCCAGG, BCV_loc = 30, BCV_marge = 8, BCV_{left_revcomp} = GCCGCCTGGGC, BCV_{right_revcomp} = CTGGCCC en BCV_{loc_revcomp} = 41 (zie figuur 4 voor details).
      6. Gebruik de volgende opdracht om de detectie en extractie van de variantvolgorde aan te roepen:
         >python3 ~/Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
         OPMERKING: De uitvoer zijn txt-bestanden met de geëxtraheerde DNA-sequenties en hun aantal reads. De koptekst van dit bestand bevat statistische gegevens (d.w.z. het totale aantal leesbewerkingen en de geëxtraheerde leesbewerkingen). Deze gegevens worden overgebracht naar de volgende bestanden. Deze txt-gegevens zijn de invoerbestanden voor Script #2, waarin de DNA-sequenties worden vertaald, gerangschikt en geanalyseerd.
      7. Voer PV-extractie en -analyse uit met de volgende opdracht:
         >python3 ~/Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
      8. Analyseer de tekstuitvoerbestanden van Script #2. De uitvoerbestanden van Script #2 worden genoemd met behulp van de tweede kolom van de LUT in "Zuordnung.txt" met extensies op basis van het type analyse.
         OPMERKING: Zorg ervoor dat de drie uitvoerbestanden statistische gegevens bevatten in de eerste rijen ("# van geldige PV-reads", "# van Ongeldige PV-reads" en "# van unieke PV-reads"), een eerste kolom met de index van elke DNA-sequentie van de input txt-bestanden (uitvoer van Script #1), en de volgende kolommen: (1) "... analyzed_all.csv": "Sample:" (DNA-sequentie), "#" (aantal reads), "Frw or Rev" (forward of reverse read) en "PVs" (vertaalde peptidesequentie). De ongeldige reeksen hebben "NA" en "niet geldig" in de laatste twee kolommen. (2) "... analyzed_validSeq.csv": hetzelfde als het vorige bestand, gefilterd op geldige reeksen. (3) "... analyzed_PV.csv": "PV's" (vertaalde peptidevolgorde), "#" (aantal reads) en "count" (de frw- en rev-tellingen in de vorige bestanden worden samengevoegd en de telling krijgt 1 of 2).
      9. Visualiseer de uitvoerbestanden met behulp van beschikbare software op basis van de behoeften van de gebruiker.

2. AAV2 willekeurige 7-mer peptide display bibliotheek selectie

1. Gebruik de AAV-bibliotheek na kwantificering en kwaliteitscontrole (sectie 1) voor gerichte evolutie in een model naar keuze om iteratief te selecteren op kandidaten met gewenste eigenschappen (zie figuur 5)^16,18,21.
   OPMERKING: Deze kandidaten worden vervolgens gebruikt voor het genereren van een bibliotheek met streepjescodes, zoals hieronder beschreven in sectie 3.

3. Barcoded AAV capsid bibliotheek voorbereiding en analyse

OPMERKING: Na de identificatie van een reeks potentieel specifieke en efficiënte AAV-capsiden in het peptidescherm, controleert u de functionaliteit van de geïdentificeerde peptidesequenties en vergelijkt u deze met een reeks veelgebruikte of goed beschreven referentie-AAV-capsidvarianten. Om dit te doen, wordt de capsid-reeks ingevoegd in een Rep / Cap-helperconstructie zonder ITR's.

1. Productie van AAV-bibliotheek met streepjescode
   1. Voer recombinante AAV-productie uit voor elke capsid-variant met behulp van het drie-plasmidesysteem, zoals eerder beschreven²⁴.
      OPMERKING: Om de verschillende capside-varianten te onderscheiden, herbergt de ITR-geflankeerde reporter transgene plasmide een unieke barcode van 15 nucleotiden lang. De barcode bevindt zich op de 3' UTR (onvertaald gebied) tussen het enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) en het polyA signaal (zie figuur 6A). EYFP-expressie wordt aangedreven door een sterke alomtegenwoordige cytomegalovirus (CMV) promotor die voldoende niveaus van RNA-transcripten biedt.
   2. Ontwerp barcodes van 15 nucleotiden in lengte met homopolymeren van minder dan drie nucleotiden, GC-gehalte van <65%²⁹ en een Hammingafstand groter dan vier nucleotiden²⁴.
   3. Produceer elke capside afzonderlijk in combinatie met een transgeen plasmide met een unieke barcode. Op deze manier wordt elke capsid-variant getagd met een afzonderlijke streepjescode die zijn specifieke tracking mogelijk maakt (zie figuur 6B).
2. AAV-vectortitratie met dd-PCR
   1. Voer de AAV-titratie uit zoals eerder beschreven in paragraaf 1.8, door het Rep2-primerpaar te vervangen door het YFP-primerpaar.
   2. Kwantificeer de individuele AAV-producties en pool gelijke hoeveelheden van elke productie om de uiteindelijke bibliotheek met streepjescodes te genereren.
   3. Kwantificeer de uiteindelijke bibliotheek opnieuw om de uiteindelijke concentratie en kwaliteit te controleren (zie figuur 7).
3. Barcoded AAV bibliotheek in vivo applicatie
   1. Pas de AAV-bibliotheek met streepjescode systemisch toe op het modelsysteem van keuze (bijvoorbeeld systemisch bij muizen²⁴).
   2. Verzamel ON- en OFF-target weefsels (d.w.z. lever, long, hart, middenrif, gladde spieren, twaalfvingerige darm, pancreas, dikke darm, biceps, eierstokken, maag, binnenoor, nier, abdominale aorta, thoracale aorta, hersenen, bruin en wit vet en milt) of celtypen op basis van het experiment. Vries ze in bij -80 °C, extraheer het DNA/RNA en pas NGS-kwantificeringsanalyse toe, zoals beschreven in de volgende sectie.
4. DNA/RNA extractie
   1. Extraheer het DNA en RNA uit de weefsels van belang met behulp van de DNA / RNA Mini Kit.
   2. Plaats een klein stukje van het weefsel van belang (1 mm³, ongeveer 5 mg) in een reactiebuis van 2 ml.
   3. Voeg 350 μL lysisbuffer gemengd met β-mercaptoethanol (1%) en 5 mm stalen kralen toe aan het weefsel (behandel monsters met β-mercaptoethanol onder een zuurkast).
   4. Homogeniseer het weefsel in een weefselLyser gedurende 45 s bij 40 Hz.
   5. Voeg 10 μL proteïnase K (10 mg/ml) toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 55 °C tijdens het schudden bij 400 tpm.
   6. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur, verzamel het supernatant en ga verder met het protocol van de fabrikant van de DNA / RNA-kit.
   7. Splits de wasstap in twee stappen met 350 μL wasbuffer in elke stap. Tussen deze wasstappen door verteert u het overgebleven DNA op de kolom met RNase-vrije DNase I. Voeg 80 μL van de DNase I-oplossing, bereid volgens de instructies van de fabrikant, toe aan de kolom en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
   8. Elueer RNA/DNA uit de kolom met nucleasevrij water. Bewaar het geïsoleerde RNA bij -80 °C en het gDNA bij -20 °C.
5. cDNA synthese
   1. Onderwerp de RNA-monsters aan een nieuwe ronde DNase I-behandeling van 15-30 minuten (voor volledige verwijdering van besmettend DNA uit de RNA-monsters) vóór de omgekeerde transcriptiereactie. Voeg 1 μL van de DNase I-oplossing, 4 μL buffer (meegeleverd met de kit) en nucleasevrij water toe tot een eindvolume van 40 μL tot 212 ng RNA. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en inactiveer gedurende 10 minuten bij 70 °C.
   2. Synthetiseer cDNA met behulp van 150 ng RNA met behulp van een kit volgens de instructies van de fabrikant. Neem controles op zonder de reverse transcriptase, om ervoor te zorgen dat er geen besmet viraal DNA uit het monster komt. Het cDNA wordt bewaard bij -20 °C.
      OPMERKING: De hoeveelheid invoer-RNA voor optimale omgekeerde transcriptie kan variëren afhankelijk van het weefseltype en de verwachte transductie-efficiëntie in het betreffende weefsel.
6. Analyse van de virale AAV-bibliotheek (in-vivo) door NGS
   1. Om tegen lage kosten een hoge sequencingdiepte te bereiken, voert u NGS uit via Illumina-sequencing zoals eerder beschreven (paragraaf 1.9). Versterk de streepjescodevolgorde en ligate vervolgens de sequencingadapters naar het amplicon.
   2. Vanwege de korte leeslengte en de ligatie van de sequencingadapters aan beide zijden van het amplicon, controleert u bij het ontwerpen of het amplicon voldoende klein is om de aanwezigheid van de barcodesequentie in de gelezen NGS te garanderen. Voor de sequencing van de barcodes in de virale genomen en de virale transcripten is het PCR-amplicon ontworpen om 113 bp lang te zijn (zie figuur 8).
   3. Versterk het gebied met streepjescode met de primers BC-seq vooruit en BC-seq achteruit. Bereid de volgende PCR-reactie voor: 0,5 μL Hi-fidelity DNA-polymerase, 10 μL 5x buffer, 0,25 μL van elke 100 μM primer (BC-seq fw/BC-seq rv) en 1 μl 10 mM dNTPs. Gebruik 25 ng van het cDNA of DNA/reactie als sjabloon en pas het uiteindelijke volume aan tot 50 μL met nucleasevrij water.
   4. Bereid de PCR master-mix onder een schone PCR-kap om besmetting te voorkomen. Gebruik de volgende cyclusomstandigheden: 30 s bij 98 °C, gevolgd door 40 cycli bij 98 °C gedurende 10 s en 72 °C gedurende 20 s, en een laatste stap van 5 minuten bij 72 °C.
   5. Neem PCR-controles op om de afwezigheid van besmettend DNA in de PCR-mastermix te bevestigen. Neem voor de cDNA-monsters de controles op zonder reverse transcriptase. Voeg ten slotte een voorbeeld toe aan de AAV-invoerbibliotheek. Deze informatie wordt gebruikt om het Normalization_Variant.txt bestand te genereren dat in de analyse wordt gebruikt.
   6. Controleer de grootte van het PCR-fragment van elk monster door gel-elektroforese vóór PCR-zuivering. Dit laatste wordt bereikt door gebruik te maken van in de handel verkrijgbare magnetische kralen of op kolommen gebaseerde DNA-zuiveringssystemen (zie tabel met materialen).
   7. Bereid de NGS-bibliotheek met behulp van het bibliotheeksysteem voor op monsters met een lage complexiteit volgens de instructies van de fabrikant, zoals eerder beschreven in rubriek 1.9.
   8. Bepaal de DNA-concentratie via de dsDNA HS Kit en analyseer de kwaliteit van de bibliotheek zoals eerder beschreven (paragraaf 1.9.6), gevolgd door pooling. Kwantificeer de gepoolde bibliotheek op een fluorometer en beoordeel de kwaliteit op een Bioanalyzer.
   9. Voer NGS-sequencing uit zoals besproken in paragraaf 1.9.7.
   10. Kwantificeer met qPCR het kopienummer van het transgen (virale genomen) en het huishoudgen om de verdeling van de gepoolde bibliotheek tussen weefsels of organen op het DNA te beoordelen.
   11. Stel als volgt een qPCR-reactie van 30 μL in om het aantal kopieën van EYFP (transgen) en GAPDH (glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase, huishoudgen) te bepalen:
       1. Bereid een primer/probe-mix van 60x voor EYFP (1,5 μM YFP_fw, 1,5 μM YFP_rv en 0,6 μM YFP_probe; zie Tabel met materialen). Gebruik GAPDH primer/probe mix (zie Tabel van Materialen) om het kopienummer van het huishoudstergen te bepalen. Zet de reactie op ijs.
       2. Bereid een PCR-mastermix voor (15 μL, zie Materiaaltabel) en voeg 60x primer/probe-mix (0,5 μL) toe voor alle monsters en standaarden (om kopienummers voor de normen te berekenen, gebruikt u de volgende link: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html). Zet de reactie op ijs.
       3. Breng 15,5 μL van het hoofdmengsel over in een plaat met 96 putten en voeg 14,5 μL monster (75 ng totale DNA-concentratie) of standaard toe aan de betreffende put. Sluit de 96-putplaat af met folie, vortex en spin kort.
       4. Breng 10 μL van elk monster in tweevoud over in een plaat met 384 putten. Sluit de plaat af met folie en draai op 800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
       5. Incubeer het reactiemengsel in een thermocycler met een begintemperatuur van 50 °C gedurende 2 minuten, gevolgd door een eerste activeringsstap van 10 minuten bij 95 °C. Voer 40 cycli van denaturatie uit bij 95 °C gedurende 15 s en gloeien/verlengen bij 60 °C gedurende 1 min²⁴.
       6. Om het aantal diploïde genomen (dg) te verkrijgen, gebruikt u het GAPDH-kopienummer en deelt u door twee. Neem vervolgens de waarde van het EYFP-kopienummer en deel door het aantal dg, wat resulteert in vectorgenomen per diploïde genoom (vg / dg). Gebruik deze waarde om het Normalization_Organ.txt bestand voor de bioinformatische analyse te genereren.
   12. Voer de analyse uit van de NGS-sequencinggegevens zoals Weinmann et al.²⁴, met behulp van aangepaste code in Python3 (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). De workflow omvat de detectie van barcodesequenties geleid door flankerende sequenties, hun lengte en locatie (Script # 1_BarcodeDetection.py), evenals analyse van barcodeverrijking en distributie over de set weefsels (Script # 2_BarcodeAnalysis.py).
       1. Detecteer streepjescodes en wijs ze toe aan AAV-varianten. Plaats de sequencinggegevens als gearchiveerde fastq-bestanden in één map (bijvoorbeeld "Data_to_analyze"). Het sequencinggegevensbestand voor de invoerbibliotheek is opgenomen in deze map en wordt alleen gebruikt om de capsid-verhoudingen in de invoerbibliotheek te berekenen.
       2. Voordat u het script uitvoert, maakt u twee door tabs gescheiden tekstbestanden: het bestand capsid-varianten (zie voorbeeldbestand "Varianten.txt") met de streepjescodesequenties die zijn toegewezen aan AAV-capsidvariantnamen, en het contaminatiebestand (zie "Contaminaties.txt") met streepjescodesequenties die afkomstig zijn van mogelijke verontreiniging (andere streepjescodes die beschikbaar zijn in het laboratorium, wat bijdraagt aan besmetting).
       3. Bewerk ten slotte het configuratiebestand "Barcode_Script.conf" om de volgende informatie op te nemen: pad naar map met sequencinggegevens (bijv. "Data_to_analyze"), volgorde van flankerende gebieden van de streepjescodes, hun positie en venstergrootte voor barcodedetectie (vergelijkbaar met 1.9.8.5, zie Figuur 8).
       4. Gebruik de volgende opdracht om streepjescodedetectie aan te roepen met de meegeleverde paden naar Script#1_BarcodeDetection.py- en configuratiebestanden:
          >python3 ~/Script#1_BarcodeDetection.py ~/Barcode_Script.conf
          OPMERKING: De uitvoer van Script #1_BarcodeDetection.py-uitvoering bestaat uit tekstbestanden met het aantal gelezen waarden per capsid-variant, evenals het totale aantal leesbewerkingen dat is hersteld van de onbewerkte gegevens.
       5. Evalueer de verdeling van AAV-capsiden met streepjescode over weefsels of organen door Script # 2_BarcodeAnalysis.py uit te voeren samen met de volgende txt-bestanden:
          1. Wijs in het bestand "Zuordnung.txt" de naam toe aan elk txt-bestand dat is verkregen uit de barcodedetectierun aan een weefsel- / orgaannaam: namen van txt-bestanden in de eerste kolom en overeenkomstige weefsel- / orgaannamen in door tabs gescheiden toewijzing.
             OPMERKING: Controleer bijvoorbeeld de map "Voorbeeld" (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). Van belang is dat de weefsel- / orgaannaam tekens kan bevatten die cDNA- of gDNA-meting en biologisch replicatienummer (M1, M2, enz.) definiëren.
          2. Maak een tekstbestand "organen.txt" met de lijst met namen voor ON- en OFF-doelorganen, die overeenkomen met de namen in het toewijzingsbestand "Zuordnung.txt" (zie map "Voorbeeld": https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022).
          3. Maak "Normalization_Organ.txt" en "Normalization_Variant.txt" door tabs gescheiden tekstbestanden met genormaliseerde waarden voor alle capsid-varianten en alle organen / weefsels. Schrijf in de eerste kolom van het bestand "Normalization_Organ.txt" de namen die voor elk orgaan zijn gegeven (zoals in het toewijzingsbestand "Zuordnung.txt") en in de tweede kolom de normalisatiewaarden voor de overeenkomstige weefsels, gegenereerd in paragraaf 3.6.11.
          4. Vul de eerste kolom van het bestand "Normalization_Variant.txt" met de lijst met capsid-namen en de tweede kolom met de genormaliseerde waarden van de gelezen tellingen voor elke capsid in de gepoolde bibliotheek (normalisatie kan worden berekend op basis van het txt-uitvoerbestand voor de invoerbibliotheek die voortvloeit uit het eerste script).
          5. Bewerk het configuratiebestand door de volledige paden naar alle hierboven genoemde extra bestanden op te geven. Voer Script#2_BarcodeAnalysis.py uit als:
             >python3 /Script#2_BarcodeAnalysis.py ~/Barcode_Script.conf
             OPMERKING: Het barcode-analysescript voert verschillende bestanden uit: tekstbestanden met relatieve concentratie (RC) -waarden van capsid-verdeling binnen verschillende weefsels op basis van meerdere normalisatiestappen die eerder zijn beschreven, en het spreadsheetbestand dat tekstbestandsgegevens combineert tot samengevoegde matrixgegevens. Deze laatste kan worden gebruikt voor clusteranalyse en visualisatie.
          6. Visualiseer de gegevens en voer clusteranalyse van de matrixgegevens uit om capside-eigenschappen te onderscheiden en hun overeenkomsten te evalueren op basis van RC-profielen over weefsels. Gebruik het aanvullende script PCA_heatmap_plot. R geplaatst in de repository:
             >Rscript --vanille ~/PCA. R ~/relatieve concentratie.xls
             OPMERKING: Het script neemt relatieveconcentratie.xls bestanden als invoer en genereert twee plots van hiërarchische cluster heatmap en principal component analysis (PCA).
          7. Als u plots (assen van heatmap, hoofdcomponenten van PCA) of png-parameters (kleur, grootte, labeling) wilt wijzigen, opent u het R-script en volgt u de instructies in de secties met opmerkingen.

Resultaten

Genereren van een AAV2 peptide display library. Als eerste stap naar de selectie van technische AAV's wordt het genereren van een plasmidebibliotheek beschreven. De peptide insert wordt geproduceerd met behulp van gedegenereerde primers. Het verminderen van de combinatie van codons in die van 64 tot 20 heeft de voordelen van het elimineren van stopcodons en het vergemakkelijken van NGS-analyse, door de bibliotheekdiversiteit op het DNA te verminderen, maar niet op het eiwitniveau. De oligonucleotide-ins...

Discussie

In dit protocol worden de stappen beschreven die nodig zijn voor peptideweergave AAV capsid engineering en voor barcoded AAV-bibliotheekscreening, evenals voor bioinformatische analyse van bibliotheeksamenstelling en capsid-prestaties. Dit protocol richt zich op de stappen die de bioinformatische analyse van dit soort bibliotheken vergemakkelijken, omdat de meeste virologielaboratoria achterblijven in programmeervaardigheden om hun vaardigheid in moleculaire biologietechnieken te evenaren. Beide soorten bibliotheken zijn...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Amplification primer	ELLA Biotech (Munich, Germany)	-	Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
Agilent DNA 1000 Reagents	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	5067-1504	DNA fragment validation
Agilent 2100 Bioanalyzer System	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	G2938C	DNA fragment validation
AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	80204	DNA/RNA extraction
Agilent DNA 1000 Reagents	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	5067-1504	NGS Library preparation
Agilent 2100 Bioanalyzer System	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	G2938C	NGS Library preparation
BC-seq fw:	IDT (San Joce, CA, CA, USA)	ATCACTCTCGGCATGGACGAGC	NGS Library preparation
BC-seq rv:	IDT (San Joce, CA, CA, USA)	GGCTGGCAACTAGAAGGCACA	NGS Library preparation
β-Mercaptoethanol	Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)	44-420-3250ML	DNA/RNA extraction
BglI	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	R0143	Digestion of double-stranded insert
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1851196	dd-PCR cycler
dNTPS	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	N0447S	NGS Library preparation
ddPCR Supermix for probes (no dUTP)	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863024	dd-PCR supermix
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863005	dd-PCR droplet generation oil
DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1864008	dd-PCR droplet generation cartridge
DG8 Cartridge Holder	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863051	dd-PCR cartridge holder
Droplet Generator DG8 Gasket	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863009	dd-PCR cover for cartridge
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	12001925	dd-PCR 96-well plate
E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells	Lucigen (Middleton, WI, USA)	60081-1	Electrocompetent cells
Electroporation cuvettes, 1mm	Biozym Scientific (Oldendorf, Germany)	748050	Electroporation
GAPDH primer/probe mix	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	Mm00186825_cn	Taqman qPCR primer
Genepulser Xcell	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1652660	Electroporation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems (Waltham, MA, USA)	4368814	cDNA reverse transcription
ITR_fw	IDT (San Joce, CA, USA)	GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)	dd-PCR primer
ITR_rv	IDT (San Joce, CA, USA)	CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)	dd-PCR primer
ITR_probe	IDT (San Joce, CA, USA)	HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)	dd-PCR probe
Illumina NextSeq 500 system	Illumina Inc (San Diego, CA, USA)	SY-415-1001	NGS Library sequencing
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*	Roche AG (Basel, Switzerland)	KK2600 07958919001	NGS sample prepration
MagnaBot 96 Magnetic Separation Device	Promega GmbH (Madison, WI, USA)	V8151	Sample prepration for NGS library
NanoDrop 2000 spectrophotometer	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	ND-2000	Digestion of double-stranded insert
NGS_frw	Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)	GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC	NGS primer
NGS_rev	Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)	CGC CTT GTG TGT TGA CAT C	NGS primer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)	Illumina Inc (San Diego, CA, USA)	FC-404-2005	NGS Library sequencing
Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit	NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA)	9092-256	NGS Library preparation
PX1 Plate Sealer	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1814000	dd-PCR plate sealer
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1814040	dd-PCR sealing foil
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	F530S	Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA)	24765-1G	AAV library preparation
ProNex Size-Selective Purification System	Promega GmbH (Madison, WI, USA)	NG2002	Sample prepration for NGS library
Phusion Hot Start II Polymerase	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	F549L	NGS Library preparation
Proteinase K	Roche AG (Basel, Switzerland)	5963117103	DNA/RNA extraction
pRep2Cap2_PIS			ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1864002	dd-PCR droplet generator
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)