Methodenartikel

Cellulaire affiniteit van deeltjesgestabiliseerde emulsie om antigeenintern internalisatie te stimuleren

DOI:

10.3791/64406

⸱

2 september 2022

 ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Bio-Applications and Systems Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 2Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, 4University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om efficiënt adjuvantia rationeel te ontwerpen, ontwikkelden we poly-melkzuur-co-glycolzuur nanodeeltjes-gestabiliseerde Pickering-emulsie (PNPE). De PNPE bezat unieke zachtheid en een hydrofobe interface voor krachtig cellulair contact en bood antigeenbelasting met een hoog gehalte, waardoor de cellulaire affiniteit van het afgiftesysteem voor antigeen-presenterende cellen werd verbeterd en efficiënte internalisatie van antigenen werd geïnduceerd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De cellulaire affiniteit van micro- / nanodeeltjes is de voorwaarde voor cellulaire herkenning, cellulaire opname en activering, die essentieel zijn voor medicijnafgifte en immuunrespons. De huidige studie kwam voort uit de observatie dat de effecten van lading, grootte en vorm van vaste deeltjes op celaffiniteit meestal worden overwogen, maar we realiseren ons zelden de essentiële rol van zachtheid, dynamisch herstructureringsfenomeen en complexe interface-interactie in cellulaire affiniteit. Hier ontwikkelden we poly-lactic-co-glycol acid (PLGA) nanodeeltjes-gestabiliseerde Pickering-emulsie (PNPE) die de tekortkomingen van rigide vormen overwon en de flexibiliteit en vloeibaarheid van pathogenen simuleerde. Er werd een methode opgezet om de affiniteit van PNPE met celoppervlakken te testen en de daaropvolgende internalisatie door immuuncellen uit te werken. De affiniteit van PNPE met bio-mimetische extracellulaire blaasjes (bEV's) - de vervanging voor beenmergdendylactische cellen (BMDC's) - werd bepaald met behulp van een kwartskristalmicrobalans met dissipatiemonitoring (QCM-D), die real-time monitoring van cel-emulsieadhesie mogelijk maakte. Vervolgens werd de PNPE gebruikt om het antigeen (ovalbumine, OVA) af te leveren en werd de opname van de antigenen door BMDC's waargenomen met behulp van confocale laserscanmicroscoop (CLSM). Representatieve resultaten toonden aan dat de PNPE onmiddellijk de frequentie (ΔF) verminderde wanneer het de bEV's tegenkwam, wat wijst op een snelle hechting en hoge affiniteit van de PNPE voor de BMDC's. PNPE vertoonde een significant sterkere binding aan het celmembraan dan PLGA-microdeeltjes (PMP's) en AddaVax-adjuvans (aangeduid als oppervlakteactieven-gestabiliseerde nano-emulsie [SSE]). Bovendien werd, als gevolg van de verbeterde cellulaire affiniteit met de immunocyten door dynamische krommingsveranderingen en laterale diffusies, de opname van antigeen vervolgens verhoogd in vergelijking met PMP's en SSE. Dit protocol biedt inzichten voor het ontwerpen van nieuwe formuleringen met een hoge celaffiniteit en efficiënte antigeeninternalisatie, en biedt een platform voor de ontwikkeling van efficiënte vaccins.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om epidemische, chronische en infectieziekten te bestrijden, is het noodzakelijk om effectieve adjuvantia te ontwikkelen voor profylactische en therapeutische vaccinaties 1,2. Idealiter zouden de adjuvantia een uitstekende veiligheid en immuunactivatiemoeten hebben 3,4,5. Effectieve opname en proces van antigenen door antigeen-presenterende cellen (APC's) worden beschouwd als een essentiële fase in de stroomafwaartse signaleringscascades en initiatie van de immuunrespons 6,7,8. Vandaar dat het verkrijgen van een duidelijk begrip van het mechanisme van interactie van immuuncellen met antigenen en het ontwerpen van adjuvantia om de internalisatie te verbeteren efficiënte strategieën zijn om de efficiëntie van vaccins te verbeteren.

Micro-/nanodeeltjes met unieke eigenschappen zijn eerder onderzocht als antigeenafgiftesystemen om de cellulaire opname van antigenen en de cellulaire interactie met pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen te bemiddelen 9,10. Bij contact met cellen beginnen toedieningssystemen te interageren met de extracellulaire matrix en het celmembraan, wat leidde tot internalisatie en daaropvolgende cellulaire reacties11,12. Eerdere studies hebben aan het licht gebracht dat de internalisatie van deeltjes plaatsvindt door celmembraan-deeltjesadhesie13, gevolgd door flexibele vervorming van het celmembraan en diffusie van de receptor naar het oppervlaktemembraan 14,15. Onder deze omstandigheden zijn de eigenschappen van het toedieningssysteem afhankelijk van de affiniteit met APC's, die vervolgens van invloed zijn op de opnamehoeveelheid16,17.

Om inzicht te krijgen in het ontwerp van het afgiftesysteem voor een verbeterde immuunrespons, zijn uitgebreide inspanningen gericht op het onderzoek naar de relatie tussen de eigenschappen van deeltjes en cellulaire opname. De huidige studie kwam voort uit de observatie dat vaste micro- / nanodeeltjes met verschillende ladingen, maten en vormen vaak in dit licht worden bestudeerd, terwijl de rol van vloeibaarheid in antigeeninneralisatie zelden wordt onderzocht18,19. In feite vertoonden de zachte deeltjes tijdens de hechting dynamische krommingsveranderingen en laterale diffusies om het contactoppervlak voor multivalente interacties te vergroten, die nauwelijks kunnen worden gerepliceerd door de vaste deeltjes20,21. Bovendien zijn celmembranen fosfolipide bilayers (sfingolipiden of cholesterol) op de plaats van opname, en hydrofobe stoffen kunnen de conformationele entropie van lipiden veranderen, waardoor de hoeveelheid energie die nodig is voor cellulaire opnamewordt verminderd 22,23. Het versterken van de mobiliteit en het bevorderen van hydrofobiciteit van het toedieningssysteem kan dus een effectieve strategie zijn voor het versterken van antigeeninneralisatie om de immuunrespons te verbeteren.

Pickering-emulsie, gestabiliseerd door vaste deeltjes die zijn geassembleerd op het grensvlak tussen twee onmengbare vloeistoffen, zijn op grote schaal gebruikt op biologisch gebied24,25. In feite bepalen de aggregerende deeltjes op de olie / water-interface de formulering van multi-level structuren, die multi-level delivery system-cellulaire interacties bevorderen en verder multifunctionele fysiochemische eigenschappen induceren bij medicijnafgifte. Vanwege hun vervormbaarheid en laterale mobiliteit werd verwacht dat Pickering-emulsies in multivalente cellulaire interactie met de immunocyten zouden komen en door de membraaneiwitten zouden worden herkend26. Bovendien, omdat olieachtige micelkernen in Pickering-emulsies niet volledig bedekt zijn met vaste deeltjes, bezitten Pickering-emulsies openingen van verschillende grootte tussen deeltjes op de olie / water-interface, die een hogere hydrofobiciteit veroorzaken. Het is dus cruciaal om de affiniteit van Pickering-emulsies met APC's te onderzoeken en uit te weiden over de daaropvolgende internalisatie om efficiënte adjuvantia te ontwikkelen.

Op basis van deze overwegingen hebben we een PLGA nanodeeltjes-gestabiliseerde Pickering-emulsie (PNPE) ontworpen als een fluiditeitsvaccinafgiftesysteem dat ook heeft bijgedragen aan het verkrijgen van waardevolle inzichten in de affiniteit van de PNPE met BMDC's en cellulaire internalisatie. De real-time hechting van bio-mimetische extracellulaire blaasjes (bEV's; een vervanging van BMDC's) aan PNPE werd gemonitord via een labelvrije methode met behulp van een kwartskristalmicrobalans met dissipatiemonitoring (QCM-D). Na karakterisering van de affiniteit van PNPE met BMDC's, werd confocale laserscanmicroscopie (CLSM) gebruikt om de antigeenopname te bepalen. Het resultaat duidde op de hogere affiniteit van PNPE met BMDC's en de efficiënte internalisatie van het antigeen. We verwachtten dat de PNPE een hogere affiniteit met APC's zou vertonen, wat de internalisering van antigenen beter zou kunnen stimuleren om immuunresponsen te verbeteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle methoden die in dit protocol worden beschreven, zijn goedgekeurd door het Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences. Alle dierproeven werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Voorschriften voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en de Richtlijn voor ethische beoordeling van dieren (China, GB/T35892-2018).

1. Voorbereiding en karakterisering van PLGA nanodeeltjes

  1. Bereiding van PLGA nanodeeltjes (PNP's)
    1. Voeg 0,5 g polyvinylalcohol (PVA) toe aan 120 ml gedeïoniseerd water bij 90 °C en roer tot het volledig is opgelost om de PVA-oplossing te bereiden. Bewaar de oplossing in de koelkast (4 °C) na afkoeling op kamertemperatuur.
    2. Voeg 100 mg PLGA toe aan 10 ml aceton en ethanolmengsel (verhouding van 4:1) om als oliefase te dienen.
    3. Breng 20 ml PVA waterige oplossing onder de zuurkast en roer magnetisch bij 400 tpm/min. Voeg druppel voor druppel 5 ml van de oliefase toe aan de PVA-oplossing met behulp van een spuitpomp. Roer vervolgens het mengsel in de zuurkast totdat de organische oplosmiddelen volledig verdampen.
      OPMERKING: Met de toename van de concentratie van de deeltjes in de oliefase, verandert de waterfase-oplossing geleidelijk in een helder en transparant licht blauwachtig wit of melkachtig wit.
    4. Na de vervluchtiging van organische oplosmiddelen (2-3 uur), centrifugeer het mengsel bij 15.000 x g. Was drie of meer keer totdat het uiteindelijke waswater helder en transparant is.
      OPMERKING: Het doel van deze stap is voornamelijk om de resterende PVA op het deeltjesoppervlak af te spoelen om te voorkomen dat deze het Pickering-emulsiepreparaat beïnvloedt.
    5. Suspensieer de gewassen PNP's opnieuw in 2 ml gedeïoniseerd water en vries het mengsel gedurende 24 uur in bij -80 °C. Vriesdroog de deeltjes vervolgens in een lyofilisator gedurende 48-72 uur. De voorbereide PNP's zijn wit zwermachtig.
  2. Karakterisering van PNP's
    1. Om de grootte en het zetapotentieel van PNP's te karakteriseren, voegt u 10 μL PNP's toe aan 1 ml gedeïoniseerd water om verdunningsoplossing te verkrijgen en de verdunningsoplossing over te brengen naar een DTS1070-cel. Schakel de computer en dynamic light scattering analyzer (DLS) in en plaats de DTS1070-cel in het DLS-systeem.
    2. Klik op de Zeta Size Software en maak een nieuw meetbestand om de bepalingsprocedure in te stellen. Start vervolgens de bepalingsprocedure om de deeltjesgrootte en zetapotentiaalverdeling te verkrijgen.
    3. Om de morfologie van de PNP's te observeren, verdeelt u de 0,1 ml PNP-oplossing (40 keer verdund) gelijkmatig over een tinfolieplaat van 5 cm x 5 cm en laat u het water 's nachts op natuurlijke wijze verdampen in een goed geventileerde zuurkast.
    4. Knip een klein deel van de tinfolie uit en bevestig het op de monstertafel met geleidende tape. Spuit het met goud bij een stroom van 10 mA gedurende 120 s. Observeer vervolgens de oppervlaktemorfologie van het monster met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM).

2. Voorbereiding en karakterisering van PNPE

  1. Om PNPE te bereiden, voegt u gevriesdroogde PNP's toe aan gedeïoniseerd water in een concentratie van 4 mg / ml (de waterige fase) en voegt u vervolgens squaleen toe als de oliefase. Bereid PNPE voor via ultrasoonapparaat in één stap gedurende 5 minuten bij 100 W in een waterbadsonicator. De olie-waterfaseverhouding is 1:9.
  2. Karakterisering van de bereide PNPE
    1. Open de Mastersizer 2000-software en de laser in volgorde. Klik op Meten om het vooraf ingestelde programma te openen en de voorbeeldnaam in te stellen. Klik op Start om te beginnen met het meten van de achtergrond van het monster en voeg vervolgens met behulp van een druppelaar 1 ml PNPE toe aan de monstertank van de laserdeeltjesgrootteanalysator om de deeltjesgrootte van de emulsie drie keer parallel te meten.
    2. Verdun 20 μL PNPE in 1 ml gedeïoniseerd water. Laat 20 μL van de emulsie op de dia vallen. Observeer de morfologie en homogeniteit van de emulsie met behulp van optische microscopie bij 40x vergroting en verkrijg foto's.
  3. Efficiëntie van antigeenbelasting
    1. Los 200 μg ovalbumine (OVA) op in 500 ml gedeïoniseerd water. Meng het vervolgens met 500 ml bereide PNPE en schud gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Verwijder het vloeibare antigeen door centrifugeren bij 5000 x g gedurende 20 minuten.
    2. Bepaal de fluïde antigeenconcentraties met behulp van bicinchonininezuur (BCA) assays27. De formule voor het berekenen van de efficiëntie van de antigeenbelasting is als volgt:
      Efficiëntie van antigeenbelasting = figure-protocol-1
      Gebruik dezelfde methode om de efficiëntie van de antigeenbelasting te bepalen van de SSE die als controlegroep wordt gebruikt.
  4. Stabiliteit van PNPE
    1. Verdeel 6 ml van de bereide PNPE in zes gelijke porties en bewaar drie delen elk bij respectievelijk 4 °C en 25 °C. Verdun 20 μL opgeslagen PNPE in 1 ml gedeïoniseerd water (1:50) op dag 0, 3 en 6. Meet vervolgens de grootte en het zetapotentieel van de PNPE-voorraadoplossingen die bij verschillende temperaturen worden bewaard.
      OPMERKING: De verschillende opslagtemperaturen zijn ingesteld om het effect van verschillende temperaturen op de stabiliteit van PNPE te vergelijken, wat de opslagconditie kan optimaliseren voor hoge stabiliteit en lange houdbaarheid.
  5. Bereiding van PLGA microdeeltjes (PMP's)
    1. Los 500 mg PLGA op in 5 ml dichloormethaan als oliefase en giet vervolgens in 50 ml externe waterige fase met 1,5% PVA om het olie/ watermengsel te verkrijgen. Homogeniseer het mengsel bij 3000 tpm gedurende 1 minuut met behulp van een homogenisator om grove emulsies te verkrijgen.
    2. Behoud de uniformiteit van PLGA-deeltjesgrootte van microsferen (bepaald door grove emulsies) door membraanemulgering. Installeer een membraan van 5,2 μm in de membraanbuis. Stel de druk in op 800 kPa en blijf stabiel.
    3. Open de uitlaatklep en de voedingsklep en nadat u de grove emulsies aan de monstertank hebt toegevoegd, sluit u de uitlaatklep en de voedingsklep, opent u de uitlaatklep en de inlaatklep en neemt u de postfilmemulsie in een bekerglas van 200 ml. Herhaal het proces drie keer om pre-dubbele emulsies te verkrijgen.
    4. Roer de pre-dubbele emulsies om het dichloormethaan bij kamertemperatuur te verdampen om de microsferen uit te harden. Was de microsferen met gedeïoniseerd water op 7741 x g gedurende 3 minuten vijf keer. Vries voor in een vriezer bij -80 °C en vriesdroog tot drogen om gedroogde microsferen te krijgen.
  6. Karakterisering van PMP's
    1. Open de Mastersizer 2000-software en de laser in volgorde. Klik op Meten om het vooraf ingestelde programma te openen en de voorbeeldnaam in te stellen. Klik op Start om te beginnen met het meten van de achtergrond van het monster. Voeg vervolgens 1 ml PMP's toe aan de monstertoevoegende tank van de laserdeeltjesgrootteanalysator met een druppelaar en meet de deeltjesgrootte van de microdeeltjes drie keer parallel.
  7. Zachtheidsanalyse
    OPMERKING: PNPE werd gecoat op de SiO2-sensor om de zachtheid te meten.
    1. Reinig de SiO2 kwartssensorchip door uv-ozonbehandeling gedurende 10 minuten, spoel tweemaal met 5 ml ethanol (75% v/v) en droog met N2. Installeer de lege SiO2 kwartssensorchip in de stroomcel.
    2. Schakel de computer in en activeer de temperatuurregeling rechtsonder in de software om ervoor te zorgen dat de ingestelde temperatuur ongeveer 1 °C onder kamertemperatuur ligt.
    3. Klik op de knop Acquisitie in de werkbalk en selecteer Meting instellen om te zoeken naar de 1, 3, 5, 7, 9 en 11 octaven van de chip in het gebruikte kanaal. Klik op de knop Acquisitie in de werkbalk en selecteer Meting starten.
    4. Corrigeer de basislijn met lucht en wanneer de basislijn in evenwicht is, selecteert u Stoppen en slaat u het bestand op als leeg bestand.
    5. Reinig de chip en spinlaag 10 μg/ml PNPE op de chip. Schakel in het kort de spin coater in en stel de bedrijfsparameter in. Sluit de N2-buis aan op de spincoater, stel de fractionering van de gasfles in op 0,4 kPa en plaats de schone chip op de zuignap van de spincoater. Voeg 100 μL PNPE druppelsgewijs toe aan het midden van de SiO2-sensor en sluit de bovenklep van de spincoater om de coating te voltooien.
    6. Installeer de PNPE-gecoate chip in de stroomcel. Herhaal stap 2.7.3-2.7.4 en sla het bestand op als PNPE. Open zowel de lege als de PNPE-bestanden en klik op de stitch-knop om de gerelateerde dissipatiegegevens (ΔD) te verkrijgen.

3. Isoleer en kweek BMDC's 28

OPMERKING: Zorg ervoor dat alle reagentia en monsters op ijs worden geplaatst, omdat dit een positief effect heeft op de celactiviteit. Om de steriliteit te behouden, voert u alle stappen uit op een ultraschone bank met behulp van steriel keukengerei.

  1. Euthanaseer de C57BL/6 (vrouwelijke, 6-8 weken oude) muizen via CO 2-inhalatie en week ze in ethanol 70% (v/v) voor een korte sterilisatie.
  2. Breng de muizen na 3-5 minuten weken over naar een superschone bank. Verwijder beenspieren met een roestvrijstalen schaar om het dijbeen en het scheenbeen bloot te leggen en scheid vervolgens het dijbeen en het scheenbeen.
  3. Vul een petrischaaltje met 70% (v/v) ethanol en week de schone botten erin gedurende 5-10 s om de externe sterilisatie te voltooien. Reinig alle botten en plaats ze in een steriele buis met ijs eromheen.
  4. Knip het dijbeen en het scheenbeen dicht bij het gewricht met een schaar. Steek de naald van de spuit in het bot om het beenmerg in een centrifugebuis te spoelen met behulp van voorgekoeld RPMI-medium (1640).
  5. Spoel twee of drie keer tot het bot helemaal wit is. Pipetteer het beenmerg meerdere keren om alle klonten te scheiden. Filtreer de cellen in een centrifugebuis van 15 ml met behulp van een zeef met een diameter van 40 μm.
  6. Centrifugeer bij 4 °C en 500 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg en voeg gedurende 4 minuten 2 ml erytrocytenlysaat toe aan het sediment.
  7. Na twee of drie keer wassen, suspensie de cellen opnieuw in 2 ml volledig medium (1 % penicilline-streptomycine, 10 % foetaal runderserum, 20 ng / ml IL-4 en 10 ng / ml GM-CSF). Verdun vervolgens 10 μL cellen in 1 ml PBS en plaats de chip van de handheld geautomatiseerde celteller in de celverdunning voor celtelling. Ten slotte zaadcellen met een dichtheid van 1 x 106 cellen / ml in een 10 mm kweekschaal met een compleet medium.
  8. Kweek de cellen in een celincubator met 5% CO2 bij 37 °C. Vervang het medium om de 2 dagen. Breng op dag 7 de cellen over naar een buis van 50 ml en centrifugeer op 450 x g gedurende 5 minuten om de cellen te verzamelen.

4. Bereiding van bio-mimetische extracellulaire blaasjes (bEV's)

  1. Monteer de mini-extruder in volgorde volgens de instructies van de fabrikant. Zorg ervoor dat de behuizing van de spuit niet is gebarsten voordat u deze gebruikt. Zorg ervoor dat alle O-ringen in goede staat zijn voor elk experiment en vervang versleten of beschadigde ringen onmiddellijk. Versleten of beschadigde O-ringen kunnen plotselinge drukafgifte veroorzaken bij het bedienen van de extruder.
  2. Aspirateer de BMDC's herhaaldelijk en breng ze over naar een centrifugebuis. Oogst de cellen door centrifugeren bij 450 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Druk de celsuspensies door 10 μm, 5 μm en 1 μm polycarbonaatmembranen gedurende 30 gangen met behulp van de mini-extruder29.
    OPMERKING: Om uniformiteit van de bEV-grootte mogelijk te maken, werden de BMDC-suspensies gedurende 30 gangen door 10 μm, 5 μm en 1 μm polycarbonaatmembranen geduwd. Zorg er bovendien tijdens het gebruik voor dat u gelijkmatig kracht uitoefent en de krachtrichting langs de as van de spuit handhaaft.
  3. Centrifugeer de gepoolde supernatanten gedurende 5 minuten bij 1000 x g en 4 °C om de cellen te verwijderen. Verzamel het supernatant en centrifugeer het bij 3000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de resterende cellen en celresten te verwijderen.
  4. Verzamel het supernatant en centrifugeer het bij 100.000 x g gedurende 90 minuten bij 4 °C. Gooi supernatant weg en suspenseer de bEV's opnieuw op in 2 ml HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS). Zuiver de bEV's via filtratie door een membraan van 0,45 μm en bewaar de gezuiverde bEV's bij −80 °C.

5. bEV's houden zich aan de PNPE

OPMERKING: De SiO2-sensor is aangepast via de spincoatingmethode.

  1. SiO2 sensor gemodificeerd met poly-L-lysine (PLL).
    1. Reinig de SiO2 kwartssensorchip met behulp van een UV-ozonbehandeling gedurende 10 minuten, spoel tweemaal met ethanol en droog met N2.
    2. Schakel de spin coater in door op de aan/uit-knop te drukken, druk op de Control-knop en stel de coatingtijd en -snelheid in. Het initiële toerental is 400 tpm, dat gestaag wordt verhoogd tot 5000 tpm.
    3. Sluit de N2-buis aan op de spincoater en stel de fractionering van de gasfles in op 0,4 kPa. Plaats de schone chip op de zuignap van de spin coater. Voeg 100 μL druppelsgewijs toe aan het midden van de SiO2-sensor en sluit de bovenklep van de spincoater.
    4. Druk op de startknop om het monster te coaten en stop het apparaat wanneer het klaar is. Schakel de vacuümpomp uit, schakel de aan/uit- en bedieningsknoppen uit en verwijder de pll-gemodificeerde SiO2-sensor .
      OPMERKING: Voordat u op Start drukt, moet u ervoor zorgen dat de coatingtijd en -snelheid zijn ingesteld. Zorg er bovendien voor dat de SiO2-sensor in het midden van de zuignap is geplaatst. Zorg ervoor dat het deksel gesloten is voordat het proces wordt uitgevoerd om ongelukken te voorkomen.
  2. Bepaling van de hechting van bEV's aan PNPE
    1. Schakel de computer, de elektronische eenheid, de peristaltische pomp in en activeer de temperatuurregeling rechtsonder in de software om ervoor te zorgen dat de ingestelde temperatuur ongeveer 1 °C onder kamertemperatuur ligt.
    2. Plaats de PLL-gemodificeerde SiO2-sensoren in de stroomcel volgens de gebruiksaanwijzing en sluit de meetlijn tussen de stroomcel en de stromingspomp aan. Plaats de stroomcel in het stroommodulesysteem en spoel ze af met ultrapuur water voordat u met de experimenten begint.
    3. Klik op de acquisitiewerkbalk en selecteer Setup Measurement om te zoeken naar 1, 3, 5, 7, 9 en 11 octaven van de chip in het gebruikte kanaal. Om de basislijn te corrigeren, klikt u op Meting starten om lucht in de stromingsmodule toe te laten totdat de luchtbasislijn glad is. Vervolgens debiet gedeïoniseerd water gedurende 10-15 minuten om het basislijnevenwicht van de oplossing weer mogelijk te maken.
    4. Pomp de bereide PNPE-oplossing in de stroommodule met een debiet van 50 μL/min om evenwichtsadsorptie op de SiO2-sensor te bereiken.
      OPMERKING: De ΔF verandert niet langer wanneer de PNPE opnieuw in de flowmodule wordt gepompt, wat aangeeft dat het oppervlak van de SiO2-sensoren volledig is bedekt met PNPE.
    5. Pomp de voorbereide bEV-oplossing in de stroommodule met een debiet van 50 μL/min om het proces van bEV-hechting aan het PNPE-oppervlak te volgen.

6. CLSM-analyse van de opname van antigeen

  1. Co-kweek PNPE-OVA met BMDC's
    1. Incubeer de BMDC's met 1640 complete media (1% penicilline-streptomycine, 10% foetaal runderserum, 20 ng / ml IL-4 en 10 ng / ml GM-CSF) gedurende 7 dagen en zaai ze vervolgens in kleine confocale laserschalen met 1 x 106 per put 's nachts bij 37 ° C in een 5% CO2-incubator .
    2. Meng 0,5 ml Cy5-gelabelde OVA (400 μg/ml) met 0,5 ml PNPE gedurende 1 uur en verwijder het vloeibare antigeen door centrifugatie bij 5000 x g gedurende 20 minuten om vaccinformulering te ontwikkelen. Voeg na re-suspensie met 200 μL gedeïoniseerd water 10 μL van de formulering (10 μg / ml OVA) toe aan de kleine confocale laserschalen onder een superschone bank en co-kweek met BMDC's gedurende 6 uur.
  2. Actine cytoskelet vlek
    1. Verwijder het kweekvocht uit de cellen en was ze tweemaal met voorverwarmde fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS; pH 7,4).
    2. Bevestig de cellen met 4% formaldehyde-oplossing in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Vermijd tijdens de fixatie fixatieven die methanol bevatten, die actine kunnen vernietigen.
    3. Was de cellen met PBS twee of drie keer op kamertemperatuur gedurende 10 minuten elk. Permeabiliseer de cellen met 100 μL 0,5% Triton X-100 oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen met PBS twee of drie keer op kamertemperatuur gedurende 10 minuten per stuk opnieuw.
    4. Bedek de cellen op de schaal met glazen bodem van de kleine confocale laserschalen met 200 μL fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) -geconjugeerde falloidine-werkoplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Om het achtergrondsignaal te verminderen, voegt u 1% runderserumalbumine toe aan de FITC-geconjugeerde phalloidine-werkoplossing. Bedek bovendien het deksel van de kleine confocale laserschalen tijdens de incubatie om verdamping van de oplossing te voorkomen.
    5. Was de cellen drie keer met PBS gedurende 5 minuten per stuk. Kleur de kernen opnieuw met 200 μL DAPI-oplossing (concentratie: 100 nM) gedurende ongeveer 30 s.
  3. Beeldanalyse
    1. Schakel de confocale microscoophardware in volgorde in, inclusief de laser, confocale, microscoop en computer. Klik op de NIS-Elements AR 5.20.00-software en selecteer Nikon Confocal om het testsysteem te openen.
    2. Schakel in het confocale microscoopsysteem de verschillende eenheden in de aangegeven volgorde in. Stel eerst de FITC-, DAPI- en Cy5-kanalen in en pas de bijbehorende HV en offset aan. Selecteer vervolgens de 100x olielens en plaats een druppel cederolie op de bovenkant. Plaats de kleine confocale laserschalen met gekleurde BMDC's op het microscoopstadium.
    3. Klik op de knop Scannen . Lokaliseer onder een fluorescentiemicroscoop interessante cellen door de X-as, Y-as en Z-as te bewegen. Stem de laserintensiteit, beeldgrootte en andere parameters af om het scannen van confocale beelden van hoge kwaliteit mogelijk te maken. Klik ten slotte op de knop Vastleggen en sla de afbeeldingen op.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een eenvoudige sonificatie in één stap werd gebruikt om PNPE te verkrijgen. Eerst hebben we uniforme PNP's voorbereid voor gebruik als de vaste stabilisator (figuur 1A). De morfologie van PNP's werd waargenomen via SEM, waaruit blijkt dat ze meestal uniform en bolvormig zijn (figuur 1B). De hydrodynamische grootte en het zetapotentiaal van de formuleringen werden gedetecteerd via DLS. De diameter van de PNP's was 187,7 ± 3,5 nm en de zetapotentiaal was ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We ontwikkelden PLGA nanodeeltjes-gestabiliseerde olie/water emulsie als een afgiftesysteem voor verbeterde antigeen internalisatie. De voorbereide PNPE bezat een dicht opeengepakt oppervlak om de landingsplaats te ondersteunen en unieke zachtheid en vloeibaarheid voor krachtig cellulair contact met het immuuncelmembraan. Bovendien bood de olie/water-interface een hoge gehalte aan antigeenbelasting en amfifiele PLGA verleende PNPE een hoge stabiliteit voor het transport van antigenen naar immuuncellen. De PNPE zou zich s...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het project dat wordt ondersteund door het National Key Research and Development Program of China (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), From 0 to 1 Original Innovation Project of Basic Frontier Scientific Research Program of Chinese Academy of Sciences (ZDBS-LY-SLH040), de Foundation for Innovative Research Groups van de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21821005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AddVaxInvivoGenVac-adx-10
Cell StrainerBiosharpBS-70-CS70 μm
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)NikonA1
Cy3 NHS EsterYEASEN40777ES03
DAPI Staining SolutionBeyotimeC1005
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco16000-044
FITC PhalloidinSolarbioCA1620
Mastersizer 2000 Particle Size AnalyzerMalvern
Micro BCA protein Assay KitThermo Science23235
Membrane emulsification equipmentZhongke Senhui Microsphere TechnologyFM0201/500M
Mini-ExtruderAvanti Polar Lipids, Inc
NANO ZSMalvernJSM-6700F
Polycarbonate membranesAvanti Polar Lipids, Inc
Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA)Sigma-Aldrich26780-50-7Mw 7,000-17,000
Poly-L-lysine SolutionSolarbioP2100
Poly (vinyl alcohol) (PVA)Sigma-Aldrich9002-89-5
QSense Silicon dioxide sensorBiolin ScientificQSX 303Surface roughness < 1 nm RMS
Quartz Crystal MicrobalanceBiosharpQ-SENSE E4
RPMI Medium 1640 basicGibcoC22400500BTL-Glutamine, 25 mM HEPES
Scanning Electron Microscopy (SEM)JEOLJSM-6700F
SqualeneSigma-Aldrich111-02-4

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ma, G., Gu, Z., Wei, W. Advanced vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 183, 114170(2022).
  2. Sharma, J., Carson, C. S., Douglas, T., Wilson, J. T., Joyce, S. Nano-particulate platforms for vaccine delivery to enhance antigen-specific cd8(+) t-cell response. Methods in Molecular Biology. 2412, 367-398 (2022).
  3. Nguyen, T. P., et al. Safety and immunogenicity of nanocovax, a sars-cov-2 recombinant spike protein vaccine: interim results of a double-blind, randomised controlled phase 1 and 2 trial. The Lancet Regional Health. Western Pacific. 24, 100474(2022).
  4. Coates, E. E., et al. Safety and immunogenicity of a trivalent virus-like particle vaccine against western, eastern, and venezuelan equine encephalitis viruses: a phase 1, open-label, dose-escalation, randomised clinical trial. The Lancet Infectious Diseases. 22 (8), 1210-1220 (2022).
  5. Wei, L., et al. Efficacy and safety of a nanoparticle therapeutic vaccine in patients with chronic hepatitis b: a randomized clinical trial. Hepatology. 75 (1), 182-195 (2022).
  6. Krishnan, R., Kim, J. O., Qadiri, S. S. N., Kim, J. O., Oh, M. J. Early viral uptake and host-associated immune response in the tissues of seven-band grouper following a bath challenge with nervous necrosis virus. Fish & Shellfish Immunology. 103, 454-463 (2020).
  7. Mishra, D., Mishra, P. K., Dubey, V., Dabadghao, S., Jain, N. K. Evaluation of uptake and generation of immune response by murine dendritic cells pulsed with hepatitis b surface antigen-loaded elastic liposomes. Vaccine. 25 (39-40), 6939-6944 (2007).
  8. Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., Mccullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
  9. Jing, H., et al. Fluorescent artificial antigens revealed extended membrane networks utilized by live dendritic cells for antigen uptake. Nano Letters. 22 (10), 4020-4027 (2022).
  10. Meena, J., Goswami, D. G., Anish, C., Panda, A. K. Cellular uptake of polylactide particles induces size dependent cytoskeletal remodeling in antigen presenting cells. Biomaterials Science. 9 (23), 7962-7976 (2021).
  11. Yang, J., et al. Drug delivery via cell membrane fusion using lipopeptide modified liposomes. ACS Central Science. 2 (9), 621-630 (2016).
  12. Rawle, R., Kasson, P., Boxer, S. Disentangling viral membrane fusion from receptor binding by using synthetic dna-lipid conjugates totether influenza virus to model lipid membranes. Biophysical Journal. 111 (1), 123-131 (2016).
  13. Ha, H. K., Kim, J. W., Lee, M. R., Jun, W., Lee, W. J. Cellular uptake and cytotoxicity of β-lactoglobulin nanoparticles: the effects of particle size and surface charge. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 28 (3), 420-427 (2015).
  14. Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
  15. Dankovich, T. M., et al. Extracellular matrix remodeling through endocytosis and resurfacing of tenascin-r. Nature Communications. 12 (1), 7129(2021).
  16. Evans, E., Buxbaum, K. Affinity of red-blood-cell membrane for particle surfaces measured by the extent of particle encapsulation. Biophysical Journal. 34 (1), 1-12 (1981).
  17. Rohner, N. A., Purdue, L. N., Von Recum, H. A. Affinity-based polymers provide long-term immunotherapeutic drug delivery across particle size ranges optimal for macrophage targeting. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (4), 1693-1700 (2021).
  18. Zhou, X., Liu, Y., Wang, X. F., Li, X. M., Xiao, B. Effect of particle size on the cellular uptake and anti-inflammatory activity of oral nanotherapeutics. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 187, 110880(2020).
  19. Zhang, D., et al. The morphology and surface charge-dependent cellular uptake efficiency of upconversion nanostructures revealed by single-particle optical microscopy. Chemical Science. 13 (12), 3610(2022).
  20. Xi, Y. K., et al. Co2-responsive pickering emulsions stabilized by soft protein particles for interfacial biocatalysis. Chemical Science. 13 (10), 2884-2890 (2022).
  21. Trivedi, R. P., Klevets, I. I., Senyuk, B., Lee, T., Smalyukh, I. I. Reconfigurable interactions and three-dimensional patterning of colloidal particles and defects in lamellar soft media. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 109 (13), 4744-4749 (2012).
  22. De Araujo, A. D., Hoang, H. N., Lim, J., Mak, J. Y. W., Fairlie, D. P. Tuning electrostatic and hydrophobic surfaces of aromatic rings to enhance membrane association and cell uptake of peptides. Angewandte Chemie. 61 (29), 03995(2022).
  23. Waku, T., et al. Effect of the hydrophilic-hydrophobic balance of antigen-loaded peptide nanofibers on their cellular uptake, cellular toxicity, and immune stimulatory properties. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3781(2019).
  24. Meng, X., et al. A soft pickering emulsifier made from chitosan and peptides endows stimuli-responsiveness, bioactivity and biocompatibility to emulsion. Carbohydrate Polymers. 277, 118768(2022).
  25. Wang, Z., et al. Fabrication and in vitro/vivo evaluation of drug nanocrystals self-stabilized pickering emulsion for oral delivery of quercetin. Pharmaceutics. 14 (5), 897(2022).
  26. Ji, J., et al. Core-shell-structured silica/polyacrylate particles prepared by pickering emulsion: influence of the nucleation model on particle interfacial organization and emulsion stability. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 534(2014).
  27. Chen, l, et al. Quantitative evaluation of proteins with bicinchoninic acid (bca): resonance raman and surface-enhanced resonance raman scattering-based methods. Analyst. 137 (24), 5834-5838 (2012).
  28. Colino, J., Shen, Y., Snapper, C. M. Dendritic cells pulsed with intact streptococcus pneumoniae elicit both protein- and polysaccharide-specific immunoglobulin isotype responses in vivo through distinct mechanisms. The Journal of Experimental Medicine. 195 (1), 1-13 (2002).
  29. Zhang, Y., Wu, J., Zhang, H., Wei, J., Wu, J. Extracellular vesicles-mimetic encapsulation improves oncolytic viro-immunotherapy in tumors with low coxsackie and adenovirus receptor. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 574007(2020).
  30. Cappellano, G., Abreu, H., Casale, C., Dianzani, U., Chiocchetti, A. Nano-microparticle platforms in developing next-generation vaccines. Vaccines. 9 (6), 606(2021).
  31. McClelland, R. D., Culp, T. N., Marchant, D. J. Imaging flow cytometry and confocal immunofluorescence microscopy of virus-host cell interactions. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 11, 749039(2021).
  32. Konry, T., Sarkar, S., Sabhachandani, P., Cohen, N. Innovative tools and technology for analysis of single cells and cell-cell interaction. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 18 (1), 259-284 (2016).
  33. D'Aurelio, R., et al. A comparison of EIS and QCM nanoMIP-based sensors for morphine. Nanomaterials. 11 (12), 3360(2021).
  34. Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 242(2021).
  35. Rydell, G. E., Dahlin, A. B., Hook, F., Larson, G. QCM-D studies of human norovirus VLPs binding to glycosphingolipids in supported lipid bilayers reveal strain-specific characteristics. Glycobiology. 19 (11), 1176-1184 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Pickering emulsiePLGA nanodeeltjesdendritische cellen uit het beenmergconfocale microscopiekwartskristalmicrobalansantigeenopnamevaccinformulering

Gerelateerde artikelen