Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het vaststellen van 3D-endometriumorganoïden uit de baarmoeder van de muis

8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64448

⸱

6 januari 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology & Immunology, Baylor College of Medicine, 2Center for Drug Discovery, Baylor College of Medicine, 3Departments of Molecular Virology and Microbiology and Medicine, Baylor College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft methodologieën om endometriumepitheelorganoïden van muizen vast te stellen voor genexpressie en histologische analyses.

Samenvatting

Endometriumweefsel bekleedt de binnenholte van de baarmoeder en staat onder de cyclische controle van oestrogeen en progesteron. Het is een weefsel dat is samengesteld uit luminaal en klierepitheel, een stromaal compartiment, een vasculair netwerk en een complexe immuuncelpopulatie. Muismodellen zijn een krachtig hulpmiddel geweest om het baarmoederslijmvlies te bestuderen en onthullen kritieke mechanismen die implantatie, placentatie en kanker beheersen. De recente ontwikkeling van 3D-endometriumorganoïde culturen presenteert een state-of-the-art model om de signaalroutes te ontleden die ten grondslag liggen aan endometriumbiologie. Het vaststellen van endometriumorganoïden uit genetisch gemanipuleerde muismodellen, het analyseren van hun transcriptomen en het visualiseren van hun morfologie met een resolutie van één cel zijn cruciale hulpmiddelen voor de studie van endometriumziekten. Dit artikel schetst methoden om 3D-culturen van endometriumepitheel van muizen vast te stellen en beschrijft technieken om genexpressie te kwantificeren en de histologie van de organoïden te analyseren. Het doel is om een bron te bieden die kan worden gebruikt om de genexpressie en morfologische kenmerken van endometriumepitheelorganoïden vast te stellen, te kweken en te bestuderen.

Inleiding

Het endometrium - het binnenste bekledingsslijmvliesweefsel van de baarmoederholte - is een uniek en zeer dynamisch weefsel dat een cruciale rol speelt in de reproductieve gezondheid van een vrouw. Tijdens de reproductieve levensduur heeft het endometrium het potentieel om honderden cycli van proliferatie, differentiatie en afbraak te ondergaan, gecoördineerd door de gecoördineerde werking van de eierstokhormonen - oestrogeen en progesteron. Studies van genetisch gemanipuleerde muizen hebben fundamentele biologische mechanismen blootgelegd die de endometriumrespons op hormonen en de controle van embryo-implantatie, stromale celdecidualisatie en zwangerschap ondersteunen1. In vitro studies zijn echter beperkt geweest vanwege problemen bij het handhaven van niet-getransformeerde primaire endometriumweefsels van muizen in traditionele 2D-celculturen 2,3. Recente ontwikkelingen in de cultuur van endometriumweefsels als 3D-orgaansystemen, of organoïden, bieden een nieuwe kans om biologische routes te onderzoeken die de regeneratie en differentiatie van endometriumcellen regelen. Muis- en humaan endometriumorganoïde systemen zijn ontwikkeld uit zuiver endometriumepitheel ingekapseld in verschillende matrices 4,5, terwijl menselijk endometrium is gekweekt als steigervrije epitheliale / stromale co-culturen 6,7, en meer recent als collageen-ingekapselde epitheliale / stromale assembloïden8 . De groei en het regeneratieve potentieel van epitheliale organoïde culturen wordt ondersteund door een gedefinieerde cocktail van groeifactoren en kleine molecuulremmers die empirisch zijn vastgesteld om de groei en regeneratie van de organoïden te maximaliseren 4,5,9. Bovendien maakt het vermogen om endometriumorganoïden te bevriezen en te ontdooien het langdurig bankieren van endometriumorganoïden van muizen en mensen mogelijk voor toekomstige studies.

Genetisch gemanipuleerde muizen hebben de complexe signaalroutes onthuld die de vroege zwangerschap en decidualisatie regelen, en zijn gebruikt als modellen van zwangerschapsverlies, endometriumkanker en endometriose. Deze genetische studies zijn grotendeels bereikt met celspecifieke deletie van loxP geflankeerde allelen ("floxed") met behulp van cre-recombinasen die specifiek actief zijn in vrouwelijke voortplantingsweefsels. Deze muismodellen omvatten de veelgebruikte progesteronreceptor-cre10, die een sterke recombinase-activiteit heeft in de endometriumepitheel- en stromale weefsels, lactoferrine i-cre, dat endometriumepitheelrecombinatie induceert bij volwassen muizen11, of Wnt7a-cre, dat epitheliale-specifieke deletie veroorzaakt in van Müller afgeleide weefsels12 . Het kweken van endometriumweefsels uit genetisch gemanipuleerde muismodellen als 3D-organoïden heeft een uitstekende gelegenheid geboden om endometriumbiologie te onderzoeken en de identificatie van groeifactoren en signaalroutes te vergemakkelijken die de vernieuwing en differentiatie van endometriumcellen regelen13,14. Methoden voor de isolatie en kweek van muizenslijmbeenweefsel worden beschreven in de literatuur en rapporteren het gebruik van verschillende enzymatische strategieën voor de isolatie van baarmoederepitheel voor het daaropvolgende kweken van endometriumepitheelorganoïden4. Terwijl eerdere literatuur een kritisch kader biedt voor endometriumepitheel organoïde cultuurprotocollen 4,5,6, biedt dit artikel een duidelijke, uitgebreide methode voor het genereren, onderhouden, verwerken en analyseren van deze organoïden. Standaardisatie van deze technieken is belangrijk voor het versnellen van de vooruitgang op het gebied van reproductieve biologie van vrouwen. Hier rapporteren we een gedetailleerde methodologie voor de enzymatische en mechanische zuivering van endometriumepitheelweefsel van muizen voor de daaropvolgende kweek van endometriumorganoïden in een gelmatrixsteiger. We beschrijven ook de methodologieën voor downstream histologische en moleculaire analyses van de gelmatrix-ingekapselde muis endometriumepitheel organoïden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Muisbehandeling en experimentele studies werden uitgevoerd onder protocollen die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Baylor College of Medicine en richtlijnen die zijn vastgesteld door de NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Isolatie van baarmoederepitheel van muizen met behulp van enzymatische en mechanische methoden

OPMERKING: In dit gedeelte worden de stappen beschreven die nodig zijn om epitheliale endometriumorganoïden van muizen vast te stellen, door te laten, te bevriezen en te ontdooien met behulp van een gelmatrixsteiger. Eerdere studies hebben vastgesteld dat optimale culturen van muizenendometriumorganoïden worden vastgesteld uit muizen tijdens de oestrusfase4, die kan worden bepaald door cytologisch onderzoek van een vaginaal uitstrijkje15. Volwassen vrouwelijke WT-muizen (6-8 weken oud, hybride C57BL/6J en 129S5/SvEvBrd) werden gebruikt voor alle experimenten. De muizen werden humaan geëuthanaseerd volgens door de IACUC goedgekeurde richtlijnen met behulp van isofluraan sedatie gevolgd door cervicale disarticulatie. Zodra de muizen zijn geëuthanaseerd, moeten de volgende stappen worden gevolgd. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over materialen en oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.

  1. Laat de gelmatrix voor gebruik ongeveer 1-2 uur op ijs ontdooien.
  2. Om de muis te ontleden, gebruikt u een schaar om een middenlijnincisie op de buik te maken en de huid voorzichtig af te pellen om de onderliggende peritoneale laag bloot te leggen. Gebruik een tang om de peritoneale laag omhoog te houden en laterale incisies te maken met de schaar om de buikinhoud bloot te leggen.
    1. Lokaliseer de baarmoederhoorns door de buikvetkussens voorzichtig opzij te bewegen. Ontleed ze door ze eerst op de cervicale kruising te houden en een schaar te gebruiken om langs het mesenteriale vet te snijden. Verwijder na de dissectie van de baarmoeder van de muis grondig vetweefsel uit de baarmoederhoorn met een kleine schaar.
      OPMERKING: Handhaaf de steriliteit tijdens de celisolatie door alle chirurgische hulpmiddelen voor gebruik te steriliseren, de buik van de muis te besproeien met 70% ethanol en alle stappen na dissectie uit te voeren onder een steriele weefselkweekkap.
  3. Snijd elke baarmoederhoorn in kleine fragmenten van ongeveer 4-5 mm.
  4. Plaats alle baarmoederfragmenten van één baarmoeder in één putje van een 24-wellsplaat met 0,5 ml 1% Trypsine. Laat de enzymatische oplossing het baarmoederlumen binnendringen, waardoor enzymatische scheiding van het endometriumepitheel van het onderliggende stroma ontstaat.
  5. Incubeer de 24-wells plaat in een 37 °C bevochtigde weefselkweek incubator gedurende ongeveer 1 uur.
  6. Breng na de incubatie van 1 uur de baarmoederfragmenten over naar een weefselkweekplaat van 35 mm met 1 ml Dulbecco's fosfaatbufferoplossing (DPBS).
  7. Gebruik onder een dissectiemicroscoop een fijne tang en een pipet van 1 ml om het baarmoederepitheel mechanisch van de baarmoederbuis te scheiden. Terwijl u het ene uiteinde van een baarmoederfragment met de tang vasthoudt, laat u de pipetpunt voorzichtig in de lengterichting over het fragment lopen en knijpt u het epitheel uit het andere uiteinde van de baarmoederbuis. Observeer de gescheiden epitheliale vellen van het baarmoederfragment onder de dissectiemicroscoop.
  8. Gebruik de pipet van 1 ml om de epitheliale vellen te verzamelen en voorzichtig over te brengen in een buis van 1,5 ml.
  9. Herhaal het proces voor de resterende baarmoederfragmenten en breng alle epitheliale vellen over naar dezelfde verzamelbuis.
  10. Pelleteer de gedissocieerde epitheelplaten door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 375 × g.
  11. Verwijder het supernatant voorzichtig om te voorkomen dat de celpellet wordt verstoord.
  12. Resuspendeer de celpellet in 0,5 ml collageenase van 2,5 mg/ml collagenase + 2 mg/ml DNase-oplossing. Pipetteer ongeveer 10x op en neer, of totdat een eencellige suspensie is bereikt.
  13. Voeg 0,5 ml DMEM/F12 + 10% foetaal runderserum (FBS) + antibiotica toe en centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 375 × g.
    OPMERKING: Voor meer informatie over het breedspectrumantibioticum dat wordt gebruikt voor celkweek, raadpleegt u de tabel met materialen.
  14. Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml DMEM / F12 + 10% FBS + antibiotica. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 375 × g.

2. Verwerking van het stromale compartiment

OPMERKING: In dit gedeelte worden de protocollen beschreven die nodig zijn voor het isoleren van het stromale compartiment van het muizenslijmvlies. Gezien de toenemende belangstelling voor epitheliale/stromale co-kweekexperimenten is het belangrijk om naast de epitheelcellen die organoïden genereren ook de stromale celpopulaties te kunnen verwerken.

  1. Zodra al het epitheel enzymatisch en mechanisch is gescheiden van de baarmoederfragmenten, zijn de resterende buisachtige structuren de "stromale / myometriale" compartimenten. Verzamel dit weefsel in een collageenase van 2,5 mg/ml + 2 mg/ml DNase in HBSS-oplossing.
  2. Incubeer het stromale/myometriale monster gedurende 15 minuten op een schudder van 37 °C.
  3. Voeg na incubatie 500 μL DMEM/F12 + 10% FBS + antibiotica per muis toe en filter de niet-gedissocieerde fragmenten door een celfilter van 40 μm.
  4. Pelleteer de cellen door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 375 × g.
  5. Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer de celpellet in 1 ml DMEM / F12 + 10% FBS + antibiotica. Voeg het mengsel druppelsgewijs toe aan 10 ml DMEM/F12 + 10% FBS + antibiotica in een celkweekplaat van 10 cm. Incubeer de plaat bij 37 °C in een bevochtigde celkweekincubator.
  6. Om coculturen van endometriumepitheel- en stromale cellen van muizen te genereren, volgt u de methoden die zijn beschreven voor menselijke endometriumorganoïden met behulp van steigervrije of collageenmatrixsystemen 6,8.
    OPMERKING: Hoewel deze technieken nog niet zijn gepubliceerd voor muizen, kunnen ze worden aangepast op basis van de gepubliceerde protocollen met humaan endometrium.

3. Inkapseling van baarmoederepitheel in gelmatrix om organoïden vast te stellen

OPMERKING: Bewaar de gelmatrix op ijs totdat deze klaar is voor gebruik.

  1. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in een volume gelmatrix dat 20x dat is van dat van de celpellet (d.w.z. als de celpellet 20 μL is, resuspendeer de cellen met 400 μL gelmatrix). Resuspendeer de pellet zorgvuldig om te voorkomen dat er bubbels ontstaan.
  2. Laat de gelmatrix/celsuspensie gedurende ~10 min bij kamertemperatuur bezinken.
  3. Zodra de gelmatrix/celsuspensie een halfvaste gel wordt, gebruikt u een P200-micropipette met een brede boring van 200 μL om voorzichtig 25 μL van de gelmatrix/celsuspensie op te zuigen. Doseer drie afzonderlijke 25 μL domes per put van een 12-well plaat en laat de gelmatrix gedurende 15 minuten uitharden in een 37 °C bevochtigde weefselkweekincubator.
  4. Nadat de gelmatrix is uitgehard, voegt u 750 μL organoïde medium toe aan elke put met gelmatrixkoepels. Incubeer bij 37 °C in een bevochtigde weefselkweekincubator.
    OPMERKING: Organoïde mediaformulering wordt vermeld in de tabel met materialen. Organoïden vormen zich meestal binnen 4 dagen na de eerste kweek.

4. Genexpressieanalyse van endometriumorganoïden na behandeling met oestradiol

OPMERKING: In dit gedeelte worden de methoden beschreven die worden gebruikt om de genexpressie van endometriumepitheelorganoïden te profileren met behulp van real-time qPCR na behandeling met oestradiol (E2; zie tabel 1). Omdat het endometrium onder de cyclische controle van het eierstokhormoon E2 staat, is het testen van de responsiviteit van de organoïden op E2 een belangrijke maat voor fysiologische functie. We hebben hoogwaardig RNA verkregen en voldoende mRNA gegenereerd om genexpressie te profileren met behulp van qPCR en/of RNA-sequencing van onze endometriumepitheelorganoïden. In deze sectie wordt beschreven hoe organoïden kunnen worden verzameld en verwerkt voor downstream-analyse van genexpressie. Het geselecteerde behandelingsmedium weerspiegelt het medium dat wordt gebruikt om gekweekte endometriumcellen te behandelen. Er moet echter worden opgemerkt dat dit behandelingsmedium dienovereenkomstig kan worden geoptimaliseerd, zoals gedaan voor de behandeling van menselijke endometrium 3D-culturen met hormonen 8,16,17.

  1. Kweek de endometriumorganoïden zoals hierboven beschreven.
  2. Verwijder het organoïde medium en vervang het vier dagen na het zaaien door 750 μL uithongeringsmedium. 's Nachts incuberen.
  3. Verwijder de volgende ochtend het uithongeringsmedium. Voeg 750 μL behandelingsmedium toe dat een medium of 10 nM E2 bevat. Incubeer gedurende 48 uur.
  4. Ga verder met RNA-isolatie volgens het protocol van de fabrikant van de kit.

5. Histologische analyse van endometriumorganoïden

OPMERKING: Het in beeld brengen van de morfologische kenmerken van endometriumorganoïden is van cruciaal belang voor het evalueren van het cellulaire effect van groeifactoren, genetische manipulaties of kleine molecuulremmers. Deze sectie beschrijft de technieken die worden gebruikt om endometriumepitheelorganoïden te fixeren, te verwerken en in beeld te brengen met behulp van histologische vlekken en antilichaamimmunofluorescente kleuring.

  1. Bereid 1,5 ml microcentrifugebuizen met 1 ml 4% paraformaldehyde in 1x PBS. Leg ze op ijs.
  2. Aspirateer het medium uit de putten van de 12-well plaat die de organoïden bevat.
  3. Breng met behulp van een pipetpunt van 1 ml met een gesneden punt 500 μL 4% paraformaldehyde over naar elke put en maak de gelmatrixkoepels voorzichtig los van de onderkant van de plaat.
  4. Zuig de volledige gelmatrixkoepels voorzichtig in de pipetpunt en breng over naar de microcentrifugebuis van 1,5 ml.
  5. Bevestig de organoïden door ze 's nachts op een rotator bij 4 °C te plaatsen.
  6. De volgende ochtend centrifugeer je de buis op 600 × g gedurende 5 minuten om de organoïden te pelleteren. Verwijder de 4% paraformaldehyde-oplossing voorzichtig met een pipet en gooi deze weg. Was de organoïden 2x met 70% ethanol.
  7. Verwijder na de laatste wasbeurt alle behalve 50-100 μL ethanol uit de buis. Zet de buis opzij.
  8. Plaats een tube monsterverwerkingsgel in een waterbad en magnetron gedurende ~ 30 s om de gel te smelten. Zorg ervoor dat de monsterverwerkingsgel niet overkookt door de consistentie van de gel te controleren.
    OPMERKING: Zodra de monsterverwerkingsgel is gesmolten, maar niet kokend heet, werkt u snel om de organoïden in te kapselen.
  9. Breng voldoende monsterverwerkingsgel over om het hele oppervlak van de mal (ongeveer 250 μL) te bedekken.
  10. Terwijl de monsterverwerkingsgel nog steeds gesmolten is, brengt u snel de 50 μL 70% ethanoloplossing over die de organoïden bevat. Zorg ervoor dat de organoïden zijn verzonken of naar het onderste gedeelte van de mal zijn geduwd.
  11. Plaats de histologievorm op een emmer ijs en laat de monsterverwerkingsgel afkoelen en stollen.
  12. Zodra de monsterverwerkingsgel volledig droog is, brengt u het monsterverwerkingsgel vierkant zorgvuldig over naar een monsterzak en houdt u het vlak bij waar de organoïden zich bevinden.
  13. Plaats de zak in een histologiecassette en verwerk met behulp van standaardmethoden die worden gebruikt voor formalinefixatie en paraffine-inbedding van weefsels18.
  14. Na fixatie en inbedding in paraffine, sectie in secties van 5 μm met behulp van een microtoom19. Ga verder met standaard hematoxyline en eosine (H &E) kleuring of immunostaining procedures, zoals hieronder beschreven.

6. Hematoxyline &eosine kleuring

  1. Deparaffiniseer de secties als volgt: xyleen, 2 x 10 min; 100% ethanol, 2 x 3 min; 80% ethanol, 3 min; 60% ethanol, 3 min; dH2O, 2 x 3 min; 1 min in hematoxyline; kraanwater (3 x 5 s); 1 min in eosine.
  2. Droog de secties als volgt uit: 60% ethanol, 3 min; 80% ethanol, 3 min; 95% ethanol, 3 min; 100% ethanol, 2 x 3 min; xyleen, 2 x 15 min.
  3. Monteer met behulp van montagemedium.

7. Immunofluorescentiekleuring

  1. Deparaffiniseer de secties zoals beschreven in stap 6.1.
  2. Voer het ophalen van antigeen uit
    1. Dompel de dia's onder in een antigeen ophaaloplossing in een magnetronveilige container.
    2. Magnetron op hoog vuur gedurende 20 minuten, met intervallen van 5 minuten om ervoor te zorgen dat de oplossing niet overkookt.
  3. Nadat de antigeen ophaalstap van 20 minuten is voltooid, laat u de dia's gedurende 40 minuten op ijs afkoelen terwijl u nog steeds ondergedompeld bent in de buffer voor het ophalen van antigeen.
  4. Was de dia's met 1x TBST gedurende 3 min
  5. Blokkeer de dia's door 3% BSA in TBST gedurende 1 uur bij kamertemperatuur te incuberen.
  6. Primaire antilichaam incubatie
    1. Verdun het antilichaam in 3% BSA in TBST (1:50-1:1.000, afhankelijk van Ab).
    2. Incubeer een nacht bij 4 °C in een bevochtigde kamer.
    3. Wassen 3 x 5 min met TBST.
  7. Secundaire antilichaam incubatie
    1. Verdun het antilichaam in 3% BSA (in TBST) (1:250), of in 5% normaal ezelserum.
    2. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT) in het donker, omdat het antilichaam is geconjugeerd aan een fluorofoor.
  8. Nucleaire kleuring
    1. Verdun 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) 1:1.000 in TBST.
    2. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT.
    3. Was 2 x 5 min met TBST.
  9. Montage
    1. Gebruik één druppel montagemedium om de coverslip te monteren.
    2. Sluit de coverslip de volgende dag af met nagellak.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Fasecontrastbeelden van endometriumorganoïden van muizen
We hebben organoïden vastgesteld uit WT-muizenendometriumepitheel, zoals beschreven in het bijgevoegde protocol (zie diagram in figuur 1). Na enzymatische dissociatie van het endometriumepitheel van de muis werden epitheliale vellen mechanisch gescheiden van de stromale cellen van de baarmoeder en verder gedissocieerd met collagenase om een eencellige suspensie te genereren. Indien correct uitgevoerd, zou deze metho...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we methoden om endometriumepitheelorganoïden te genereren uit muizenslijmvlies en de protocollen die routinematig worden gebruikt voor hun downstream-analyse. Endometriumorganoïden zijn een krachtig hulpmiddel om de mechanismen te bestuderen die endometriumgerelateerde ziekten beheersen, zoals endometriose, endometriumkanker en implantatiefalen. Baanbrekende studies gepubliceerd in 2017 rapporteerden de omstandigheden om langdurige en hernieuwbare culturen van endometriumorganoïden uit muis en humaan epi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

We bedanken Dr. Stephanie Pangas en Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) voor het kritisch lezen en redigeren van ons manuscript. Studies werden ondersteund door Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development subsidies R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) en R01-HD110038 (M.M.), en door NCI- P30 Cancer Center Support Grant (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. heeft een Next Gen Pregnancy Award van het Burroughs Wellcome Fund.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Organoid Media Formulation
NaamBedrijfCatalogusnummerEindconcentratie
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-freeCorning354230100%
Trypsine uit runderpancreasSigma AldrichT1426-1G1%
Advanced DMEM/F12Life Technologies126340101X
N2 supplementLife Technologies175020481X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin ALife Technologies125870101X
PrimocinInvivogenant-pm-1100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteïneSigma AldrichA9165-5G1.25 mM
L-glutamineLife Technologies250300242 mM
NicotinamideSigma AldrichN0636-100G10 nM
ALK-4, -5, -7-remmer, A83-01Tocris2939500 nM
Recombinant menselijk EGFPeprotechAF-100-1550 ng/mL
Recombinant menselijk NogginPeprotech120-10C100 ng/mL
Recombinant menselijk Rspondin-1Peprotech120-38500 ng/mL
Recombinant menselijk FGF-10Peprotech100-26100 ng/mL
Recombinant menselijk HGFPeprotech100-3950 ng/mL
WNT3aR&D systems5036-WN200 ng/mL
Overige benodigdheden en reagentia
NaamBedrijfCatalogusnummerEindconcentratie
Collagenase uit Clostridium histolyticumSigma AldrichC0130-1G5 mg/mL
Deoxyribonuclease I uit runderpancreasSigma AldrichDN25-100MG2 mg/mL
DPBS, zonder calcium, zonder magnesiumThermoFisher14190-2501X
HBSS, zonder calcium, zonder magnesiumThermoFisher141701121X
Falcon Polystyreen Microplates (24-Well)Fisher Scientific#08-772-51
Falcon Polystyreen Microplates (12-Well)Fisher Scientific#0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µmFisher Scientific#08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg)Genesee Scientific11-331
Trizol reagentInvitrogen15596026
DMEM/F-12, HEPES, geen fenolroodThermoFisher11039021
Fetal bovien serum, met houtskool gestriptSigma AldrichF6765-500ML2%
Estratiol (E2)Sigma AldrichE1024-1G10 nM
Formaldehyde 16% in waterige oplossing, EM GradeVWR157104%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue CassettesFisher Scientific1000961
Epredia Roestvrijstalen Inbeddingsbasis MallenFisher Scientific64-010-15 
Ethanol, 200 proof (100%)Fisher Scientific22-032-601 
HistoclearFisher Scientific50-899-90147
Permount Montage MediumFisher Scientific50-277-97
Epredia Nylon Biopsie ZakkenFisher Scientific6774010
HistoGel Monster VerwerkingsgelVWR83009-992
Hematoxylinen oplossing PremiumVWR95057-844
Eosine Y (geelachtig) oplossing PremiumVWR95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4GenDEPORTT80541X
TBST (10X), pH 7.4GenDEPORTT80561X
Citroenzuur Sigma AldrichC0759-1KG
Natriumcitraat tribasisch dihydraatSigma AldrichS4641-500G
Tween20Fisher ScientificBP337-500 
Runder Serum Albumine (BSA)Sigma AldrichA2153-100G3%
DAPI Oplossing (1 mg/mL)ThermoFisher622481:1000 verdunning
VECTASHIELD Antifade Montage MediumVector LabsH-1000-10
Klaar nagellakFisher ScientificNC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus MicroscoopglaasjesFisher Scientific22037246
VWR Micro DekglasjesVWR48393-106
SuperScript VILO Master MixThermoFisher11755050
SYBR Green PCR Master MixThermoFisher4364346
Krt8 Antilichaam (TROMA-I) DSHBTROMA-I 1:50 verdunning
Vimentin AntilichaamCell Signaling5741S1:200 verdunning
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antilichaam, Alexa Fluor 594		ThermoFisherA-212091:250 verdunning
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antilichaam, Alexa Fluor 488		ThermoFisherA-212061:2

Referenties

  1. Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
  2. Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 84(2020).
  3. Rawlings, T. M., Makwana, K., Tryfonos, M., Lucas, E. S. Organoids to model the endometrium: implantation and beyond. Reproduction & Fertility. 2 (3), 85-101 (2021).
  4. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  5. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  6. Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of multicellular human primary endometrial organoids. Journal of Visualized Experiments. (152), e60384(2019).
  7. Wiwatpanit, T., et al. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 105 (3), 769-780 (2020).
  8. Rawlings, T. M., et al. Modelling the impact of decidual senescence on embryo implantation in human endometrial assembloids. Elife. 10, 69603(2021).
  9. Lou, L., Kong, S., Sun, Y., Zhang, Z., Wang, H. Human endometrial organoids: recent research progress and potential applications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844623(2022).
  10. Soyal, S. M., et al. Cre-mediated recombination in cell lineages that express the progesterone receptor. Genesis. 41 (2), 58-66 (2005).
  11. Daikoku, T., et al. Lactoferrin-iCre: a new mouse line to study uterine epithelial gene function. Endocrinology. 155 (7), 2718-2724 (2014).
  12. Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19272-19277 (2010).
  13. Seishima, R., et al. Neonatal Wnt-dependent Lgr5 positive stem cells are essential for uterine gland development. Nature Communications. 10 (1), 5378(2019).
  14. Syed, S. M., et al. Endometrial Axin2(+) cells drive epithelial homeostasis, regeneration, and cancer following oncogenic transformation. Cell Stem Cell. 26 (1), 64-80 (2020).
  15. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).
  16. Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health. Biology of Reproduction. 104 (2), 282-293 (2021).
  17. Hewitt, S. C., et al. Progesterone signaling in endometrial epithelial organoids. Cells. 11 (11), 1760(2022).
  18. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).
  19. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288(2018).
  20. Rekhtman, N., et al. Novel modification of HistoGel-based cell block preparation method: improved sufficiency for molecular studies. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (4), 529-535 (2018).
  21. Shidham, V. B. CellBlockistry: Chemistry and art of cell-block making - A detailed review of various historical options with recent advances. Cytojournal. 16, 12(2019).
  22. Ali, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. Protocol for in vitro establishment and long-term culture of mouse vaginal organoids. STAR Protocols. 1 (2), 100088(2020).
  23. Kurihara, I., et al. COUP-TFII mediates progesterone regulation of uterine implantation by controlling ER activity. PLoS Genet. 3 (6), 102(2007).
  24. McMaster, M. T., Teng, C. T., Dey, S. K., Andrews, G. K. Lactoferrin in the mouse uterus: analyses of the preimplantation period and regulation by ovarian steroids. Molecular Endocrinology. 6 (1), 101-111 (1992).
  25. Huang, H. L., Chu, S. T., Chen, Y. H. Ovarian steroids regulate 24p3 expression in mouse uterus during the natural estrous cycle and the preimplantation period. The Journal of Endocrinology. 162 (1), 11-19 (1999).
  26. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  27. Bigsby, R. M., Cunha, G. R. Estrogen stimulation of deoxyribonucleic acid synthesis in uterine epithelial cells which lack estrogen receptors. Endocrinology. 119 (1), 390-396 (1986).
  28. Clementi, C., et al. Activin-like kinase 2 functions in peri-implantation uterine signaling in mice and humans. PLoS Genetics. 9 (11), 1003863(2013).
  29. Jeong, J. W., et al. Foxa2 is essential for mouse endometrial gland development and fertility. Biology of Reproduction. 83 (3), 396-403 (2010).
  30. Song, Y., et al. Endometriotic organoids: a novel in vitro model of endometriotic lesion development. bioRxiv. , (2022).
  31. Miyazaki, K., et al. Generation of progesterone-responsive endometrial stromal fibroblasts from human induced pluripotent stem cells: role of the WNT/CTNNB1 pathway. Stem Cell Reports. 11 (5), 1136-1155 (2018).
  32. Yoshimatsu, S., Kisu, I., Qian, E., Noce, T. A new horizon in reproductive research with pluripotent stem cells: successful in vitro gametogenesis in rodents, its application to large animals, and future in vitro reconstitution of reproductive organs such as "Uteroid" and "Oviductoid". Biology. 11 (7), 987(2022).
  33. Cheung, V. C., et al. Pluripotent stem cell-derived endometrial stromal fibroblasts in a cyclic, hormone-responsive, coculture model of human decidua. Cell Reports. 35 (7), 109138(2021).
  34. McGowen, M. R., Erez, O., Romero, R., Wildman, D. E. The evolution of embryo implantation. The International Journal of Development Biology. 58 (2-4), 155-161 (2014).
  35. Carson, D. D., et al. Embryo implantation. Developmental Biology. 223 (2), 217-237 (2000).
  36. Li, Y., Sun, X., Dey, S. K. Entosis allows timely elimination of the luminal epithelial barrier for embryo implantation. Cell Reports. 11 (3), 358-365 (2015).
  37. Jain, V., Chodankar, R. R., Maybin, J. A., Critchley, H. O. D. Uterine bleeding: how understanding endometrial physiology underpins menstrual health. Nature Reviews Endocrinology. 18 (5), 290-308 (2022).
  38. Hayashi, K., et al. Wnt genes in the mouse uterus: potential regulation of implantation. Biology of Reproduction. 80 (5), 989-1000 (2009).
  39. Dunlap, K. A., et al. Postnatal deletion of Wnt7a inhibits uterine gland morphogenesis and compromises adult fertility in mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 386-396 (2011).
  40. Ter Steege, E. J., Bakker, E. R. M. The role of R-spondin proteins in cancer biology. Oncogene. 40 (47), 6469-6478 (2021).
  41. Brazil, D. P., Church, R. H., Surae, S., Godson, C., Martin, F. BMP signalling: agony and antagony in the family. Trends in Cell Biology. 25 (5), 249-264 (2015).
  42. Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Science. 96 (11), 791-800 (2005).
  43. Zhang, Y., Que, J. BMP signaling in development, stem cells, and diseases of the gastrointestinal tract. Annual Review of Physiology. 82, 251-273 (2020).
  44. Plikus, M. V., et al. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).
  45. Gurung, S., Werkmeister, J. A., Gargett, C. E. Inhibition of transforming growth factor-β receptor signaling promotes culture expansion of undifferentiated human endometrial mesenchymal stem/stromal cells. Scientific Reports. 5, 15042(2015).
  46. Lucciola, R., et al. Impact of sustained transforming growth factor-β receptor inhibition on chromatin accessibility and gene expression in cultured human endometrial MSC. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 567610(2020).
  47. Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125(2020).
  48. Gnecco, J. S., et al. Physiomimetic Models of Adenomyosis. Seminars in Reproductive Medicine. 38 (2-03), 179-196 (2020).
  49. Nikolakopoulou, K., Turco, M. Y. Investigation of infertility using endometrial organoids. Reproduction. 161 (5), 113-127 (2021).
  50. Kim, J. J. Preparing for implantation. Elife. 10, 73739(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Uterus epitheel3D organo dkweekmechanische dissociatieenzymatische dissociatiegenexpressieimmunokleuringstroma compartimentfluorescentiemicroscopie
Het vaststellen van 3D-endometriumorganoïden uit de baarmoeder van de muis
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.