Methodenartikel

In vitro Methode om op geslacht gebaseerde verschillen in conjunctivale bekercellen te bestuderen

DOI:

10.3791/64456

⸱

28 juli 2023

 ,  , 
1Department of Ophthalmology Schepens Eye Research Institute, Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fenolroodvrij/foetaal runderserumvrij medium is een betere optie dan geavanceerde RPMI om exogene hormonen te elimineren zonder de normale functie van conjunctivale bekercellen te veranderen bij de studie van op geslacht gebaseerde verschillen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Droge ogen is een multifactoriële ziekte die de gezondheid van het oogoppervlak aantast, met een aanzienlijk hogere prevalentie bij vrouwen. Verstoring van het gelvormende mucine dat wordt uitgescheiden door conjunctivale bekercellen (CGC's) op het oogoppervlak draagt bij aan meerdere ziekten van het oogoppervlak. De eliminatie van exogene geslachtshormonen is essentieel om consistente resultaten te verkrijgen tijdens in vitro onderzoek naar seksegerelateerde verschillen in CGC's. Dit artikel beschrijft een methode om de aanwezigheid van exogene hormonen te minimaliseren in de studie van op geslacht gebaseerde verschillen in CGC's met behoud van hun fysiologische functie. CGC's van postmortale menselijke donoren van beide geslachten werden gekweekt uit stukjes van het bindvlies in RPMI-medium met 10% foetaal runderserum (FBS) (aangeduid als het volledige medium) tot samenvloeiing. Bijna 48 uur voor het begin van de experimenten werden CGC's overgebracht naar RPMI-medium zonder fenolrood of FBS, maar met 1% BSA (aangeduid als fenolroodvrij medium). De normale cellulaire functie werd bestudeerd door de toename van intracellulaire [Ca 2+] ([Ca 2+]i) na carbachol (Cch, 1 x 10-4 M) stimulatie te meten met behulp van fura 2/acetoxymethyl (AM) microscopie. Het resultaat toont aan dat CGC's na 48 uur hun normale functie in de fenolroodvrije media behielden. Er werd geen significant verschil in [Ca2+]i-respons waargenomen tussen fenolroodvrij RPMI-medium en volledig medium bij Cch-stimulatie. Daarom raden we aan om het fenolrode vrije RPMI-medium met 1% BSA te gebruiken om exogene hormonen te elimineren zonder de normale functie van CGC's te veranderen bij de studie van op geslacht gebaseerde verschillen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verschillen op basis van geslacht beïnvloeden meerdere processen van het oogoppervlak 1,2,3. De klinische manifestatie van deze op geslacht gebaseerde verschillen is het verschil in de prevalentie van veel aandoeningen van het oogoppervlak tussen mannen en vrouwen, zoals droge ogen en conjunctivitis 4,5,6. Er zijn aanwijzingen dat op geslacht gebaseerde verschillen voortkomen uit meerdere biologische niveaus, waaronder de verschillende profielen van genen op X- en Y-chromosomen7 en de effecten van hormonen8. Het bestuderen van de moleculaire basis van op geslacht gebaseerde verschillen kan een beter begrip van ziekte opleveren en uiteindelijk gepersonaliseerde geneeskunde verbeteren.

Het oogoppervlak bestaat uit de bovenliggende traanfilm, het hoornvlies en het bindvlies. Op geslacht gebaseerde verschillen worden waargenomen in meerdere componenten van het oogoppervlak, waaronder de traanfilm 9,10, hoornvlies 11, de traanklier 12,13 en klieren van Meibom die ook tranen afscheiden 12. Talrijke mechanistische studies hebben het effect van geslachtshormonen op het hoornvlies en de bijbehorende componenten onderzocht14,15; Er is echter weinig bekend over de op geslacht gebaseerde verschillen in het bindvlies en zijn bekercellen. Het bindvlies is een slijmvlies dat de sclera en het binnenoppervlak van het ooglid bedekt. Het epitheel van het bindvlies bestaat uit niet-keratiniserende, meerlagige, gelaagde plaveiselcellen16.

Onder de gestratificeerde plaveiselcellen van het bindvlies bevinden zich bekercellen (CGC's) afgewisseld op het apicale oppervlak van het epitheel. Deze bekercellen worden gekenmerkt door het grote aantal secretoire korrels dat zich aan de apicale poolbevindt 17. CGC's synthetiseren en scheiden het gelvormende mucine MUC5AC af om het oogoppervlak te hydrateren en te smeren tijdens het knipperen17. De mucinesecretie wordt strak gereguleerd door het intracellulaire [Ca 2+] ([Ca2+]i) en de activering van het Ras-afhankelijke extracellulaire signaalgereguleerde kinase (ERK1/2)18. Het onvermogen om mucine af te scheiden resulteert in uitdroging van het oogoppervlak en gevolgen van pathologische afwijkingen. Op een ontstoken oogoppervlak leidt uitgebreide mucinesecretie gestimuleerd door ontstekingsmediatoren echter tot een perceptie van plakkerigheid en jeuk van het oog19. Deze aandoeningen met verstoorde mucinesecretie zullen uiteindelijk leiden tot verslechtering van het oogoppervlak.

De rol van bekercellen als de belangrijkste bron van oculair mucine wordt al lang erkend20, maar de op geslacht gebaseerde verschillen in mucineregulatie in zowel fysiologische als pathologische toestanden blijven onontdekt. Een in vitro systeem zou nuttig zijn om de functie van bekercellen te controleren zonder het hormonale effect of met een nauwkeurig gecontroleerd niveau van geslachtshormonen. Hoewel er een conjunctivale epitheelcellijn is ontwikkeld21, is er geen bekercellijn met functionele mucinesecretie beschikbaar. Daarom hebben we onze ontwikkelde primaire menselijke CGC-cultuur aangepast om een methode vast te stellen om het op geslacht gebaseerde verschil in vitro16 te analyseren en het als volgt te presenteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Al het menselijk weefsel werd gedoneerd aan de oogbank met voorafgaande geïnformeerde toestemming en toestemming van de donor voor gebruik in wetenschappelijk onderzoek. Het gebruik van het menselijk bindvliesweefsel werd beoordeeld door de Massachusetts Eye and Ear Human Studies Committee en vastgesteld dat het was vrijgesteld en niet voldeed aan de definitie van onderzoek met menselijke proefpersonen.

1. Primaire menselijke bekercelkweek

  1. Verkrijg uit de oogbank menselijk bindvliesweefsel16.
  2. Bereid het kweekmedium, RPMI-1640 kweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM glutamine, 2 mM niet-essentiële aminozuren (NEAA), 2 mM natriumpyruvaat, 100 μg/ml penicilline-streptomycine en 2 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES).
  3. Voer de primaire celkweek uit zoals hieronder beschreven.
    1. Hak het weefsel in 1 mm3 stukken met een steriel scalpel en zaad op kweekplaten in een kweekkap. Zaai vier stukken in elk putje van een plaat met 6 putjes, in 1 ml compleet RPMI-medium. Hoewel de oriëntatie van het weefselstuk geen invloed heeft op de celgroei, moet u ervoor zorgen dat de stukjes zich aan de kweekplaat hechten om uitgroei te garanderen met behulp van het scalpelmesje.
    2. Plaats de weefselstukjes in de incubator met 95% lucht en 5% CO2 bij 37 °C. Ververs hetzelfde kweekmedium om de dag totdat de bekercellen in ongeveer 14 dagen 70%-80% samenvloeiing bereiken. Verwijder de weefselplug ongeveer 72 uur na het zaaien.
      OPMERKING: Humaan conjunctivaal epitheel bevat voornamelijk gestratificeerde plaveiselcellen en bekercellen. RPMI is een selectief medium voor bekercellen. Zelden in menselijke CGC-cultuur kunnen fibroblasten rond dag 7 groeien. De methode om de cultuur te zuiveren werd beschreven in een eerdere publicatie 22.
    3. Controleer de zuiverheid van de GC-cultuur met behulp van immunofluorescentiemicroscopie (IFM) gericht op cytokeratine (CK)7 en Helix pomatia lectine-1 (HPA-1)22 volgens de standaard IFM-methode beschreven in19; Zie representatieve resultaten.

2. Menselijke conjunctivale bekercelpassage en experimentele voorbereiding

  1. Spoel de cellen met PBS (pH = 7,4) en maak de cellen los met trypsinisatie met 0,05% trypsine in 1x EDTA. Observeer de cellen elke minuut onder een microscoop. Zodra de cellen loskomen van de bodem, deactiveert u de trypsine met behulp van volledige RPMI-media.
  2. Centrifugeer de cellen bij 150 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de celpellet in het volledige RPMI-kweekmedium en zaai opnieuw in op kweekschalen met glazen bodem voor [Ca2+]i-meting . Het totale volume van het medium is 300 μL per gerecht. Houd de media in het midden van het glazen gedeelte van de schaal.
  3. Eliminatie van hormonen in kweekmedia: Het kweekmedium kan geslachtshormonen bevatten, vooral de FBS. Aangezien het fenolrood in RPMI-1640 een oestrogene activiteit heeft 23,24, vervangt u het RPMI-medium door fenolroodvrij RPMI-medium en past u de pH aan op 7,45 met behulp van pH-strips na het bereiden van het volledige medium. De HEPES in het complete medium handhaaft de pH binnen een relatief klein bereik.

3. Fura-2/acetoxymethyl (AM)-test voor [Ca2+]i-meting

  1. Voer het laden van Fura-2/AM uit zoals hieronder beschreven.
    1. Incubeer de cellen in schalen met glazen bodem gedurende 1 uur bij 37 °C, omgevingsatmosfeer, en beschermd tegen licht met Krebs-Ringer bicarbonaatbuffer (KRB; bevattende 119 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1,0 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO4 en 25 mM NaHCO3) met 0,5% HEPES (tabel 1), plus 0,5% BSA, 0,5 μM fura-2/AM, 8 μM pluronzuur F127 en 250 μM sulfinpyrazon.
    2. Stel voor gebruik de pH in op 7,45 met behulp van een pH-meter. Was de cellen na het laden met fura-2/AM onmiddellijk vóór de meting van [Ca 2+]i met KRB met250 μM sulfinpyrazon.
  2. Voer een [Ca2+]i-meting uit zoals hieronder beschreven.
    1. Plaats de schaaltjes met de cellen geladen met fura-2 onder de microscoop, zoek een representatief veld met tussen de 20 cellen en 50 cellen bij een vergroting van 200x en gebruik de Freehand-functie om een omtrek rond elke cel te tekenen om aan de software aan te geven wat wel en wat niet achtergrondfluorescentie is.
    2. Wacht tot de software automatisch de achtergrondfluorescentie van de meting aftrekt en klik op de knop Experiment starten .
    3. Wacht vervolgens tussen 8 s en 15 s om de basale calciumspiegels in de cellen vast te stellen voordat u voorzichtig pipettert in de betreffende agonist. Ga door met meten gedurende ten minste 120 s na het toevoegen van de agonist of totdat de calciumspiegels zijn teruggekeerd naar de uitgangswaarde.
  3. Voer een gegevensanalyse uit zoals hieronder beschreven.
    1. Gebruik de verandering in piek [Ca2+]i om de acties van de stimuli weer te geven. Bereken het gemiddelde basale calciumgehalte in elke cel vanaf de eerste 8-15 seconden van de metingen. Als dat getal gelijk is aan of groter is dan 500 nM, verwijdert u die cel uit de gegevensset omdat deze apoptose of necrose ondergaat.
    2. Zodra het basale niveau van elke cel is berekend, trekt u dat bedrag af van het maximaal gemeten [Ca2+]i voor dezelfde cel. Gemiddelde van de verandering in piek [Ca2+]I voor alle cellen in een bepaalde schaal.
    3. Om consistentie te garanderen, registreert u de respons van elke stimulus in tweevoud en berekent u de gemiddelde waarde van de veranderingen in piek [Ca2+]i verkregen uit de duplicaten als één gegevenspunt van de individuele menselijke steekproef. Vergelijk de gegevens van verschillende groepen met behulp van een geschikte data-analysemethode op basis van de onderzoeksopzet.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke CGC's in de primaire cultuur groeien tot 80% confluentie in ongeveer 14 dagen. Het celtype werd bevestigd door immunofluorescentiekleuring met antilichamen tegen de bekercelmarkers CK7 en HPA-125 (Figuur 1). Hoewel het verwijderen van FBS uit het medium de geslachtshormonen kan elimineren, kan het ontbreken van FBS mogelijk de cellulaire respons beïnvloeden. Om de hormooneliminatiemethode te verifiëren, werd een cholinerge agonist (carbachol, Cch 1 × 1...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderzoeken van de op geslacht gebaseerde verschillen in oogweefsel helpt bij het begrijpen van de processen van ziekten, met name droge ogen en allergische conjunctivitis, die onevenredig veel invloed hebben op één geslacht 4,5,6. Hoewel voor deze onderzoeken diermodellen kunnen worden gebruikt, zijn gegevens die rechtstreeks uit menselijk weefsel zijn verkregen essentieel vanwege de grootste gelijkenis met de menselijke ce...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk wordt gefinancierd door de National Eye Institute Grant EY019470 (DAD).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.05% trypsin with 1x EDTAGibco (Grand Island, NY)25300-054
4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acidFisher Bioreagent (Pittsburgh, PA)BP310-500
Advanced RPMI mediaGibco (Grand Island, NY)12633020
carbacholCayman Chemical (Ann Arbor, MI)144.86
Fetaal bovien serumR&D (Minneapolis, MN)S11150H
Fura-2- acetoxymethyl ester Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)F1221
Human conjunctief weefselEversight Eye Bank (Ann Arbor, MI)N/A
anorganisch zout voor KRB-bufferSigma-Aldrich (St. Louis, MO)Elk merk werkt
L-glutamine Lonza Group (Basel, Zwitserland)17-605F
niet-essentiële aminozurenGibco (Grand Island, NY)11140-050
penicilline/streptomycineGibco (Grand Island, NY)15140-122
fenolrood-vrij RPMI-media Gibco (Grand Island, NY)11835055
Pluronic zuur F127MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)P2443-250G
RPMI-1640-kweekmediumGibco (Grand Island, NY)21875034
scalpelThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)12460451Elk steriel chirurgisch scalpel kan werken
natriumpyruvaatGibco (Grand Island, NY)11360-070
sulfinpyrazoneMilliporeSigma (Burlington, MA, USA)S9509-5G

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
  2. Wang, S. B., et al. Estrogen negatively regulates epithelial wound healing and protective lipid mediator circuits in the cornea. FASEB Journal. 26, 1506-1516 (2012).
  3. Sullivan, D. A., Block, L., Pena, J. D. Influence of androgens and pituitary hormones on the structural profile and secretory activity of the lacrimal gland. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 74, 421-435 (1996).
  4. Schaumberg, D. A., Dana, R., Buring, J. E., Sullivan, D. A. Prevalence of dry eye disease among US men: estimates from the Physicians' Health Studies. Archives of Ophthalmology. 127, 763-768 (2009).
  5. Tellefsen Nøland, S., et al. Sex and age differences in symptoms and signs of dry eye disease in a Norwegian cohort of patients. The Ocular Surface. 19, 68-73 (2021).
  6. Sullivan, D. A., et al. TFOS DEWS II Sex, gender, and hormones report. The Ocular Surface. 15, 284-333 (2017).
  7. Meester, I., et al. SeXY chromosomes and the immune system: reflections after a comparative study. Biology of Sex Differences. 11, 3(2020).
  8. Yang, J. -H., et al. Hormone replacement therapy reverses the decrease in natural killer cytotoxicity but does not reverse the decreases in the T-cell subpopulation or interferon-gamma production in postmenopausal women. Fertility and Sterility. 74, 261-267 (2000).
  9. Orucoglu, F., Akman, M., Onal, S. Analysis of age, refractive error and gender related changes of the cornea and the anterior segment of the eye with Scheimpflug imaging. Contact Lens & Anterior Eye. 38, 345-350 (2015).
  10. Strobbe, E., Cellini, M., Barbaresi, U., Campos, E. C. Influence of age and gender on corneal biomechanical properties in a healthy Italian population. Cornea. 33, 968-972 (2014).
  11. Sullivan, D. A., Jensen, R. V., Suzuki, T., Richards, S. M. Do sex steroids exert sex-specific and/or opposite effects on gene expression in lacrimal and meibomian glands. Molecular Vision. 15, 1553-1572 (2009).
  12. Bukhari, A. A., Basheer, N. A., Joharjy, H. I. Age, gender, and interracial variability of normal lacrimal gland volume using MRI. Ophthalmic Plastic and Reconstructive Surgery. 30, 388-391 (2014).
  13. Sullivan, B. D., Evans, J. E., Dana, M. R., Sullivan, D. A. Influence of aging on the polar and neutral lipid profiles in human meibomian gland secretions. Archives of Ophthalmology. 124, 1286-1292 (2006).
  14. Ebeigbe, J. A., Ebeigbe, P. N. The influence of sex hormone levels on tear production in postmenopausal Nigerian women. African Journal of Medicine and Medical Sciences. 43, 205-211 (2014).
  15. Suzuki, T., et al. Estrogen's and progesterone's impact on gene expression in the mouse lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 158-168 (2006).
  16. Shatos, M. A., et al. Isolation and characterization of cultured human conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 2477-2486 (2003).
  17. Huang, A. J., Tseng, S. C., Kenyon, K. R. Morphogenesis of rat conjunctival goblet cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 29, 969-975 (1988).
  18. Li, D., et al. Resolvin D1 and aspirin-triggered resolvin D1 regulate histamine-stimulated conjunctival goblet cell secretion. Mucosal Immunology. 6, 1119-1130 (2013).
  19. Dartt, D. A., Masli, S. Conjunctival epithelial and goblet cell function in chronic inflammation and ocular allergic inflammation. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 14, 464-470 (2014).
  20. Mantelli, F., Argüeso, P. Functions of ocular surface mucins in health and disease. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 8, 477-483 (2008).
  21. García-Posadas, L., et al. Characterization and functional performance of a commercial human conjunctival epithelial cell line. Experimental Eye Research. 223, 109220(2022).
  22. Shatos, M. A., et al. Isolation, characterization, and propagation of rat conjunctival goblet cells in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42, 1455-1464 (2001).
  23. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57, 169-178 (1988).
  24. Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 2496-2500 (1986).
  25. García-Posadas, L., et al. Interaction of IFN-γ with cholinergic agonists to modulate rat and human goblet cell function. Mucosal Immunology. 9, 206-217 (2016).
  26. Li, D., Jiao, J., Shatos, M. A., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Effect of VIP on intracellular [Ca2 ], extracellular regulated kinase 1/2, and secretion in cultured rat conjunctival goblet cells. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54, 2872-2884 (2013).
  27. Contrò, V., et al. Sex steroid hormone receptors, their ligands, and nuclear and non-nuclear pathways. AIMS Molecular Science. 2, 294-310 (2015).
  28. Valley, C. C., Solodin, N. M., Powers, G. L., Ellison, S. J., Alarid, E. T. Temporal variation in estrogen receptor-alpha protein turnover in the presence of estrogen. Journal of Molecular Endocrinology. 40, 23-34 (2008).
  29. Campen, C. A., Gorski, J. Anomalous behavior of protein synthesis inhibitors on the turnover of the estrogen receptor as measured by density labeling. Endocrinology. 119, 1454-1461 (1986).
  30. Yang, M., et al. Sex-based differences in conjunctival goblet cell responses to pro-inflammatory and pro-resolving mediators. Scientific Reports. 12, 16305(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Conjunctival Goblet CellsSex Based DifferencesDry Eye DiseaseIntracellular Calcium MeasurementPrimary Cell CulturePhenol Red Free MediumMucin SecretionImmunofluorescent StainingCarbachol StimulationHuman Conjunctiva

Gerelateerde artikelen