Methodenartikel

In vitro Methode om op geslacht gebaseerde verschillen in conjunctivale bekercellen te bestuderen

DOI:

10.3791/64456

⸱

28 juli 2023

 ,  , 
1Department of Ophthalmology Schepens Eye Research Institute, Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fenolroodvrij/foetaal runderserumvrij medium is een betere optie dan geavanceerde RPMI om exogene hormonen te elimineren zonder de normale functie van conjunctivale bekercellen te veranderen bij de studie van op geslacht gebaseerde verschillen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Droge ogen is een multifactoriële ziekte die de gezondheid van het oogoppervlak aantast, met een aanzienlijk hogere prevalentie bij vrouwen. Verstoring van het gelvormende mucine dat wordt uitgescheiden door conjunctivale bekercellen (CGC's) op het oogoppervlak draagt bij aan meerdere ziekten van het oogoppervlak. De eliminatie van exogene geslachtshormonen is essentieel om consistente resultaten te verkrijgen tijdens in vitro onderzoek naar seksegerelateerde verschillen in CGC's. Dit artikel beschrijft een methode om de aanwezigheid van exogene hormonen te minimaliseren in de studie van op geslacht gebaseerde verschillen in CGC's met behoud van hun fysiologische functie. CGC's van postmortale menselijke donoren van beide geslachten werden gekweekt uit stukjes van het bindvlies in RPMI-medium met 10% foetaal runderserum (FBS) (aangeduid als het volledige medium) tot samenvloeiing. Bijna 48 uur voor het begin van de experimenten werden CGC's overgebracht naar RPMI-medium zonder fenolrood of FBS, maar met 1% BSA (aangeduid als fenolroodvrij medium). De normale cellulaire functie werd bestudeerd door de toename van intracellulaire [Ca 2+] ([Ca 2+]i) na carbachol (Cch, 1 x 10-4 M) stimulatie te meten met behulp van fura 2/acetoxymethyl (AM) microscopie. Het resultaat toont aan dat CGC's na 48 uur hun normale functie in de fenolroodvrije media behielden. Er werd geen significant verschil in [Ca2+]i-respons waargenomen tussen fenolroodvrij RPMI-medium en volledig medium bij Cch-stimulatie. Daarom raden we aan om het fenolrode vrije RPMI-medium met 1% BSA te gebruiken om exogene hormonen te elimineren zonder de normale functie van CGC's te veranderen bij de studie van op geslacht gebaseerde verschillen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verschillen op basis van geslacht beïnvloeden meerdere processen van het oogoppervlak 1,2,3. De klinische manifestatie van deze op geslacht gebaseerde verschillen is het verschil in de prevalentie van veel aandoeningen van het oogoppervlak tussen mannen en vrouwen, zoals droge ogen en conjunctivitis 4,5,6. Er zijn aanwijzingen dat op geslacht gebaseerde verschillen voortkomen uit meerdere biologische niveaus, waaronder de verschillende profielen van genen op X- en Y-chromosomen

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Al het menselijk weefsel werd gedoneerd aan de oogbank met voorafgaande geïnformeerde toestemming en toestemming van de donor voor gebruik in wetenschappelijk onderzoek. Het gebruik van het menselijk bindvliesweefsel werd beoordeeld door de Massachusetts Eye and Ear Human Studies Committee en vastgesteld dat het was vrijgesteld en niet voldeed aan de definitie van onderzoek met menselijke proefpersonen.

1. Primaire menselijke bekercelkweek

  1. Verkrijg uit de oogbank menselijk bindvliesweefsel16.
  2. Bereid het kweekmedium, RPMI-1640 kweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS)....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke CGC's in de primaire cultuur groeien tot 80% confluentie in ongeveer 14 dagen. Het celtype werd bevestigd door immunofluorescentiekleuring met antilichamen tegen de bekercelmarkers CK7 en HPA-125 (Figuur 1). Hoewel het verwijderen van FBS uit het medium de geslachtshormonen kan elimineren, kan het ontbreken van FBS mogelijk de cellulaire respons beïnvloeden. Om de hormooneliminatiemethode te verifiëren, werd een cholinerge agonist (carbachol, Cch 1 × 1.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderzoeken van de op geslacht gebaseerde verschillen in oogweefsel helpt bij het begrijpen van de processen van ziekten, met name droge ogen en allergische conjunctivitis, die onevenredig veel invloed hebben op één geslacht 4,5,6. Hoewel voor deze onderzoeken diermodellen kunnen worden gebruikt, zijn gegevens die rechtstreeks uit menselijk weefsel zijn verkregen essentieel vanwege de grootste gelijkenis met de menselijke ce.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk wordt gefinancierd door de National Eye Institute Grant EY019470 (DAD).

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.05% trypsin with 1x EDTAGibco (Grand Island, NY)25300-054
4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acidFisher Bioreagent (Pittsburgh, PA)BP310-500
Advanced RPMI mediaGibco (Grand Island, NY)12633020
carbacholCayman Chemical (Ann Arbor, MI)144.86
Fetaal bovien serumR&D (Minneapolis, MN)S11150H
Fura-2- acetoxymethyl ester Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)F1221
Human conjunctief weefselEversight Eye Bank (Ann Arbor, MI)N/A
anorganisch zout voor KRB-bufferSigma-Aldrich (St. Louis, MO)Elk merk werkt
L-glutamine Lonza Group (Basel, Zwitserland)17-605F
niet-essentiële aminozurenGibco (Grand Island, NY)11140-050
penicilline/streptomycineGibco (Grand Island, NY)15140-122
fenolrood-vrij RPMI-media Gibco (Grand Island, NY)11835055
Pluronic zuur F127MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)P2443-250G
RPMI-1640-kweekmediumGibco (Grand Island, NY)21875034
scalpelThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)12460451Elk steriel chirurgisch scalpel kan werken
natriumpyruvaatGibco (Grand Island, NY)11360-070
sulfinpyrazoneMilliporeSigma (Burlington, MA, USA)S9509-5G

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gao, Y., et al. Female-specific downregulation of tissue polymorphonuclear neutrophils drives impaired regulatory T cell and amplified effector T cell responses in autoimmune dry eye disease. Journal of Immunology. 195, 3086-3099 (2015).
  2. Wang, S. B., et al.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Conjunctival Goblet CellsSex Based DifferencesDry Eye DiseaseIntracellular Calcium MeasurementPrimary Cell CulturePhenol Red Free MediumMucin SecretionImmunofluorescent StainingCarbachol StimulationHuman Conjunctiva

Gerelateerde artikelen