Dit protocol demonstreert het gebruik van een microfluïdisch kanaal met veranderende geometrie langs de vloeistofstroomrichting om extensieve spanning (stretching) te genereren om vezels uit te lijnen in een 3D-collageenhydrogel (< 250 μm dik). De resulterende uitlijning strekt zich uit over enkele millimeters en wordt beïnvloed door de extensieve reksnelheid.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Micro-engineering 3D collageen hydrogels met lange-afstand vezeluitlijning
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Uitgelijnde collageen I (COL1) vezels begeleiden de motiliteit van tumorcellen, beïnvloeden de morfologie van endotheelcellen, controleren stamceldifferentiatie en zijn een kenmerk van hart- en bewegingsweefsels. Om de celrespons op uitgelijnde micro-omgevingen in vitro te bestuderen, zijn verschillende protocollen ontwikkeld om COL1-matrices te genereren met gedefinieerde vezeluitlijning, waaronder magnetische, mechanische, celgebaseerde en microfluïdische methoden. Hiervan bieden microfluïdische benaderingen geavanceerde mogelijkheden, zoals nauwkeurige controle over vloeistofstromen en de cellulaire micro-omgeving. De microfluïdische benaderingen om uitgelijnde COL1-matrices te genereren voor geavanceerde in vitro kweekplatforms zijn echter beperkt tot dunne "matten" (<40 μm in dikte) van COL1-vezels die zich uitstrekken over afstanden van minder dan 500 μm en niet bevorderlijk zijn voor 3D-celkweektoepassingen. Hier presenteren we een protocol om 3D COL1-matrices (130-250 μm dik) te fabriceren met millimeterschaalgebieden van gedefinieerde vezeluitlijning in een microfluïdisch apparaat. Dit platform biedt geavanceerde celkweekmogelijkheden om gestructureerde weefselmicro-omgevingen te modelleren door directe toegang te bieden tot de micro-engineered matrix voor celkweek.
Inleiding
Cellen bevinden zich in een complex 3D-vezelig netwerk dat de extracellulaire matrix (ECM) wordt genoemd, waarvan het grootste deel bestaat uit het structurele eiwit collageen type I (COL1)1,2. De biofysische eigenschappen van de ECM geven aanwijzingen aan cellen en als reactie daarop hermodelleren cellen de ECM-microarchitectuur 3,4,5. Deze reciproke cel-matrix interacties kunnen aanleiding geven tot uitgelijnde COL1 vezeldomeinen6 die angiogenese en celinvasie in de tumo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Fabricage van het tweedelige kanaal en de modulaire platformbasis
OPMERKING: Het microfluïdische kanaal is opgebouwd uit twee delen - de microfluïdische kanaal "uitsparing", die scheermes gesneden is uit een polydimethyl siloxaan (PDMS) plaat van gedefinieerde dikte, en de kanaalafdekking, die reversibel aan de uitsparing bindt en het kanaal vormt. Het kanaal is omgeven door een poly (methylmethacrylaat) (PMMA) frame dat zal fungeren als een mediareservoir (figuur 1). Het PMMA-frame kan ook worden gebruikt om gespecialiseerde modules magnetisch vast te zetten voor extra functionaliteit.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Wanneer een zelfassemblerende COL1-oplossing door een kanaal met afnemende doorsnede stroomt, neemt de stroomsgewijze snelheid (v x) van de COL1-oplossing lokaal toe met een magnitude, ∂v x, langs de lengte van de vernauwing tussen de twee segmenten (∂x), wat resulteert in een extensieve reksnelheid (ε̇) waarbij ε̇ = ∂v x/∂x. De extensieve reksnelheid kan worden berekend uit de vloeistofsnelheid, die wordt gemeten met behulp van deeltjesbeeldvelocimetrie (PIV), zoals te zien is in
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Protocollen voor het genereren van COL1-matrices met uitgelijnde vezels zijn beschreven met behulp van magnetische methoden, de directe toepassing van mechanische spanning en microfluïdische technieken47. Microfluïdische benaderingen worden vaak gebruikt om microfysiologische systemen te creëren vanwege hun goed gedefinieerde stroom- en transportkenmerken, die nauwkeurige controle over de biochemische micro-omgeving mogelijk maken. Aangezien uitgelijnde COL1-vezels belangrijke instructieve signale.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Alle auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het National Institute of Health onder toekenningsnummer R21GM143658 en door de National Science Foundation onder subsidienummer 2150798. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de financieringsagentschappen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES) | Sigma Aldrich | 440140-100ML | |
| 20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip | Jensen Global | JG-20-1.0-90 | |
| 3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet | KJ Magnetics | D31 | |
| 3M (TC) 12X12-6-467MP | DigiKey | 3M9726-ND | |
| ACETONE ACS REAGENT ≥99.5% | Signa Aldrich | 179124-4L | |
| BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER | Electro-Technic Products | 12051A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear cast acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K181 | |
| Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested | VWR | 45000-666 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CT-FIRE software | LOCI - University of Wisconsin | ||
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL | Lonza | CC-3162 | |
| Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL | VWR | VWRV0875-100ML | |
| Graphtec CELITE-50 | Graphtec | CE LITE-50 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
| High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer | McMaster-Carr | 87315K62 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial cells | Thermo Fisher Scientific | C0035C | |
| Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A4154 | |
| Laser cutter | Full Spectrum | 20x12 H-series | |
| Microfluidics Syringe pump | New Era Syringe Pumps | NE-1002X | |
| Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E | Gilson | FD10006 | |
| Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nutragen Bovine Atelo Collagen | Advanced BioMatrix | 5010-50ML | |
| Pbs (10x), pH 7.4 | VWR | 70011044.00 | |
| PBS pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010049.00 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100 | Alfa Aesar | J63521 | |
| Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20 | USCUTTER | GRPCARSHTN | |
| Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip | Restek | 22766.00 | |
| Silicon wafer | University wafer | 452 | |
| Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g | VWR | BDH9292-500G | |
| Sylgard 184 | VWR | 102092-312 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352.00 |
Referenties
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. The Journal of Pathology. 200 (4),....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
