Method Article

Evaluatie van de integriteit van het spindelassemblagecontrolepunt in muizenoöcyten

DOI:

10.3791/64459

⸱

September 13th, 2022

 ,  , 
1Department of Genetics, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Human Genetics Institute of New Jersey, 3Department of Theriogenology, Faculty of Veterinary Medicine, Mansoura University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fout in chromosoomsegregatie is een veel voorkomend kenmerk in eicellen. Daarom geeft het bestuderen van het controlepunt voor de spindelassemblage belangrijke aanwijzingen over de mechanismen die nodig zijn om gezonde eieren te produceren. Het huidige protocol beschrijft drie complementaire testen om de integriteit van het controlepunt van de spindelassemblage in muizenoöcyten te evalueren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aneuploïdie is de belangrijkste genetische afwijking die een vroege miskraam en zwangerschapsfalen bij mensen veroorzaakt. De meeste fouten in chromosoomsegregatie die aanleiding geven tot aneuploïdie treden op tijdens meiose in eicellen, maar waarom oöcyten meiose foutgevoelig is, is nog steeds niet volledig begrepen. Tijdens de celdeling voorkomen cellen fouten in chromosoomsegregatie door het spindelassemblagecheckpoint (SAC) te activeren. Dit controlemechanisme is gebaseerd op het detecteren van kinetochore (KT) -microtubule (MT) hulpstukken en het detecteren van spanning gegenereerd door spindelvezels. Wanneer KT's niet worden losgemaakt, wordt de SAC geactiveerd en voorkomt de progressie van de celcyclus. De SAC wordt eerst geactiveerd door MPS1-kinase, wat de rekrutering en vorming van het mitotische checkpointcomplex (MCC) activeert, bestaande uit MAD1, MAD2, BUB3 en BUBR1. Vervolgens diffundeert de MCC in het cytoplasma en sekwesters CDC20, een anafase-bevorderende complex / cyclosoom (APC / C) activator. Zodra KT's gehecht raken aan microtubuli en chromosomen zijn uitgelijnd op de metafaseplaat, wordt de SAC gedempt, cdc20 vrijgegeven en wordt de APC / C geactiveerd, waardoor de afbraak van cycline B en securine wordt veroorzaakt, waardoor anafase kan beginnen. In vergelijking met somatische cellen is de SAC in eicellen niet zo effectief omdat cellen anafase kunnen ondergaan ondanks het feit dat ze niet-gehechte KT's hebben. Begrijpen waarom de SAC meer tolerant is en of deze permissiviteit een van de oorzaken is van chromosoomsegregatiefouten in eicellen moet nog verder worden onderzocht. Het huidige protocol beschrijft de drie technieken om de SAC-integriteit in muizenoöcyten uitgebreid te evalueren. Deze technieken omvatten het gebruik van nocodazol om MT's te depolymeriseren om de SAC-respons te evalueren, het volgen van SAC-uitschakeling door de kinetiek van Securin-vernietiging te volgen en het evalueren van de rekrutering van MAD2 naar KT's door immunofluorescentie. Samen onderzoeken deze technieken mechanismen die nodig zijn om gezonde eieren te produceren door een volledige evaluatie van de SAC-integriteit te bieden.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aneuploïdie, die voortkomt uit fouten in chromosoomsegregatie, is de belangrijkste oorzaak van vroege miskramen en is sterk gekoppeld aan fouten bij meiose1. Meiose onderscheidt zich van mitose omdat het bestaat uit twee rondes van celdeling zonder een tussenliggende DNA-replicatiestap. Bij meiose I scheiden homologe chromosomen terwijl zusterchromatiden bij elkaar blijven. Bij eicellen is deze stap foutgevoelig, wat leidt tot aneuploïde eiproductie2.

Om fouten in chromosoomsegregatie te voorkomen, activeren de meeste celtypen een bewakingsmechanisme dat de celcyclus pauzeert, het spindelassemblagecontrolepunt (SAC) genoemd. Dit mechanisme detecteert kinetochore (KT)-microtubule (MT) aanhechtingen en de spanning wordt gegenereerd wanneer chromosomen op een bipolaire manier worden georiënteerd3. Ongebonden kinetochoren veroorzaken een SAC-respons die begint met de rekrutering van MPS1, de hoofdregulator van de SAC, tot kinetochoren 3,4. MPS1 initieert de werving van andere SAC-componenten en fungeert als een platform om het mitotische checkpointcomplex (MCC) te vormen. De MCC, bestaande uit MAD1, MAD2, BUB3 en BUBR1, diffundeert in het cytoplasma en remt APC / C-activering door zijn activator CDC20 te sekwestreren. Zodra alle kinetochoren stabiel aan MT's zijn bevestigd en chromosomen zijn uitgelijnd op de metafaseplaat, wordt de SAC gedempt en de MCC demonteert en geeft CDC20 vrij, waardoor APC / C-activering mogelijk wordt. Actieve APC/C degradeert Securin en Cyclin B, twee belangrijke stappen bij het activeren van het begin van de anafase 5,6. In somatische cellen is de SAC streng omdat deze wordt geactiveerd door een enkel niet-vastgemaakt kinetochore en voldoende is om celcyclusstilstand te induceren6. Tijdens eicel meiose is de SAC echter meer tolerant en kunnen eicellen anafase I binnengaan met een of meer niet-vastgemaakte kinetochoren 6,7,8,9,10. Begrijpen waarom de SAC meer toegeeflijk is in eicellen is een voortdurend aandachtsgebied in het veld. Mechanismen die defecten in SAC-activering of SAC-uitschakeling veroorzaken, kunnen leiden tot fouten in chromosoomsegregatie of langdurige celcyclusstilstand en celdood. Daarom is het evalueren van de mechanismen die de SAC-integriteit in eicellen handhaven belangrijk om het proces van het vormen van gezonde, euploïde eieren te begrijpen.

Dit protocol beschrijft technieken om de SAC-integriteit bij muizenoöcyten meiose uitgebreid te evalueren door verschillende kritieke stappen van het controlepunt te onderzoeken. Eerst wordt de evaluatie van de SAC-respons na het induceren van SAC-activering beschreven. Deze activering wordt bereikt door het genereren van niet-gehechte kinetochoren met behulp van nocodazol, een medicijn dat MT's11 depolymeriseert. Ten tweede wordt een methode om SAC-uitschakeling te monitoren beschreven door de dynamiek van Securin-afbraak tijdens de rijping van eicellen te volgen. Ten slotte wordt een op immunofluorescentie gebaseerde test gebruikt om de rekrutering van MAD2, een van de MCC-componenten, naar kinetochoren te meten. Samen beoordelen deze testen uitgebreid de SAC-integriteit tijdens de meiotische rijping van eicellen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle muizen die in deze protocollen werden gebruikt, werden gehuisvest en grootgebracht volgens de Richtlijnen van de Rutgers University Institutional Animal Use and Care Committee (Protocol 201702497) en National Institutes of Health. Deze regelgevende instanties keurden alle experimentele procedures met dierproeven goed. Alle muizen die in deze studie werden gebruikt, waren 6-8 weken oude CF-1-vrouwtjes.

1. Experimentele voorbereiding

  1. Voordat u met de SAC-evaluaties begint, verzamelt u muizenoöcyten volgens het eerder gepubliceerde rapport12. Verdeel verzamelde eicellen in drie gelijkmatige groepen en bewaar ze in Chatot-, Ziomek- en Bavister (CZB) kweekmedia die 2,5 μM milrinon bevatten (zie Materiaaltabel) om meiotische hervatting te voorkomen13.
    OPMERKING: CZB samenstelling: 81,6 mM NaCL; 4,8 mM KCl; 1,2 mM KH2PO4; 1,2 mM MgSO4-7H 2O; 0,27 mM Pyruvaat; CaCl 2 van 1,7mM; 30,8 mM DL-melkzuur; 7 mM Taurine; 0,1 mM EDTA; 25 mM NaHCO3; Gentamicine; en 0,3% BSA.
  2. Bereid het cRNA voor op micro-injectie zoals eerder beschreven 12,14. Versterk het securin-gen van de muis uit het cDNA gekloond uit kiemende blaasjesoöcyten van muizen, gevolgd door subcloning in de pMDL2-vector met Gfp-sequentie15,16.
    1. Om Securin-Gfp cRNA te bereiden, lineariseer het plasmide met Nde I-spijsvertering. Voer in vitro transcriptie uit met behulp van T3 RNA polymerase en het zuiveren van het cRNA16.
      OPMERKING: Bewaar cRNA in aliquots van 2-3 μL bij -80 °C tot gebruik.

2. Behandeling met nocodazol en live beeldvorming

  1. Bereid 1 ml kweekmedia (CZB) met 5 μM nocodazol (NOC), 1 ml kweekmedia met 5 μM NOC plus 0,5 μM reversine (NOC + REV) en 1 ml kweekmedia met dimethylsulfoxide (DMSO) (1:2000) als controle (zie materiaaltabel).
  2. Gebruik voor de rijping van eicellen en live beeldvorming een plaat met 96 putten die in de incubator is voorverwarmd bij 37 °C, 5% CO2 en 80% vochtigheid. In de eerste put, laad 150 μL van de controle DMSO-behandeling; in de tweede put, laad 150 μL NOC-behandeling; en in de derde put, laad 150 μL NOC + REV-behandeling. Bewaar de plaat in de couveuse onder dezelfde omstandigheden als hierboven totdat het nodig is.
    OPMERKING: Vermijd in de 96-well plaat het gebruik van de eerste rij en de eerste kolom omdat de schaduw van de rand de kwaliteit van de afbeeldingen verstoort.
  3. Om de meiotische rijping te starten, verwijdert u milrinon. Terwijl u de eicellen onder een stereomicroscoop bekijkt met behulp van een vergroting tussen 30x-64x, wast u milrinon uit de media door de eicellen sequentieel over te brengen door zes druppels van 100 μL milrinonvrije kweekmedia die DMSO bevatten en plaatst u ze in de overeenkomstige put van de 96-well plaat met behulp van een hand- of mondbediende pipet.
    1. Tel eicellen door ze op te pakken met een hand- of mondbediende pipet en ze af te leveren bij de volgende druppel om te voorkomen dat ze verloren gaan. De eicellen zijn enkele, grote (~ 80 μm in diameter) en ronde cellen. De kern verschijnt als een knop in het midden van de cel en het membraan en de zona pellucida omringen de eicel.
      OPMERKING: Breng de eicellen over tussen druppels terwijl u zo min mogelijk vloeistof verplaatst. Dit zorgt voor een optimale verwijdering van het milrinon uit de kweekmedia. Als de eicellen de meiose niet hervatten, is het waarschijnlijk dat het milrinon niet effectief is verwijderd.
  4. Herhaal hetzelfde proces (stap 2.3) voor NOC en NOC + REV behandeling.
  5. Breng de eicellen in beeld met behulp van een brightfield-microscoop die is uitgerust met een incubatorkamer met een gecontroleerde omgeving onder deze omstandigheden: 37 °C, 5% CO2 en 80% vochtigheid. Leg beelden vast in het middelste vlak van de eicellen met intervallen van 20 minuten gedurende 24 uur.
  6. Kwantificeer het aantal eicellen dat een polair lichaam (PB) extrudeert door de cellen te identificeren die door asymmetrische cytokinese gaan. Het resultaat is een kleine cel (PB) naast het ei en in de gedeelde zona pellucida. Bekijk de afbeeldingen met behulp van beeldbewerkingssoftware (ImageJ, zie Materiaaltabel).
  7. Importeer de beeldreeks in de beeldanalysesoftware en vervroeg de frames totdat een of meer cellen door asymmetrische cytokinese gaan. Bereken het percentage eicellen dat een PB extrudeert van het totaal van de eicellen17.

3. Monitoring van het patroon van Securin-gfp-afbraak tijdens meiotische rijping

  1. Centrifugeer 3 μL Securin-Gfp cRNA(stap 1.2) bij 19.283 x g gedurende 30 min bij 4 °C18.
    OPMERKING: Gebruik het supernatant om te voorkomen dat onzuiverheden worden geladen die naaldverstopping kunnen veroorzaken tijdens microinjectie.
  2. Volg stap-voor-stap oöcytenmicro-injectie, uitgebreid beschreven in referentie12. Micro-injectie profase I-gearresteerde eicellen met 100 ng/μL Securin-gfp cRNA bereid in stap 1.2.
  3. Laat na micro-injectie de eicellen het RNA in de CO2-incubator gedurende ten minste 3 uur herstellen en vertalen. Controleer de expressie door de eicellen te observeren in een geautomatiseerd meerkanaals fluorescentiebeeldvormingssysteem (zie Materiaaltabel) om het GFP-signaal te bekijken.
  4. Zoals beschreven in stap 2.2, laadt u 150 μL kweekmedia met of zonder 5 μM nocodazol en 150 μL kweekmedia met 0,5 μM reversine in drie verschillende putten van een 96-wellsplaat.
  5. Was de micro geïnjecteerde eicellen door zes druppels milrinonvrije kweekmedia en breng 1/3 van de eicellen over in elke behandeling.
  6. Houd de plaat in de couveuse op 37 °C, met 5% CO2 en 80% vochtigheid totdat de eicellen de meiose hervatten, ongeveer 3 uur na het wassen van milrinon.
    OPMERKING: Gebruik een stereomicroscoop met een vergroting tussen 30x-64x om de afbraak van de nucleaire enveloppe te evalueren als een kenmerk van meiotische hervatting.
  7. Registreer beelden van de rijping van eicellen met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een incubatorkamer zoals beschreven in stap 2.6. Gebruik brightfield-instellingen om de eicellen in de put te vinden. Gebruik een 488-filter om het Securin-gfp-signaal te detecteren en pas de fluorescentie-intensiteit aan om te voorkomen dat de cellen te veel worden blootgesteld.
    1. Als het beeldvormingssysteem geautomatiseerd is, slaat u de posities van de eicellen in elke put op. Omdat Securin-gfp gelijkmatig in het cytoplasma is verdeeld, legt u beelden vast in het middelste vlak van de eicellen met tussenpozen van 20 minuten gedurende 24 uur. Als u groepen eicellen in één foto wilt vastleggen, gebruikt u een lens met een lager vergrotingsobjectief, zoals 10x.
  8. Gebruik beeldanalysesoftware om Securin-gfp-vernietiging te kwantificeren. Open de afbeeldingen van het GFP-kanaal. Begin bij tijdstip 1. Gebruik in de gewenste analysesoftware een selectie- of vormtool om elke eicel te markeren en een interessante regio (ROI) voor elke cel te genereren.
    1. Gebruik dezelfde ROI om een achtergrondgebied te selecteren dat later moet worden afgetrokken. Meet de GFP-pixelintensiteit in elke ROI.
  9. Gebruik de ROI's voor elke eicel die in stap 3.8 is gegenereerd en meet de GFP-intensiteit in alle tijdspunten.
    OPMERKING: In sommige softwareprogramma's kunt u op een tabblad "Analyseren" de functie Meten selecteren.
    1. Ga vervolgens verder met het volgende tijdsbestek en herhaal dit proces om de intensiteit van GFP in elk tijdsbestek te meten. Trek ten slotte bij elke GFP-waarde de meting van de ROI af op de achtergrond die is geselecteerd in stap 3.8. Deze analyse geeft een waarde voor securin-gfp intensiteit voor elke eicel op elk tijdstip.
  10. Extraheer verschillende parameters uit het patroon van Securin-vernietiging: (a) de tijd dat Securin-gfp-afbraak begon. Dit vertelt wanneer SAC-uitschakeling begon; b) de tijd van het securin-gfp-minimumsignaal. Dit vertelt wanneer SAC-demping onder een drempelniveau is gedaald om een hoge APC / C-activering en volledige Securin-GFP-degradatie mogelijk te maken; c) de mate van securin-gfp-vernietiging19. Dit vertelt hoe snel de SAC-activiteit daalt tot onder een drempelniveau voor APC/C-activering en Securin-GFP-degradatie.

4. Rekrutering van MAD2 bij kinetochoren door immunofluorescentie tijdens meiotische rijping

OPMERKING: Voor het verzamelen en rijpen van eicellen, zie het eerder gepubliceerde rapport12.

  1. Splits eicellen in drie groepen. Breng elke groep eicellen over in 100 μL druppels milrinonvrije kweekmedia. Bedek de druppels met minerale olie en plaats ze in de incubator (37 °C, 5% CO2 en 80% vochtigheid) gedurende 3 uur, 5 uur en 7 uur om respectievelijk vroege prometafase I, late prometafase I en metafase I-stadium te bereiken.
    OPMERKING: Plaats elk tijdstip in een ander gerecht om te voorkomen dat u hetzelfde gerecht meerdere keren uit de couveuse haalt, wat de normale timing van meiotische rijping beïnvloedt.
  2. Fixeer de eicellen op de toegewezen tijdstippen door ze over te brengen in 500 μL druppels van 2% PFA in 1x PHEM-buffer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur, met behulp van een 9-well glazen schaal zoals eerder beschreven20. Breng vervolgens de cellen over naar een schone put met een druppel van 500 μL blokkerende oplossing (PBS + 0,3% BSA + 0,01% Tween-20 + 0,02% NaN3).
    OPMERKING: PHEM samenstelling: 60 mM PIPES; 25 mM HEPES; EGTA van 10 mM; en 2 mM MgCl2.
    OPMERKING: Men kan op dit punt stoppen en de eicellen opslaan in een blokkerende oplossing in de 9-well plaat bij 4 °C tot het geschikte moment om immunofluorescentie te voltooien.
  3. Om de MAD2-detectie voort te zetten, brengt u de eicellen over naar een schone put met een druppel van 500 μL permeabilisatieoplossing (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN3). Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en breng de cellen vervolgens over naar een nieuwe bron van blokkerende oplossing en incubeer gedurende 10 minuten.
  4. Gebruik voor de rest van de immunofluorescentiestappen een 96-wells schaaldeksel met inkepingen zoals eerder beschreven20. Gebruik een bevochtigde donkere kamer om blootstelling aan licht en verdamping te voorkomen. Breng de eicellen over in een druppel 30 μL blokkerende oplossing met anti-MAD2-antilichaam (1:1000, konijn) en anti-centromeer antilichaam (ACA) (1:30, humaan) (zie Materiaaltabel) en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Het 96-wells schoteldeksel biedt ruimte voor de verwerking van verschillende eiwitten en groepen tegelijkertijd.
  5. Om overtollige primaire antilichamen te wassen, brengt u de cellen over naar een druppel van 30 μL van 1x PHEM-buffer aangevuld met 0,5% Triton en incubeert u gedurende 10 minuten in de bevochtigde kamer. Herhaal deze stap nog twee keer.
  6. Voer de vierde was uit, breng de cellen over naar een druppel van 30 μL van 1x PHEM-buffer zonder 0,5% 1x Triton en incubeer gedurende 10 minuten.
  7. Breng de cellen over naar een druppel van 30 μL blokkeringsoplossing met secundaire antilichamen zoals anti-human-633 (1:200) en anti-konijn-568 (1:200) (zie Materiaaltabel) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Kies de combinatie van fluoroforen op basis van uw microscooplasers of filters.
  8. Om overtollige secundaire antilichamen te wassen, herhaalt u stap 4.5-4.6.
  9. Om de cellen op de microscoopglaas te monteren, brengt u de cellen over naar een druppel van 10 μL van montagemedia die DAPI (0,1 mg / ml) bevatten (zie Materiaaltabel). Voeg kleine puntjes vaseline toe aan elke hoek van de coverslip, plaats ze voorzichtig op de bovenste druppel van het montagemedium en druk langzaam om te verdelen. Gebruik heldere nagellak om de coverslip af te dichten op de dia. Voor een meer gedetailleerde beschrijving van het montageproces, zie referentie20.
  10. Beeldkinochelen met behulp van een confocale microscoop (zie Materiaaltabel) uitgerust met een 40x of 63x objectief. Bepaal met behulp van het ACA-signaal het z-bereik dat beeldvorming van het hele chromosoomgebied mogelijk maakt.
    OPMERKING: Een optische zoom van 4,0 en een z-stapgrootte van 0,5 μm kunnen op sommige beeldvormingssystemen worden gebruikt. Deze parameters kunnen van systeem tot systeem verschillen en optimalisatie is noodzakelijk.
  11. Analyseer mad2-intensiteit bij kinetochoren met behulp van beeldanalysesoftware. Maak een maximale projectie van de z-stack en splits vervolgens de kanalen.
  12. Maak eerst een masker met behulp van het ACA-kanaal door het ACA-kanaal te selecteren om een drempel vast te stellen die alle kinetochore-signalen identificeert. Ga naar het tabblad Bewerken en maak een selectie. Maak vervolgens een ROI met deze selectie.
  13. Selecteer het MAD2-kanaal en breng de selectie binnen die in stap 4.12 is gemaakt. Selecteer een drempelmethode die zich beter aanpast aan het MAD2-signaal. Meet de intensiteit.
    OPMERKING: Selecteer de drempelmethode in de controlebehandeling en houd deze constant bij het analyseren van verschillende behandelingen.
  14. Om berekeningen van de relatieve pixelintensiteit te maken, deelt u de intensiteit van elke cel door de gemiddelde intensiteit van de WT-eicellen in het experiment.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Evaluatie van sac-responsiviteit door behandeling met nocodazol
Het doel van dit experiment is om SAC-activering en -sterkte te evalueren. Door nocodazol te gebruiken om spindelmicrotubuli te depolymeriseren, worden alle kinetochoren losgemaakt, wat een SAC-gemedieerde celcyclusstilstand zal veroorzaken. In het huidige beeldvormingssysteem extrudeerden met DMSO behandelde controle-eicellen een polair lichaam ongeveer 14 uur na afgifte van milrinon (figuur 1, bovenste pane...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het controlepunt voor de assemblage van de spindel is een kritisch controlemechanisme tijdens de celdeling dat is ontworpen om fouten in de chromosoomsegregatie te voorkomen. Het stelt de cel in staat om voldoende tijd te hebben om onjuiste KT-MT-bijlagen te corrigeren. Meiose in eicellen is een foutgevoelig proces, waarbij het grootste deel van de chromosoommissegregatie optreedt tijdens meiose I, wat leidt tot het genereren van aneuploïde eieren die de belangrijkste oorzaak zijn van vroege miskramen en onvruchtbaarheid...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Financiering voor dit project werd verstrekt door de National Institutes of Health (R35GM136340 naar KS).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA4503
DAPILife TechnologiesD1306
Dimethyl-sulfoxide (DMSO)SigmaD5879
Donkey-anti-rabbit-Alexa-568Life TechnologiesA10042
EVOS FL Auto Imaging SystemLife TechnologiesFluorescentiemicroscoop
EVOS Onstage IncubatorLife TechnologiesIncubator kamer
Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoatedMatTek CorporationP96G-1.5-5-F
goat-anti-human-Alexa-633Life TechnologiesA21091
HEPESSigmaH3537
Human anti-ACAAntibodies Incorporated15-234Verdunning 1/30
ImageJNIH
KClSigmaP5405
KH2PO4SigmaP5655
Leica SP8 uitgerust met een 63×, 1.40 NA olie-immersie objectiefLeica
MgSO4·7H20SigmaM7774
MilrinoneSigmaM4659
Na2HPO4SigmaS2429
NaClSigmaS5886
NaN3SigmaS2002
NocodazoleSigmaM1404
Paraformaldhyde (PFA)SigmaP6148
PIPESSigmaP6757
Rabbit anti- MAD2Biolegend924601Verdunning 1/1000; voorheen Covance #PRB-452C
ReversineCayman Chemical10004412
Triton-XSigma274348
Tween-20SigmaX100
VectashieldVector laboratoriesH-1000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
  2. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).
  3. Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
  4. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).
  5. London, N., Biggins, S. Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).
  6. Kuhn, J., Dumont, S. Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner. Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).
  7. Jones, K. T., Lane, S. I. R. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
  8. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  9. Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).
  10. Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).
  11. Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
  12. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), e2851(2011).
  13. Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).
  14. Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I. Journal of Visualized Experiments. (134), e57442(2018).
  15. Herbert, M., et al. Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1. Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).
  16. Solc, P., et al. Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation. PLoS One. 10 (2), 0116783(2015).
  17. Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B. Aging Cell. 20 (11), 13489(2021).
  18. Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
  19. Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II. Nature Communications. 8 (1), 15346(2017).
  20. Blengini, C. S., Schindler, K. Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation. Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).
  21. Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
  22. Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
  23. Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes. Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).
  24. Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).
  25. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  26. Homer, H. A., et al. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).
  27. Blengini, C. S., et al. Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes. PLOS Genetics. 17 (4), 1009327(2021).
  28. Hagting, A., et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).
  29. Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
  30. Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spindle Assembly CheckpointMouse OocytesChromosome SegregationAneuploidy MechanismsSAC IntegrityLive ImagingImmunofluorescence AnalysisSecurin DegradationMAD2 RecruitmentConfocal Microscopy

Related Articles