Methodenartikel

Modellering van menselijke cerebellaire ontwikkeling in vitro in 2D-structuur

DOI:

10.3791/64462

⸱

16 september 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychiatry, University of Iowa, 2Department of Radiology, University of Iowa, 3Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Iowa Neuroscience Institute, University of Iowa, 5Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol verklaart de generatie van een 2D-monolaag van cerebellaire cellen uit geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het onderzoeken van de vroege stadia van cerebellaire ontwikkeling.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De precieze en tijdige ontwikkeling van het cerebellum is niet alleen cruciaal voor een nauwkeurige motorische coördinatie en balans, maar ook voor cognitie. Bovendien is verstoring van de cerebellaire ontwikkeling betrokken bij veel neurologische ontwikkelingsstoornissen, waaronder autisme, attention deficit-hyperactivity disorder (ADHD) en schizofrenie. Onderzoek naar cerebellaire ontwikkeling bij mensen was voorheen alleen mogelijk door postmortale studies of neuroimaging, maar deze methoden zijn niet voldoende om de moleculaire en cellulaire veranderingen te begrijpen die in vivo optreden tijdens de vroege ontwikkeling, wanneer veel neurologische ontwikkelingsstoornissen ontstaan. De opkomst van technieken om door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) te genereren uit somatische cellen en het vermogen om iPSC's verder te differentiëren in neuronen hebben de weg vrijgemaakt voor in vitro modellering van vroege hersenontwikkeling. De huidige studie biedt vereenvoudigde stappen in de richting van het genereren van cerebellaire cellen voor toepassingen die een 2-dimensionale (2D) monolaagstructuur vereisen. Cerebellaire cellen die vroege ontwikkelingsstadia vertegenwoordigen, worden afgeleid van menselijke iPSC's via de volgende stappen: ten eerste worden embryoïde lichamen gemaakt in 3-dimensionale (3D) cultuur, vervolgens worden ze behandeld met FGF2 en insuline om cerebellaire lotspecificatie te bevorderen, en ten slotte worden ze terminaal gedifferentieerd als een monolaag op poly-l-ornithine (PLO) / laminine-gecoate substraten. Na 35 dagen differentiatie drukken iPSC-afgeleide cerebellaire celculturen cerebellaire markers uit, waaronder ATOH1, PTF1α, PAX6 en KIRREL2, wat suggereert dat dit protocol glutamaterge en GABAerge cerebellaire neuronale voorlopers genereert, evenals Purkinje-celvoorlopers. Bovendien vertonen de gedifferentieerde cellen een duidelijke neuronale morfologie en zijn ze positief voor immunofluorescentiemarkers van neuronale identiteit zoals TUBB3. Deze cellen drukken axonale geleidingsmoleculen uit, waaronder semafoor-4C, plexine-B2 en neuropiline-1, en kunnen dienen als een model voor het onderzoeken van de moleculaire mechanismen van neurietuitgroei en synaptische connectiviteit. Deze methode genereert menselijke cerebellaire neuronen die nuttig zijn voor downstream-toepassingen, waaronder genexpressie, fysiologische en morfologische studies die 2D-monolaagformaten vereisen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het begrijpen van de ontwikkeling van menselijke cerebellen en de kritieke tijdvensters van dit proces is niet alleen belangrijk voor het decoderen van de mogelijke oorzaken van neurologische ontwikkelingsstoornissen, maar ook voor het identificeren van nieuwe doelen voor therapeutische interventie. Het modelleren van de menselijke cerebellaire ontwikkeling in vitro is een uitdaging geweest, maar in de loop van de tijd zijn er veel protocollen ontstaan die menselijke embryonale stamcellen (hESCs) of iPSC's met cerebellaire afstammingsnadommen onderscheiden 1,2,3,4,5,6,7,8 . Verder is het belangrijk om protocollen te ontwikkelen die reproduceerbare resultaten genereren, relatief eenvoudig zijn (om fouten te verminderen) en niet zwaar zijn voor de geldkosten.

De eerste protocollen voor cerebellaire differentiatie werden gegenereerd uit 2D-culturen van vergulde embryoïde lichamen (EV's), waardoor cerebellair lot werd geïnduceerd met verschillende groeifactoren vergelijkbaar met in vivo ontwikkeling, waaronder WNT, BMP's en FFGF's 1,9. Meer recent gepubliceerde protocollen induceerden differentiatie voornamelijk in 3D organoïde cultuur met FGF2 en insuline, gevolgd door FGF19 en SDF1 voor rhombische lipachtige structuren 3,4, of gebruikten een combinatie van FGF2, FGF4 en FGF85. Beide cerebellaire organoïde inductiemethoden resulteerden in vergelijkbare 3D cerebellaire organoïden, aangezien beide protocollen vergelijkbare cerebellaire markerexpressie op identieke tijdstippen rapporteerden. Holmes en Heine breidden hun 3D-protocol5 uit om aan te tonen dat 2D-cerebellaire cellen kunnen worden gegenereerd uit hESCs en iPSC's, die beginnen als 3D-aggregaten. Bovendien toonden Silva et al.7 aan dat cellen die volwassen cerebellaire neuronen in 2D vertegenwoordigen, kunnen worden gegenereerd met een vergelijkbare benadering als Holmes en Heine, waarbij een ander tijdspunt wordt gebruikt om over te schakelen van 3D naar 2D en de tijd van groei en rijping wordt verlengd.

Het huidige protocol induceert het lot van cerebellair in feedervrije iPSC's door vrij zwevende embryoïde lichamen (EVB's) te genereren met behulp van insuline en FGF2 en vervolgens de EB's op PLO / laminine-gecoate gerechten op dag 14 te plaatsen voor 2D-groei en differentiatie. Op dag 35 worden cellen met cerebellaire identiteit verkregen. Het vermogen om de vroege stadia van cerebellaire ontwikkeling samen te vatten, vooral in een 2D-omgeving, stelt onderzoekers in staat om specifieke vragen te beantwoorden die experimenten met een monolaagstructuur vereisen. Dit protocol is ook vatbaar voor verdere wijzigingen zoals microverwerkte oppervlakken, axonale uitgroeitests en celsortering om de gewenste celpopulaties te verrijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderzoek naar menselijke proefpersonen werd goedgekeurd onder het goedkeuringsnummer 201805995 van de University of Iowa Institutional Review Board en het goedkeuringsnummer 2017-02 van de Human Pluripotent Stem Cell Committee van de Universiteit van Iowa. Huidbiopten werden verkregen van de proefpersonen na het verkrijgen van schriftelijke geïnformeerde toestemming. De fibroblasten werden gekweekt in DMEM met 15% foetaal runderserum (FBS) en 1% MEM-niet-essentiële aminozurenoplossing bij 37 °C en 5% CO2. Fibroblasten werden geherprogrammeerd met behulp van een episomale herprogrammeringskit volgens het protocol van de fabrikant (zie Materiaaltabel) met behulp van een nucleofector voor elektroporatie. Alle procedures werden uitgevoerd in een klasse II type A2 biologische veiligheidskast ("kap" in het kort). Alle celkweekmedia waren antibioticavrij; daarom werd elk onderdeel dat in de kap kwam gereinigd met 70% ethanol. Alle celkweekmedia en componenten werden steriel gefilterd of geopend in de kap om hun steriliteit te behouden.

1. Experimentele voorbereiding

  1. Bereid keldermembraanmatrix (BMM) -gecoate platen voor.
    OPMERKING: BMM stolt sneller bij warmere temperaturen. Platen moeten snel worden bereid en onmiddellijk bij 4 °C worden geplaatst voor opslag.
    1. Ontdooi de BMM (zie Materiaaltabel) op ijs, bij 4 °C gedurende ten minste 2 uur of een nacht.
    2. Meng DMEM/F12 en BMM tot een eindconcentratie van 80 μg/ml. Verdeel de BMM-oplossing in weefselkweekschalen (1 ml voor 35 mm en 2 ml voor 60 mm schotels) en incubeer bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur of een nacht voordat de cellen worden platgelegd.
      LET OP: De ongebruikte gerechten kunnen 2 weken bij 4 °C bewaard worden.
  2. Bereid poly-L-ornithine / laminine (PLO / laminine) -gecoate platen.
    1. Bereid 20 μg/ml PLO (zie materiaaltabel) in steriele DPBS+/+ en voeg 1 ml toe aan elk putje van een 6-wellsplaat. Incubeer een nacht bij 37 °C in de incubator.
    2. De volgende dag aspirateer de PLO met een vacuümaspirator en twee keer wassen met DPBS+/+. Aan de lucht drogen in de kap.
      OPMERKING: Luchtgedroogde platen kunnen maximaal 2 weken bij 4 °C worden bewaard, gewikkeld in aluminiumfolie, voor toekomstig gebruik.
    3. Bereid 10 μg/ml laminine (zie materiaaltabel) in DPBS+/+ en voeg 1 ml toe aan elk putje van een 6-wellsplaat. Incubeer ten minste gedurende 3 uur of een nacht bij 37 °C in de broedmachine.
    4. Aspirateer het laminine met een vacuümaspirator en voeg 1 ml medium of steriele DPBS+/+ toe.
      OPMERKING: De lamininecoating mag niet uitdrogen. PBS of een geschikt kweekmedium moet onmiddellijk worden toegevoegd om dit te voorkomen. Gecoate platen kunnen maximaal 2 weken bij 4 °C worden bewaard.
  3. Bereid PSC passaging oplossing.
    OPMERKING: Een osmometer (zie Materiaaltabel) is vereist om PSC-passagingoplossing10 te maken.
    1. Los 11,49 g kaliumchloride (KCl) en 0,147 g natriumcitraatdihydraat (HOC(COONa)(CH2COONa)2*2H2O) op in 400 ml steriel water van celkweekkwaliteit (zie materiaaltabel).
    2. Meet het volume van de oplossing en noteer het als het initiële volume (Vi).
    3. Meet de osmolariteit en pas deze aan op 570 mOsm door steriel celkweekwater toe te voegen met behulp van de formule Vi × Oi = Vf × 570 mOsm.
    4. Filter-steriliseer de oplossing met een filter van 0,20 μm en maak 10 ml aliquots. Bewaar de aliquots bij kamertemperatuur (RT) gedurende maximaal 6 maanden.
  4. Bereid pluripotente stamcel (PSC) medium voor.
    OPMERKING: iPSC's worden onderhouden in een medium dat hittestabiele FGF2 bevat (zie Materiaaltabel), waardoor een weekendvrij voedingsschema wordt geboden. Andere in de handel verkrijgbare PSC-media zijn niet geprobeerd voor dit protocol.
    1. Ontdooi het PSC medium supplement een nacht bij 4 °C.
    2. Voeg 10 ml PSC-mediumsupplement toe aan 500 ml basaal PSC-medium. Maak 25 ml aliquots en bewaar bij −20 °C.
      OPMERKING: Bevroren aliquots kunnen gedurende 6 maanden bij −20 °C worden bewaard. Ontdooide aliquots moeten bij 4 °C worden bewaard en binnen 2 weken worden gebruikt. Cellen kunnen worden ingevroren voor langdurige opslag in een PSC-medium met 10% (v / v) dimethylsulfoxide (DMSO).
  5. Bereid PSC ontdooimedium voor.
    1. Supplement PSC medium met 50 nM chroman, 1,5 μM emricasan, 1x polyamine supplement en 0,7 μM trans-ISRIB (CEPT cocktail11) (zie Materiaaltabel).
    2. Filter-steriliseer met een filter van 0,20 μm en bewaar bij 4 °C gedurende maximaal 4 weken.
  6. Bereid getrokken glazen pipetten voor.
    1. Trek 22,9 cm (9 inch) glazen Pasteur pipetten in twee stukken boven een Bunsen brander, ~ 2 cm onder de nek, waardoor twee pipetten ontstaan, waarbij de dunnere kant ~ 4 cm korter is dan de andere.
    2. Buig met behulp van de vlam de uiteinden van de getrokken kant om een gladde "r" te creëren.
    3. Plaats de getrokken pipetten in autoclaafhulzen en autoclaaf voor sterilisatie.
  7. Bereid cerebellair differentiatiemedium (CDM) voor.
    1. Meng IMDM en Ham's F12 voedingsmix in een verhouding van 1:1. Vul de mix aan met 1x L-alanine-L-glutaminesupplement, 1% (v/v) chemisch gedefinieerd lipidenconcentraat, 0,45 mM 1-thio-glycerol, 15 μL/ml apo-transferrine, 5 mg/ml runderserumalbumine (BSA) en 7 μg/ml insuline (zie Materiaaltabel).
    2. Filter-steriliseer met een filter van 0,20 μm, bewaar bij 4 °C en gebruik binnen 1 maand.
  8. Bereid cerebellair rijpingsmedium (CMM) voor.
    1. Supplement neurobasaal medium met 1x L-alanine-L-glutamine supplement en 1x N-2 supplement (zie Tabel van materialen).
    2. Filter-steriliseer met een filter van 0,20 μm, bewaar bij 4 °C en gebruik binnen 2 weken.

2. Feedervrije iPSC-cultuur

  1. Ontdooi de cellen volgens de onderstaande stappen.
    1. Plaats een BMM-plaat (stap 1.1) in de incubator van 37 °C om gedurende ten minste 1 uur of een nacht te gelen voordat de cellen worden ontdooid.
    2. Voorverwarm 10 ml PSC-dooimedium (stap 1.5) bij 37 °C.
    3. Breng het cryoviaal met cellen van vloeibare stikstof over naar een waterbad bij 37 °C.
      OPMERKING: Om te voorkomen dat een bron van besmetting in de celkweekruimte wordt gegenereerd, wordt het gebruik van een standaard waterbad niet aanbevolen. In plaats daarvan kan zoet water worden verwarmd in een klein bekerglas tot 37 °C om een waterbad voor eenmalig gebruik te genereren.
    4. Wanneer er nog een klein stukje ijs in de buis zit, haal het dan uit het waterbad, droog de buis en spuit met 70% ethanol. Breng de buis over naar de kap en gebruik een serologische pipet van 2 ml of 5 ml (zie materiaaltabel) om de cellen voorzichtig over te brengen naar een conische buis van 15 ml.
    5. Voeg 8 ml PSC-ontdooimedium druppelsgewijs toe aan de cellen terwijl u de conische buis draait. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij RT.
    6. Aspirateer het supernatant zorgvuldig met een vacuümaspirator zonder de celkorrel te verstoren. Resuspendeer de cellen in 2 ml PSC ontdooimedium.
    7. Haal de BMM uit de plaat en voeg de geresuspendeerde cellen druppelsgewijs over de plaat toe voor een gelijkmatige verdeling.
    8. Plaats de plaat in de incubator bij 37 °C, 5% CO2. Ververs het medium de volgende dag met PSC medium. Verander daarna het medium dagelijks.
  2. Onderhoud de cellen volgens de onderstaande stappen.
    1. Verwarm het benodigde volume PSC-medium voor bij 37 °C (bijv. 1 ml medium per plaat van 35 mm).
    2. Onderzoek de platen op gedifferentieerde cellen of kolonies en verwijder de gedifferentieerde cellen met een getrokken glazen pipet (stap 1.6).
      OPMERKING: iPSC-kolonies hebben gladde randen met morfologisch identieke cellen.
    3. Verander het gebruikte medium dagelijks en passeer elke 3-4 dagen of wanneer 70% samenvloeiing is bereikt.
  3. Passeer de cellen.
    1. Plaats de benodigde hoeveelheid BMM-platen in de incubator gedurende ten minste 1 uur of een nacht voordat u passeert. Verwarm de benodigde hoeveelheid PSC-medium (stap 1.3) voor bij 37 °C.
    2. Gebruik een getrokken glazen pipet om gedifferentieerde cellen of kolonies te reinigen.
    3. Aspirateer het gebruikte medium met een vacuümaspirator en voeg PSC-dissociatiemedium toe, 1 ml per schotel van 35 mm. Incubeer bij 37 °C gedurende 1-3 min.
      OPMERKING: Als kolonies opstijgen in de PSC-passagingoplossing voordat psc-medium wordt toegevoegd, kan de incubatietijd worden verkort.
    4. Aspirateer de PSC passaging oplossing en voeg voorverwarmd PSC medium toe.
    5. Gebruik een steriele pipetpunt van 200 μL, kraslijnen parallel aan elkaar in één richting, draai de plaat 90° en maak een tweede set kraslijnen loodrecht op de vorige (waardoor een kruislings uitgebroed patroon over de plaat).
    6. Aspirateer de BMM-oplossing uit de setplaten. Verzamel de kolonies met behulp van een serologische pipet en verdeel ze over nieuwe BMM-platen.
    7. Incubeer bij 37 °C, 5% CO2. Verander het medium dagelijks.
  4. Bevries de cellen.
    1. Bereid cryovialen door de inhoud te labelen en steriliseer onder ultraviolet (UV) licht in de kap (zie Materiaaltabel) gedurende 30 minuten.
    2. Bereid psc-vriesmedium voor door psc-medium aan te vullen met 10% (v/v) DMSO. Volg de stappen 2.3.2-2.3.5.
    3. Breng de cellen over in een conische buis van 15 ml met een serologische pipet van 5 ml en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij RT.
    4. Zuig het medium zorgvuldig aan en resuspendeer de celpellet in PSC-vriesmedium.
    5. Verdeel in cryovialen. Plaats de injectieflacons in een diepvriescontainer en plaats de container in een -80 °C vriezer.
    6. Breng de volgende dag de cryovialen over naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.

3. Cerebellaire differentiatie

OPMERKING: Voordat met de differentiatie wordt begonnen, worden iPSC's doorgegeven aan zes schotels van 35 mm en zijn ze klaar voor de differentiatie wanneer ze op 70% confluentie zijn. Elke 35 mm plaat wordt overgebracht naar een put van de 6-well plaat.

  1. Til op dag 0 de gezonde iPSC-kolonies op voor EB-vorming.
    1. Voeg 1 ml CDM (stap 1.7) aangevuld met 10 μM Y-27632 en 10 μM SB431542 (zie materiaaltabel) toe aan elk putje van een 6-well ultra-low attachment (ULA) plaat en plaats in de incubator totdat de opgetilde kolonies klaar zijn om aan de putten te worden toegevoegd.
    2. Reinig de gedifferentieerde cellen met een getrokken glazen pipet. Aspirateer het medium en voeg 1 ml PSC-passagingoplossing toe voor elke schotel van 35 mm. Incubeer gedurende 3 minuten bij 37 °C, aspirateer en voeg 2 ml CDM toe, aangevuld met 10 μM Y-27632 en 10 μM SB431542.
      OPMERKING: Als kolonies opstijgen in de PSC-passagingoplossing voordat CDM wordt toegevoegd, kan de incubatietijd worden verkort.
    3. Til onder een omgekeerde microscoop met doorgelaten licht de kolonies voorzichtig op met behulp van de gebogen rand van de getrokken glazen pipet met behulp van 4x vergroting. Zodra elke kolonie is opgeheven, brengt u alles voorzichtig over naar één put van de 6-well ULA-plaat met behulp van een serologische pipet van 10 ml. Herhaal dit proces voor elke iPSC-plaat. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2.
      OPMERKING: Als de kolonies te groot zijn of worden samengevoegd, kunnen ze worden gesneden met de punt van de getrokken glazen pipet om kleinere EV's te maken.
  2. Voeg op dag 2 FGF2 toe aan elk putje tot een eindconcentratie van 50 ng/ml.
    OPMERKING: De FGF2 die wordt gebruikt voor cerebellaire differentiatie is niet hittebestendig. Dit protocol is niet getest met hittestabiele FGF2.
  3. Doe op dag 7 een 1/3 gemiddelde verandering. Voor 3 ml totaal medium in een put, met een pipettor van 1.000 μL, zuigt u voorzichtig 1 ml verbruikt medium op en vervangt u dit door 1 ml vers CDM. Incubeer de EB's gedurende 7 dagen.
  4. Op dag 14 aspirateer voorzichtig bijna al het gebruikte medium met behulp van een pipettor van 1.000 μL. Om minimale schade aan de EB's te garanderen, draait u de plaat om alle EB's in het midden van de plaat te verzamelen en kantelt u de plaat en aspirateert u langzaam vanaf de rand.
    1. Naarmate de gemiddelde hoeveelheid afneemt, legt u de plaat langzaam plat en blijft u ademen. Laat voldoende medium over om te voorkomen dat de EB's uitdrogen. Voeg daarna 3 ml verse CDM toe, aangevuld met 10 μM Y-27632. Breng de EB's met een serologische pipet van 10 ml over op een schotel met PLO/lamininecoating (stap 1.2).
      OPMERKING: Afhankelijk van de downstream-toepassing kunnen de EB's worden overgebracht naar een 6-well PLO / laminin-plaat of kunnen enkele EB's worden overgebracht naar een enkele put van een PLO / laminine-gecoate 24-wellsplaat of coverslip.
  5. Op dag 15, aspirateer het medium en vervang het door verse CDM.
    OPMERKING: Het is belangrijk om voldoende medium aan de putten toe te voegen om voldoende medium tussen de voedingen te garanderen, omdat er na verloop van tijd verdamping zal zijn (bijvoorbeeld voor een put in een 6-well plaat, voeg 3 ml medium toe). Als het medium is begonnen te verzuren (helder en geel wordt), ververs het medium dan, zelfs als het niet op het voedingsschema staat tot het einde van het protocol.
  6. Op dag 21 aspirateer je het gebruikte medium en vervang je het door CMM. Vervang op dag 28 het medium met verse CMM. Oogst op dag 35 de cellen voor verdere toepassingen.

4. Monstervoorbereiding voor RNA-isolatie

  1. Adem het medium op en voeg 500 μL celdissociatiereagens (zie materiaaltabel) toe aan elk putje van de 6-wellsplaat. Laat het een paar seconden intrekken en adem op.
  2. Incubeer de plaat, met het deksel erop, op kamertemperatuur gedurende 2 min. Tik op de zijkanten van de plaat om de cellen los te maken.
  3. Voeg 1 ml CMM toe (stap 1.8) en verzamel de cellen in een buis van 1,5 ml.
  4. Pelleteer de cellen door centrifugeren met behulp van een benchtop minicentrifuge (zie Materiaaltabel) gedurende 30 s op RT (max. snelheid 2000 x g), gooi het medium weg en voeg 1 ml 1x PBS pH 7,4 toe om de celpellet te wassen.
  5. Pelleteer de cellen opnieuw met behulp van een benchtop minicentrifuge gedurende 30 s op RT en was nogmaals met PBS.
  6. Pelleteer de cellen en gooi de PBS weg. Lyse de cellen in fenol en guanidine isothiocyanaat bevattend reagens (zie Materiaaltabel).
    OPMERKING: Cellen die in fenol en guanidine-isothiocyanaat met reagens zijn gelyseerd, kunnen maximaal 1 jaar bij −80 °C worden bewaard. Cellen kunnen direct in de schotel worden gelyseerd, afhankelijk van de RNA-isolatiemethode en reagentia die worden gebruikt. Vanwege het lage aantal cellen in een schaal, zal het isoleren van RNA met behulp van silica spinkolommen (zie Tabel van materialen) resulteren in hogere opbrengsten van RNA.

5. Cellen voorbereiden op immunofluorescente kleuring

LET OP: Voor een 24-well plaat is één EB per put voldoende.

  1. Op dag 35, aspirateer het gebruikte medium en was de cellen door 1 ml DPBS +/+ per put toe te voegen (voor één put van een 24-well plaat).
  2. Adem de DPBS+/+ aan en voeg 500 μL koud 4% paraformaldehyde (PFA, zie Materiaaltabel) toe, bereid in DPBS+/+ per putje. Incubeer gedurende 20 minuten bij RT.
  3. Verwijder 4% PFA en was de cellen tweemaal met DPBS+/+, zoals in stap 5.1. Voeg 1 ml DPBS+/+ toe en bewaar de cellen bij 4 °C totdat de kleuring is voltooid.
    OPMERKING: Het wordt geadviseerd om de immunofluorescente kleuring binnen 1 week na fixatie te doen om celloslating en het verlies van antigenen te voorkomen. Afhankelijk van het antilichaam en de cellulaire locatie van het doelwit, kan kleuring echter op latere tijdstippen tot 4 weken na fixatie worden gedaan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Overzicht van de 3D naar 2D cerebellaire differentiatie
Cerebellaire cellen worden gegenereerd vanaf iPSC's. Figuur 1A toont de algehele workflow en de toevoeging van belangrijke componenten voor differentiatie. Op dag 0 worden EB's gemaakt door de iPSC-kolonies voorzichtig op te tillen (figuur 1B) met behulp van een getrokken glazen pipet in CDM met SB431542 en Y-27632 en in ultralage bevestigingsplaten te plaatsen. FGF2 wordt toegevoegd op ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vermogen om de menselijke cerebellaire ontwikkeling in vitro te modelleren is belangrijk voor ziektemodellering en het bevorderen van het begrip van normale hersenontwikkeling. Minder gecompliceerde en kosteneffectieve protocollen creëren meer mogelijkheden voor het genereren van repliceerbare gegevens en brede implementatie in meerdere wetenschappelijke laboratoria. Een cerebellair differentiatieprotocol wordt hier beschreven met behulp van een aangepaste methode voor het genereren van EB's die geen enzymen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken Jenny Gringer Richards voor haar grondige werk bij het valideren van onze controlepersonen, waaruit we de controle-iPSC's hebben gegenereerd. Dit werk werd ondersteund door NIH T32 MH019113 (aan D.A.M. en K.A.K.), de Nellie Ball Trust (aan T.H.W. en A.J.W.), NIH R01 MH111578 (aan V.A.M. en J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (aan A.J.W.), en de Roy J. Carver Charitable Trust (aan V.A.M., J.A.W., en A.J.W.). De figuren zijn gemaakt met BioRender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 mL Serologische pipetFisher Scientific13-678-26D
1-thio-glycerolSigmaM6145
2 mL Serologische pipetFisher Scientific13-678-26B
250 mL Filter Unit, 0,2 µm aPES, 50 mm DiaFisher ScientificFB12566502
35 mm Easy Grip Tissue Cultuur SchaalFalcon353001
4D Nucleofector kern unitLonza276885Nucleofector
5 mL Serologische pipetFisher Scientific13-678-25D
60 mm Easy Grip Tissue Cultuur SchaalFalcon353004
6-well ultra-lage binding platenCorning3471
9" Wegwerp Pasteur PipettenFisher Scientific13-678-20D
Apo-transferrineSigmaT1147
Rund serum albumine (BSA)SigmaA9418
Cell cultuur waterCytivaSH30529.02
Chemisch gedefinieerd lipide concentraatGibco11905031
Chroman 1Cayman34681
Klasse II, Type A2, Biologische veiligheidskastNuAire, Inc.NU-540-600Hood, UV licht
Costar 24-well plaat, TC behandeldCorning3526
Costar 6-well plaat, TC behandeldCorning3516
DAPI oplossingThermo Scientific62248
DMEMGibco11965092
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO (Dimethly sulfaat)SigmaD2438
DPBS+/+Gibco14040133
EmricasanCayman22204
Epi5 episomal iPSC reprogrammeringskitLife TechnologiesA15960
Essential 8-FlexGibcoA2858501PSC medium met hittestabiele FGF2
EVOS XL Core Imaging systeemLife TechnologiesAMEX1000
Fetal bovien serum - Premium SelectAtlanta BiologicalsS11150
FGF2Peprotech100-18B
GlutaMAX supplementGibco35050061L-alanine-L-glutamine supplement
Ham's F12 Nutrient MixGibco11765054
HERAcell VIOS 160i CO2 incubatorThermo Scientific50144906
Human Anti-EN2, muisSanta Cruz Biotechnologysc-293311
Human anti-Ki67/MKI67, konijnR&D SystemsMAB7617
Human anti-PTF1a, konijnNovus BiologicalsNBP2-98726
Human anti-TUBB3, muisBiolegend801213
IMDMGibco12440053
InsulinGibco12585
Laminine Muis ProteïneGibco23017015
Matrigel MatrixCorning354234Basal membraan matrix
MEM-NEAAGibco11140050
Mini CentrifugeLabnet InternationalC1310Benchtop mini centrifuge
Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg)New England BioLabsT2040Silica spin columns
Monarch Total RNA Miniprep KitNew England BioLabsT2010Silica spin columns
N-2 supplementGibco17502-048
Neurobasal mediumGibco21103049
PBS, pH 7,4Gibco10010023
PFA 16%Electron Microscopy Sciences15710
Polyamine supplementSigmaP8483
Poly-L-Ornithine (PLO)Sigma3655
Kalium chlorideSigma746436
SB431542Sigma54317
Zelfsluitende doorzichtige zakjesSterikingSS-T2 (90x250)Autoclaaf zakjes
Natrium citraat dihydraatFisher ScientificS279-500
Spuitfilters, steriele, PES 0,22 µm, 30 mm DiaResearch Products International256131
Trans-ISRIBCayman16258
TRIzol ReagensInvitrogen15596018Fenol en guanidine isothiocyanaat
TrypLE Express Enzyme (1x)Gibco12604039Cel dissociatie reagens
Vapor druk osmolalometerWescor, Inc.Model 5520Osmolalometer
Y-27632Biogems1293823

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1H.5 (2012).
  2. Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).
  3. Muguruma, K. 3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer. Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).
  4. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  5. Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888(2017).
  6. Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).
  7. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70(2020).
  8. Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids. Scientific Reports. 11, 12959(2021).
  9. Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).
  10. Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells. PLoS One. 9 (1), 88012(2014).
  11. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).
  13. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).
  14. Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).
  15. Mizuhara, E., et al. Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin. Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).
  16. Ferreira, A., Caceres, A. Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture. Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).
  17. Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).
  18. Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development. Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).
  19. Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).
  20. Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).
  21. Aldinger, K. A., et al. Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development. Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).
  22. Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development. Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).
  23. Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
  24. Aijaz, S., et al. Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18. Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).
  25. Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain. Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).
  26. Andreasen, N. C., Pierson, R. The role of the cerebellum in schizophrenia. Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).
  27. Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept. Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).
  28. Jacobsen, L. K., et al. Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia. American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).
  29. Saywell, V., Cioni, J. -M., Ango, F. Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation. The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).
  30. Kim, D., Ackerman, S. L. The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons. Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).
  31. Maier, V., et al. Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development. Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).
  32. Telley, L., et al. Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum. Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).
  33. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Scientific Reports. 5, 9232(2015).
  34. Shabanipour, S., et al. Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (152), e60168(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Menselijke iPSCs2D monolaagcultuurembryo de lichaampjescerebellaire differentiatieneurale progenitorcellenPurkinje celprogenitorenimmunofluorescentiemarkersaxonale leidingsmoleculenneuro ontwikkelingsstoornissen

Gerelateerde artikelen