Methodenartikel

Kwantificering van circulaire RNA's met behulp van digitale druppel-PCR

4.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64464

⸱

16 september 2022

 ,  , 
1Institute of Life Sciences, 2School of Biotechnology, KIIT University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de gedetailleerde methode van digitale druppel PCR (dd-PCR) voor nauwkeurige kwantificering van circulaire RNA (circRNA) niveaus in cellen met behulp van divergente primers.

Samenvatting

Digitale druppelpolymerasekettingreactie (dd-PCR) is een van de meest gevoelige kwantificeringsmethoden; het fractioneert de reactie in bijna 20.000 water-in-oliedruppels en de PCR komt voor in de individuele druppels. De dd-PCR heeft verschillende voordelen ten opzichte van conventionele real-time qPCR, waaronder verhoogde nauwkeurigheid bij het detecteren van doelen met een lage abundantie, het weglaten van referentiegenen voor kwantificering, het elimineren van technische replicaties voor monsters en het tonen van een hoge veerkracht tegen remmers in de monsters. Onlangs is dd-PCR een van de meest populaire methoden geworden voor het nauwkeurig kwantificeren van doel-DNA of RNA voor genexpressieanalyse en diagnostiek. Circulaire RNA's (circRNA's) zijn een grote familie van recent ontdekte covalent gesloten RNA-moleculen zonder 5' en 3' uiteinden. Het is aangetoond dat ze genexpressie reguleren door te fungeren als sponzen voor RNA-bindende eiwitten en microRNA's. Bovendien worden circRNA's uitgescheiden in lichaamsvloeistoffen en hun weerstand tegen exonucleasen zorgt ervoor dat ze dienen als biomarkers voor ziektediagnose. Dit artikel is bedoeld om te laten zien hoe divergent primerontwerp, RNA-extractie, cDNA-synthese en dd-PCR-analyse kunnen worden uitgevoerd om specifieke circulaire RNA (circRNA) niveaus in cellen nauwkeurig te kwantificeren. Tot slot demonstreren we de precieze kwantificering van circRNA's met behulp van dd-PCR.

Inleiding

Recente ontwikkelingen in RNA-sequencingtechnologieën en nieuwe computationele algoritmen hebben een nieuw lid ontdekt van de groeiende familie van niet-coderende RNA's, genaamd circulair RNA (circRNA)1. Zoals de naam al doet vermoeden, zijn circRNA's een familie van enkelstrengs RNA-moleculen zonder vrije uiteinden. Ze worden gevormd door niet-canonieke head-to-tail splicing genaamd back-splicing, waarbij de upstream splice acceptor site covalent aansluit op de downstream splice donor site om een stabiele RNA cirkel 1,2 te vormen. Dit proces kan worden gemedieerd door verschillende factoren, waaronder omgekeerde Alu-repetitieve elementen die aanwezig zijn in de upstream en downstream van gecirculeerde exonen, of kan worden gemedieerd door sommige splicingfactoren of RNA-bindende eiwitten (RBPs)2,3. Circulaire RNA's die uitsluitend uit de exonische of intronische sequentie worden gegenereerd, worden geclassificeerd als exonische circRNA en circulaire intronische RNA's of ci-RNA's, terwijl sommige exonische circRNA's het intron behouden en exon-intron circRNA's (EIcircRNA's) worden genoemd(EIcircRNA's)3,4. De functies van circRNA's zijn veelzijdig, waaronder het sponzen van miRNA en/of RBP, het reguleren van transcriptie en het reguleren van de cellulaire functie door te vertalen in peptiden 3,5,6,7. Verschillende rapporten hebben het belang van circRNA's in verschillende ziekten en fysiologische processen benadrukt8. Bovendien maken weefselspecifieke expressiepatronen en resistentie tegen exonucleasevertering het een functionele biomarker voor ziektediagnose en kan het ook worden gebruikt als een geschikt therapeutisch doelwit8. Gezien het belang ervan bij het reguleren van gezondheid en ziekten, is de nauwkeurige kwantificering van circRNA-expressie de behoefte van het uur.

Er zijn verschillende biochemische methoden ontwikkeld om cirkelRNA's in biologische monsters te kwantificeren9. Een van de handigste en meest geaccepteerde methoden voor circRNA-kwantificering is reverse transcriptie gevolgd door kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) met behulp van divergente primerparen10. De meerderheid van de circRNA's is echter in lage abundantie in vergelijking met lineaire mRNA's, waardoor het een uitdaging is om ze te kwantificeren11. Om dit probleem op te lossen, hebben we geprobeerd om digitale druppel-PCR (dd-PCR) te gebruiken om het aantal cirkel-RNA's in een bepaald monster nauwkeurig te kwantificeren. De dd-PCR is een geavanceerde PCR-technologie die het microfluïdica-principe volgt; het genereert meerdere waterige druppels in olie en de PCR komt in elke druppel voor als een individuele reactie12. De reactie treedt op in individuele druppels en wordt geanalyseerd met behulp van een druppellezer, die het aantal positieve of negatieve druppels voor het gen van belang geeft12. Het is de meest gevoelige techniek om een gen van belang nauwkeurig te kwantificeren, zelfs als er slechts één kopie in een bepaald monster is. Verminderde gevoeligheid voor remmers, betere precisie en het weglaten van het referentiegen voor kwantificering maken het voordeliger dan conventionele qPCR 13,14,15. Het is op grote schaal gebruikt als een onderzoeks- en diagnostisch hulpmiddel voor de absolute kwantificering van een gen van belang16,17. Hier beschrijven we het gedetailleerde dd-PCR-protocol voor circRNA-kwantificering bij het differentiëren van muis C2C12-myotubes en prolifererende muis C2C12-myoblasten met behulp van divergente primers.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

RNA is gevoelig voor RN's; daarom moeten alle reagentia, instrumenten en werkruimten RNase-vrij zijn en met zorg worden behandeld.

1. Divergent primerontwerp voor circRNA (zie figuur 1)

  1. Haal de volwassen sequentie op uit circRNA-annotatiegegevens met BEDTools of uit de UCSC-genoombrowser door de exon/intron-sequentie samen te voegen die aanwezig is tussen de backsplice-junctiecoördinaten18,19.
  2. Bereid een PCR-sjabloonsequentie voor van 200 nucleotiden in lengte door de laatste 100 nucleotiden van de totale circRNA-sequentielengte samen te voegen met de eerste 100 nucleotiden van de circRNA-sequentie10.
    OPMERKING: Als de circRNA-lengte minder dan 200 nucleotiden is, verdeel het dan in twee gelijke helften en voeg de nucleotiden van de laatste helft tot het begin van de eerste helft samen.
  3. Gebruik de bovenstaande sjabloonreeks voor primerontwerp met behulp van de Primer3-webtool en stel een PCR-productlengte in, variërend van 120-180 nucleotiden in lengte20.
  4. Gebruik de standaardinstellingen van Primer3 voor andere parameters zoals Tm en primerlengte. De primersequenties voor circBnc2 zijn opgenomen in tabel 1.
  5. Bestel de divergente primersequenties voor synthese bij elk oligosynthesebedrijf.

2. RNA-isolatie

OPMERKING: Isoleer totaal RNA uit de C2C12-cellen van de muis met behulp van in de handel verkrijgbare kits of interne RNA-isolatiemethode. De interne RNA-isolatiemethode die hier wordt gebruikt, is eerder beschreven21. De magnetische silicakorrels worden in het lab bereid met behulp van het eerder gepubliceerde protocol22. Deze magnetische kralen kunnen ook worden verkregen bij verschillende leveranciers.

  1. Neem een schaal van 10 cm met ongeveer 5 x 106 prolifererende C2C12 myoblastcellen en één 4-daagse gedifferentieerde C2C12 myotube voor RNA-isolatie.
  2. Was de cellen drie keer met 10 ml 1x PBS en gooi de PBS weg met een pipet.
  3. Schraap de cellen in 1 ml 1x PBS met behulp van een celschraper, centrifugeer ze bij 4 °C gedurende 5 minuten bij 750 x g en gooi de PBS weg met een pipet.
  4. Voeg 1 ml RNA-isolatiereagens (RIR) toe en laat de cellen lyseren door krachtig te pipetteren21.
  5. Voeg 200 μL (1/5 van het volume RIR) chloroform en vortex toe gedurende 15 s. Centrifugeer de buis bij 4 °C gedurende 10 minuten bij 12.000 x g.
  6. Neem 400 μL van de bovenste waterige laag, laad deze op een silicakolom en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 12.000 x g bij kamertemperatuur. Neem de doorstroom naar een nieuwe buis en voeg 600 μL 100% ethanol toe.
  7. Voeg 20 μL magnetische silicaparels toe en plaats de buis op een thermomixer die gedurende 5 minuten is ingesteld op 25 °C en 1.200 tpm.
    OPMERKING: Het kraalvolume kan worden verhoogd of verlaagd, afhankelijk van de initiële celnummers die voor lysis worden genomen. Magnetische silica kralen kunnen worden verkregen van commerciële leveranciers.
  8. Plaats de buis op een magnetische standaard gedurende 30 s of totdat de oplossing helder wordt. Gooi het supernatant voorzichtig weg met een pipet.
  9. Resuspendeer de magnetische silicakorrels in een wasbuffer van 500 μL met 90% ethanol. Plaats de buis gedurende 30 s op de magnetische standaard. Draai de buis twee keer op de magnetische standaard om de kralen te wassen. Laat de kralen naar de magneet zakken en gooi de buffer weg met een pipet.
  10. Herhaal stap 2.9 tweemaal. Draai na het wassen de buis kort rond en plaats deze gedurende 30 s terug op de magnetische standaard. Gooi de resterende wasbuffer weg. Droog de buis aan de lucht bij 50 °C gedurende 3 minuten op een thermomixer en houd het deksel open.
  11. Voeg 20 μL nucleasevrij water toe en resuspendeer de kralen.
    OPMERKING: Het RNA-elutievolume kan worden verlaagd tot 10 μL om de RNA-concentratie op te schalen.
  12. Plaats de buizen gedurende 2-3 minuten op kamertemperatuur. Plaats de buis terug op de magnetische standaard en laat hem 30 s zitten. Verzamel het opgeloste RNA in een nieuwe buis voor kwantiteits- en kwaliteitsbeoordeling met behulp van een spectrofotometer.
    OPMERKING: RNA kan worden bewaard bij −20 °C of −80 °C voor langdurige opslag. Om een optimaal resultaat te krijgen, wordt aanbevolen om de volgende dag door te gaan met de cDNA-synthesestap.

3. cDNA-synthese

  1. Meet de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer en neem 1 μg RNA voor cDNA-synthese.
  2. Meng 1 μg totaal RNA met 1 μL dNTP-mix (10 mM elk van dATP, dTTP, dGTP en dCTP), 4 μL 5x reverse transcriptase (RT) buffer, 2 μL 10x RT willekeurige primer, 0,25 μL reverse transcriptase-enzym (200 U/μL) en 0,5 μL RNase-remmer (40 U/μL) en vul het volume aan tot 20 μL met nucleasevrij water.
    OPMERKING: Het reverse transcriptase-enzymvolume kan worden gewijzigd afhankelijk van de initiële RNA-concentratie die wordt genomen voor cDNA-synthese.
  3. Tik op de buis om de reactie te mengen en draai kort. Plaats de buis gedurende 10 minuten op 25 °C, gevolgd door 1 uur op 50 °C.
  4. Om het enzym te inactiveren, plaatst u de buis gedurende 5 minuten op 85 °C.
  5. Koel de buis gedurende 2 minuten af en voeg 480 μL nucleasevrij water toe aan de buis om de cDNA-concentratie op 2 ng / μL te brengen.
    OPMERKING: cDNA kan worden bewaard bij -20 °C of onmiddellijk worden gebruikt voor dd-PCR-analyse.

4. Digitale druppel PCR (dd-PCR) workflow

OPMERKING: De workflow van dd-PCR omvat meerdere stappen, te beginnen met de monstervoorbereiding, gevolgd door druppelgeneratie, PCR-versterking, druppeltellingen en gegevensanalyse. Elke stap is cruciaal voor nauwkeurige gegevensgeneratie, omdat dd-PCR de absolute kwantificering van producten omvat en geen standaardcurve nodig heeft. Daarom is elk van de verschillende stappen van dd-PCR hieronder beschreven.

  1. Voorbereiding van de dd-PCR-reactie.
    1. Stel de PCR-reactie van 22 μL in 0,2 ml PCR-buizen of -strips in, samen met een negatieve controlebuis en NTC-buizen (niet-sjabloonbesturing).
      OPMERKING: Elk verschillend divergent primerpaar voor de detectie van verschillende cirkel-RNA's moet een NTC-reactie hebben samen met testmonsters.
    2. Voeg 11 μL dd-PCR master-mix (bijv. EvaGreen Supermix) en 11 μL nucleasevrij water toe om de negatieve controlebuis in te stellen.
      OPMERKING: Ontdooi de dd-PCR master-mix bij kamertemperatuur gevolgd door een korte vortex om een homogeen mengsel te maken. Gebruik hetzelfde nucleasevrije water om de negatieve controlereactiebuis en NTC-buizen in te stellen die werden gebruikt voor het verdunnen van het cDNA.
    3. Voeg 11 μL dd-PCR master-mix, 5,5 μL circRNA-specifieke voor- en achterwaartse primermix van 1 μM-concentratie en 5,5 μL nucleasevrij water toe om de NTC-reactiebuizen op te zetten.
      OPMERKING: Verdun de voorwaartse en omgekeerde cirkelvormige RNA-specifieke divergente primers van 100 μM-voorraad en meng om een werkconcentratie van 1 μM van voorwaartse en omgekeerde circRNA-primermix te bereiden; de uiteindelijke primerconcentratie is dus 250 nM in de reactie van 22 μL.
    4. Voeg 11 μL dd-PCR master-mix, 5,5 μL circRNA-specifieke voorwaartse en omgekeerde primermix van 1 μM-concentratie en 5,5 μL cDNA (2 ng/μL) toe om de reageerbuizen in te stellen.
    5. Vortex grondig gevolgd door het kort centrifugeren van alle reactiebuizen om een homogeen reactiemengsel aan de onderkant van de buizen te krijgen.
  2. Druppelgeneratie.
    1. Breng de 20 μL PCR-mengsel van 0,2 ml PCR-buizen over naar de monsterputten van de druppelgeneratorcartridge.
    2. Voeg voorzichtig 70 μL druppelgeneratieolie toe aan de oliebronnen van de druppelgeneratorcartridge met behulp van een meerkanaals pipet.
      OPMERKING: Incubeer de druppelgeneratieolie bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten voor gebruik.
    3. Bedek de druppelgeneratorcartridge met de rubberen pakking en plaats deze in de druppelgeneratormachine om het monster-oliedruppelmengsel te krijgen, gegenereerd in de druppelputten van de cartridge.
  3. PCR-versterking.
    1. Breng 40 μL van het monster-olieduppletmengsel over van de druppelputten van de druppelgeneratorcartridge naar een 96-well PCR-plaat met behulp van een meerkanaals pipet.
      OPMERKING: Breng het monster-oliedruppelmengsel voorzichtig over terwijl u een hoek maakt met de putten door de uiteinden van de meerkanaals pipet om te voorkomen dat de druppels breken terwijl u ze overbrengt naar de dd-PCR 96-putplaat.
    2. Sluit de 96-well PCR-plaat af met de aluminiumfoliesealer, plaats deze in het machineblok voorverwarmd op 80 °C en klik op seal voor het afdichten van de PCR-plaat.
    3. Plaats nu de plaat in de dd-PCR thermische cycler en stel het programma in zoals vermeld in tabel 2 met de dekseltemperatuur ingesteld op 105 °C en een hellingsnelheid van 2 °C/s.
  4. Druppels tellen.
    1. Zodra PCR voorbij is, plaatst u de plaat op de dd-PCR druppeltellermachine met de plaathouder in de juiste positie voor het tellen van de druppels.
    2. Open de druppelanalysesoftware en stel de run in door invoer te geven voor de voorbeeldinformatie.
    3. Klik op de installatieoptie. Klik vervolgens op de sjabloonoptie om een nieuwe sjabloon te openen.
    4. Definieer elke put door de details van het experiment, zoals monsternaam (cDNA gebruikt of negatieve controle of NTC), doelnaam (circRNA-primernaam) en type (onbekend) en experimenttype als ABS (absolute kwantificering) en Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) te gebruiken, enz.
    5. Sla ten slotte de sjabloon op en start de run door op de run-optie te klikken en telling per rij of kolom te selecteren. Laat de machine de druppeltelling voltooien, wat ongeveer 1 minuut / put duurt.
    6. Klik op de knop Analyseren om de gegevens te analyseren na het voltooien van de druppellezing.
    7. Klik op de knop 1D Amplitude om de positieve en negatieve druppels te zien
    8. Om de positieve druppels van de negatieve druppels te scheiden, plaatst u een gemeenschappelijke drempellijn voor alle monsters met hetzelfde doel.
      OPMERKING: De totale druppels in elk monster moeten hoger zijn dan 10.000 om in aanmerking te komen voor absolute kwantificering. De NTC mag geen positieve druppeltellingen vertonen. De aanwezigheid van positieve druppels in de NTC duidt op besmetting van de reagentia of versterking van de primerdimeer. Het is moeilijk om erachter te komen of de positieve druppels primer dimeren of niet-specifieke producten in NTC hebben. Het wordt aanbevolen om de primers te controleren en verontreiniging van de reagentia te vermijden als algemene praktijk voor elke PCR, inclusief dd-PCR.
    9. Klik op de knop Exporteren om de gegevens van het circRNA-telt te exporteren als een .csv bestand. De geëxporteerde gegevens tonen het aantal cirkel-RNA's dat in elk monster aanwezig is.
    10. Bereken handmatig het aantal circRNA's in elk monster per nanogram RNA door rekening te houden met de totale hoeveelheid cDNA die in elke reactie wordt gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het absolute aantal cirkel-RNA's in elk monster kan worden afgeleid uit de geëxporteerde dd-PCR-gegevens. Real-time kwantitatieve PCR-analyse suggereerde differentiële expressie van circBnc2 in de gedifferentieerde C2C12-myotubes (gegevens niet getoond). Hier wilden we het absolute kopienummer van circBnc2 controleren in prolifererende C2C12-myoblasten en myotubes. Omdat de expressie van circBnc2 in twee omstandigheden wordt vergeleken, is het erg belangrijk om alle monsters voor RNA-isolatie, ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

CircRNA-onderzoek is het afgelopen decennium gegroeid met de ontdekking van high-throughput sequencing-technologieën. Als gevolg hiervan is het beschouwd als een potentieel molecuul voor toekomstige RNA-therapeutica. Bovendien is bekend dat het fungeert als een biomarker bij verschillende ziekten, waaronder kanker en hart- en vaatziekten 4,8. De identificatie van circRNA is echter lastig vanwege de lage abundantie en het heeft slechts één specifieke backsplice ju...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door intramurale financiering van het Institute of Life Sciences, de DBT-onderzoeksbeurs (BT / PR27622 / MED / 30/1961/2018) en de Wellcome Trust / DBT India Alliance Fellowship [IA / I / 18/2/ 504017] toegekend aan Amaresh C. Panda. We bedanken andere lableden voor het proeflezen van het artikel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 ml microcentrifuge tubeTarson500010
0.2 ml tube strips with capTarson610020, 510073
Filter TipsTarson528104
DNase/RNase-Vrij Gedistilleerd WaterThermo Fisher Scientific10977023
Fosfaat-gebufferd zout (PBS)SigmaP4417
Cell scrapperHiMediaTCP223
ChloroformSRL96764
DNA-diluentHiMediaMB228
Random primersThermo Fisher Scientific48190011
dNTP-setThermo Fisher ScientificR0181
Murine RNase-remmerNEBM0314S
Maxima reverse transcriptaseThermo Fisher ScientificEP0743
QX200 dd-PCR Evagreen SupermixBio-Rad1864033
Droplet generatie olie voor EvagreenBio-Rad1864006
PCR Plate Heat Seal, folie, doorprikpuntBio-Rad1814040
DG8 Cartridges en GasketsBio-Rad1864007
DG8 Cartridge houderBio-Rad1863051
QX200 Droplet GeneratorBio-Rad1864002
ddPCR 96-Well PlatesBio-Rad12001925
PX1 PCR Plate SealerBio-Rad1814000
C1000 Touch Thermal Cycler met 96–Deep Well Reaction ModuleBio-Rad1851197
QX200 Droplet ReaderBio-Rad1864003
Quantasoft SoftwareBio-Rad1864011
Silica kolomUmbrella Life Science38220090
UCSC Genome Browserhttps://genome.ucsc.edu/
Primer 3https://primer3.ut.ee/

Referenties

  1. Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PLoS One. 7 (2), 30733(2012).
  2. Chen, L. L., Yang, L. Regulation of circRNA biogenesis. RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).
  3. Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
  4. Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).
  5. Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. Circular RNA translation, a path to hidden proteome. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685(2022).
  6. Panda, A. C. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. Circular RNAs: Biogenesis and Functions. Xiao, J. , Springer. Singapore. 67-79 (2018).
  7. Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. Emerging role of circular RNA-protein interactions. Non-Coding RNA. 7 (3), 48(2021).
  8. Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers. Cell Death & Disease. 12 (5), 468(2021).
  9. Pandey, P. R., et al. Methods for analysis of circular RNAs. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566(2020).
  10. Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, Humana. New York, NY. 103-114 (2022).
  11. Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
  12. Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
  13. Hayden, R. T., et al. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).
  14. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409(2017).
  15. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  16. Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review. Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712(2021).
  17. Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
  18. Lee, B. T., et al. The UCSC genome browser database: 2022 update. Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).
  19. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  20. Untergasser, A., et al. Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115(2012).
  21. Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads. bioRxiv. , (2020).
  22. Oberacker, P., et al. Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation. Bio-protocol. 9 (20), 3394(2019).
  23. Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples. Plant Methods. 10 (1), 42(2014).
  24. Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations. Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

RNA kwantificatieddPCR analyseontwerp van divergente primersRNA extractiecDNA synthesemoleculaire diagnostiekgenexpressiedruppelgeneratie

Gerelateerde artikelen