Method Article

Ontwikkeling en evaluatie van een rattenmodel van kraakbeendefecten van volledige dikte

DOI:

10.3791/64475

⸱

May 19th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The First Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 2Fuyang Orthopaedics and Traumatology Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 3College of Pharmaceutical Science, Zhejiang Chinese Medical University, 4Affiliated Zhejiang Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 5Xianju County Hospital of Chinese Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol stelt een full-thickness cartilage defects (FTCD) model vast door gaten te boren in de femorale trochleaire groef van ratten en het daaropvolgende pijngedrag en histopathologische veranderingen te meten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kraakbeendefecten van het kniegewricht veroorzaakt door trauma zijn een veel voorkomende sportgewrichtsblessure in de kliniek, en deze defecten resulteren in gewrichtspijn, verminderde beweging en uiteindelijk knieartrose (kOA). Er is echter weinig effectieve behandeling voor kraakbeendefecten of zelfs kOA. Diermodellen zijn belangrijk voor het ontwikkelen van therapeutische geneesmiddelen, maar de bestaande modellen voor kraakbeendefecten zijn onbevredigend. Dit werk stelde een full-thickness cartilage defects (FTCD) model vast door gaten te boren in de femorale trochleaire groef van ratten, en het daaropvolgende pijngedrag en histopathologische veranderingen werden gebruikt als uitleesexperimenten. Na de operatie werd de mechanische ontwenningsdrempel verlaagd, chondrocyten op de gewonde plaats gingen verloren, de matrixmetalloproteinase MMP13-expressie was verhoogd en de collageenexpressie van type II nam af, in overeenstemming met de pathologische veranderingen die werden waargenomen in menselijke kraakbeendefecten. Deze methodologie is eenvoudig en eenvoudig uit te voeren en maakt grove observatie onmiddellijk na het letsel mogelijk. Bovendien kan dit model met succes klinische kraakbeendefecten nabootsen, waardoor het een platform biedt voor het bestuderen van het pathologische proces van kraakbeendefecten en het ontwikkelen van overeenkomstige therapeutische geneesmiddelen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gewrichtskraakbeen is een sterk gedifferentieerd en dicht weefsel bestaande uit chondrocyten en extracellulaire matrix1. De oppervlaktelaag van gewrichtskraakbeen is een vorm van hyalien kraakbeen, met een glad oppervlak, lage wrijving, goede sterkte en elasticiteit en een uitstekende mechanische spanningstolerantie2. De extracellulaire matrix bestaat uit collageen proteoglycaan en water, en type II collageen is de belangrijkste structurele component van het collageen, omdat het goed is voor ongeveer 90% van het totale collageen3. Omdat er geen bloedvaten of zenuwen in kraakbeenweefsel aanwezig zijn, mist het het vermogen om zichzelf te herstellen na een verwonding4. Daarom zijn kraakbeendefecten veroorzaakt door trauma altijd een hardnekkige gewrichtsaandoening geweest in klinieken; Bovendien heeft deze gewrichtsziekte de neiging om jonge mensen te treffen, en de wereldwijde incidentie neemt toe 5,6. Het kniegewricht is de meest voorkomende plaats van kraakbeendefecten en defecten gaan hier gepaard met gewrichtspijn, gewrichtsdisfunctie en gewrichtskraakbeendegeneratie, wat uiteindelijk leidt tot knieartrose (kOA)7. Kraakbeendefecten van het kniegewricht brengen economische en fysiologische belastingen met zich mee voor patiënten en tasten de kwaliteit van leven van de patiënt ernstig aan8. Deze ziekte vormt een grote en urgente klinische uitdaging zonder op handen zijnde oplossingen. Momenteel is chirurgie de steunpilaar van de behandeling van kraakbeendefecten, maar het resultaat op lange termijn blijft onbevredigend9.

Klinische kraakbeendefecten leiden uiteindelijk tot kOA en daarom worden kOA-diermodellen vaak gebruikt voor de pathologische studie van kraakbeendefecten en medicijnontwikkeling. Het opstellen van diermodellen is belangrijk voor het begrijpen van het pathofysiologische proces van kraakbeendefectherstel, dat kan worden gebruikt om de kraakbeenregeneratie en de verandering tussen fibrokraakbeen en hyalien kraakbeen te observeren10. Veelgebruikte kOA-diermodellen, zoals chirurgische modellen van voorste kruisbandtranssectie (ACLT), destabilisatie van de mediale meniscus (DMM), ovariëctomie (OVX) en Hulth, hebben echter meestal langetermijnmodellering nodig en maken alleen pathologische en pijnevaluaties mogelijk, wat beperkingen oplegt aan de efficiëntie van de ontwikkeling van geneesmiddelen11. Naast de chirurgische modellen resulteren chemische modellen, zoals monoiodoacetaat (MIA) en papaïne-injectie, ook in kraakbeendefecten, maar de mate van het defect kan niet goed worden beheerd en de omstandigheden zijn ver verwijderd van de klinische realiteit11. Botsing is een andere benadering om kraakbeendefecten bij grotere dieren te modelleren, maar deze methode is afhankelijk van het gebruik van specifieke instrumenten en wordt zelden toegepast12.

Kortom, de bestaande kOA-modellen zijn niet ideaal voor het bestuderen van de pathogenese van kraakbeendefecten of het ontwikkelen van nieuwe geneesmiddelen, en een specifiek en gestandaardiseerd model voor kraakbeendefecten is nodig. Deze studie stelde een full-thickness cartilage defects (FTCD) model vast door gaten te boren in de femorale trochleaire groef bij ratten. Grove observatie, pijngedragstests en histopathologische analyse werden uitgevoerd voor modelevaluatie. In tegenstelling tot andere diermodellen van kOA heeft dit model weinig effect op de algemene toestand van de ratten. Deze modelleringsbenadering is toegankelijk, kan goed worden beheerd en ondersteunt het begrip van progressie van kraakbeendefecten naar kOA en de ontwikkeling van effectieve therapieën. Dit model kan ook worden gebruikt voor het testen van therapieën die kOA voorkomen door defecten in pre-artrosegewrichten te genezen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De dierproeven werden goedgekeurd door de Medische Normen en Ethische Commissie van de Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, die voldoet aan de Chinese wetgeving inzake het gebruik en de verzorging van proefdieren. In de huidige studie werden 6 weken oude mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten met een gewicht van 150-180 g gebruikt. De dieren werden verkregen uit een commerciële bron (zie de Tabel van Materialen).

1. Vaststelling van een model met kraakbeendefecten van volledige dikte bij ratten

  1. Na 1 week acclimatisatie aan de nieuwe omgeving, willekeurig en gelijkelijk verdelen de ratten in twee groepen (n = 8 ratten / groep). De ratten in de schijngroep zullen de schijnoperatie ondergaan, terwijl de ratten in de modelgroep de experimentele operatie zullen ondergaan waarbij gaten in de femorale trochleaire groef worden geboord.
    OPMERKING: Elke kooi moet worden bedekt met steriele maïskolfvullingen (zie de tabel met materialen) om de tenen van de ratten te beschermen.
  2. Verdoof de ratten door een intraperitoneale injectie (i.p.) van pentobarbitalnatrium (40 mg/kg). Druk vervolgens zachtjes op de tenen van de ratten om adequate anesthesie te bevestigen. Gebruik een dierenartszalf op de ogen van de ratten om uitdroging te voorkomen terwijl u onder narcose bent.
    OPMERKING: De dierchirurgie moet worden uitgevoerd in een speciale operatiekamer met behulp van chirurgische instrumenten met autoclaaf. De operators moeten schone laboratoriumjassen, gezichtsmaskers, hoofdbedekkingen en steriele handschoenen dragen tijdens de operatie. Plaats steriele pads over het operatiegebied en steriliseer alle apparatuur voor gebruik. Zorg voor thermische ondersteuning tijdens de hele procedure.
  3. Plaats de rat op de operatietafel in rugligging, scheer de linker- en rechterachterpoten en reinig het kniegewricht met chirurgische zeep, gevolgd door afwisselend antiseptische povidon-jodiumoplossing en alcohol driemaal onder steriele omstandigheden. Plaats een steriel gordijn over de rat en stel alleen het gedesinfecteerde kniegewricht bloot.
  4. Maak een incisie van 1 cm met een scalpelblad (nummer 11) in het midden van het kniegewricht van de rat van boven naar beneden en snijd het gewrichtskapsel en de quadriceps femorispees langs de mediale rand van de patella na de oppervlakkige dissectie.
    OPMERKING: De quadriceps femoris pees is bevestigd aan de patella en aan de femorale condylus tijdens de flexie van het kniegewricht13. De groef in het gewrichtskapsel is de femorale trochleaire groef en de distale femorale condylus vormt de mediale en laterale condylen.
  5. Draai de patella naar buiten en buig het scheenbeen en het kuitbeen in een hoek van 90° om de trochlea van de femorale condylus volledig bloot te leggen. Gebruik een cirkelvormige boor met een diameter van 1,6 mm (zie de materiaaltabel) verticaal op het kraakbeenoppervlak bij 4.000 tpm gedurende 10 s om één kraakbeendefect van volledige dikte in de femorale trochleaire groef met een diepte van 0,1 mm te maken.
    OPMERKING: Gebruik zoutoplossing met tussenpozen om thermisch trauma aan het omliggende botweefsel tijdens de boorprocedure te minimaliseren.
  6. Veeg de operatieplaats af met wattenbollen gedrenkt in een zoutoplossing van 0,9%, vervang de patella, houd de knie in een extensiepositie en hecht de incisie laag voor laag met niet-absorbeerbare 4-0 hechtingen (zie Tabel met materialen).
    1. Plaats de dieren op verwarmingskussens met sternale lighouding, controleer ze totdat ze wakker worden en breng ze vervolgens terug naar hun kooien. Injecteer buprenorfine (0,05 mg/kg) driemaal na de operatie om de 8 uur subcutaan voor pijnverlichting.
  7. Test het pijngerelateerde gedrag van alle ratten op 3 dagen, 10 dagen en 17 dagen na de operatie, zoals beschreven in rubriek 2.

2. Mechanische ophouddrempel (MWT)

OPMERKING: De MWT van de bilaterale achterste plantaar van ratten werd gemeten met de klassieke von Frey filamentpijnmeetmethode14.

  1. Plaats de rat in een enkele plastic kamer (17 cm x 11 cm x 13 cm) op een gaasplatform (zie de materiaaltabel) en plaats de gaasbasis 50 cm boven een tafel. Meet de MWT na 30 minuten aanpassing.
  2. Druk het von Frey-filament (zie de tabel met materialen) loodrecht op het plantaire oppervlak van de achterpoot van elke rat en buig de borstel ongeveer 2 s, waarbij het dikste deel van het midden van de achterpoot wordt vermeden.
  3. Verhoog geleidelijk het stimulusgewicht van de laagste 4 g totdat een positieve reactie (pootterugtrekking of pootlikken) optreedt.
    OPMERKING: Het interval tussen elke stimulatie moet meer dan 1 minuut zijn. De MWT wordt gedefinieerd als drie positieve reacties in vijf stimulaties; Noteer het stimulusgewicht in grammen.
  4. Bereken de gemiddelde waarden voor de sham- en modelgroepen op basis van het geregistreerde minimale stimulusgewicht in grammen.

3. Histopathologische en immunohistochemische analyse

  1. Verdoof de ratten 17 en 56 dagen na de operatie met een 40 mg/kg pentobarbitalnatrium (i.p.) en offer alle ratten op door bloed uit het hart te halen. Isoleer de knieën door het bot in het midden- en middenscheenbeen te snijden en ontleed het omliggende spierweefsel. Verwijder de kniegewrichten voor histologische analyse.
  2. Bevestig de kniegewrichten gedurende 48 uur bij kamertemperatuur in 20 ml 10% paraformaldehyde-oplossing en ontkalk ze vervolgens met 20 ml 10% EDTA-oplossing in een orbitale shaker gedurende 8 weken bij 4 °C. Verander de EDTA-oplossing elke dag.
  3. Trim het kniegewricht zodat het past bij de grootte van de insluitdoos. Integreer de uitgedroogde kniegewrichten in 100% paraffine15.
  4. Plaats de in paraffine ingebedde kniegewrichten op de houder van een microtoom, pas de hoek aan en snijd het paraffinemonster bij met een mes totdat het oppervlak vlak is.
  5. Stel de dikte van de paraffineplakken in op 3 μm en druk de plakjes plat in een waterbad bij 40 °C.
  6. Plak de plakjes op glasplaten, leg ze in een bakmachine van 45 °C (zie de materiaaltabel) tot ze droog zijn en bewaar ze bij kamertemperatuur.
  7. Dewaxen en rehydratie: Dewax de plakjes in een oven op 60 °C gedurende 4 uur en plaats de plakjes vervolgens achtereenvolgens in 100% xyleen (drie keer), 100% ethanol (twee keer), 95% ethanol, 80% ethanol en 75% ethanol gedurende 5 minuten elke keer.
  8. Hematoxyline en eosine (H &E) kleuring
    1. Dewax, rehydrateer en was de plakjes met dubbel gedestilleerd water gedurende 2 minuten.
    2. Bevlek de plakjes met 0,5% hematoxyline (zie materiaaltabel) gedurende 3 minuten en was de plakjes met dubbel gedestilleerd water totdat er geen hematoxylineresidu op de plakoppervlakken zit.
    3. Dompel de plakjes gedurende 3 s onder in 1% zoutzuuralcohol en was de plakjes gedurende 2 minuten met dubbel gedestilleerd water.
    4. Week de plakjes 10 s in 1% ammoniakwater en was de plakjes 2 minuten met dubbel gedestilleerd water.
    5. Bevlek de plakjes met eosine (zie materiaaltabel) gedurende 1 minuut en was de plakjes met dubbel gedestilleerd water totdat er geen eosineresidu op de plakjes zit.
    6. Dompel de plakjes telkens 1 minuut onder in 95% ethanol, 100% ethanol en 100% xyleen (drie keer).
    7. Voeg een druppel neutrale hars (zie Tabel met materialen) toe aan elk plakje en sluit het af met een dekslip.
  9. Safranin O/Fast Freen (SO) kleuring
    1. Dewax, rehydrateer en was de plakjes met dubbel gedestilleerd water gedurende 2 minuten.
    2. Bevlek de plakjes met 0,05% Fast Green (zie de Materiaaltabel) gedurende 3 minuten en was de plakjes met dubbel gedestilleerd water totdat er geen Fast Green-residu op het oppervlak van de plakjes zit.
    3. Dompel de plakjes gedurende 10 s onder in 1% azijnzuuroplossing en was de plakjes gedurende 2 minuten met dubbel gedestilleerd water.
    4. Bevlek de plakjes met 2,5% SO (zie materiaaltabel) gedurende 2 minuten en was de plakjes vervolgens met dubbel gedestilleerd water totdat er geen SO-residu op de snijoppervlakken zit.
    5. Dompel de plakjes telkens 1 minuut onder in 95% ethanol, 100% ethanol en 100% xyleen (drie keer).
    6. Voeg een druppel neutrale hars toe aan elk plakje en sluit het af met een dekslip.
  10. Toluidine blauw (TB) kleuring
    1. Dewax, rehydrateer en was de plakjes met dubbel gedestilleerd water gedurende 2 minuten.
    2. Dompel de plakjes gedurende 2 minuten onder in een 1% TB-oplossing (zie de materiaaltabel) en was de plakjes met dubbel gedestilleerd water totdat er geen toluïdineblauw residu op het oppervlak van de plakjes zit.
    3. Dompel de plakjes telkens 1 minuut onder in 95% ethanol, 100% ethanol en 100% xyleen (drie keer).
    4. Voeg een druppel neutrale hars toe aan elk plakje en sluit het af met een dekslip.
  11. Masson kleuring
    1. Dewax, rehydrateer en was de plakjes met dubbel gedestilleerd water gedurende 2 minuten.
    2. Voeg Bouin-oplossing (zie de Materiaaltabel) druppelsgewijs toe aan de plakjes, kleur ze gedurende 2 uur op 37 °C en was ze met dubbel gedestilleerd water totdat de gele kleur op het oppervlak van de plakjes verdwijnt.
    3. Bevlek de plakjes met celestietblauw (zie de materiaaltabel) gedurende 3 minuten en was de plakjes met dubbel gedestilleerd water totdat er geen celestietblauwe resten op de plakjes zitten.
    4. Bevlek de plakjes met hematoxyline gedurende 3 minuten en was de plakjes met dubbel gedestilleerd water totdat er geen hematoxylineresidu op de plakoppervlakken zit.
    5. Dompel de plakjes 5 s onder in zure ethanol en was de plakjes gedurende 2 minuten met dubbel gedestilleerd water.
    6. Bevlek de plakjes met Ponceau fuchsin (zie de Tabel met materialen) gedurende 10 minuten en was de plakjes met dubbel gedestilleerd water totdat er geen Ponceau fuchsin-residu op de plakjes zit.
    7. Dompel de plakjes gedurende 10 minuten onder in fosfemomedisch zuur (zie de tabel met materialen), dompel ze vervolgens gedurende 5 minuten onder in tbc-oplossing en was de plakjes met dubbel gedestilleerd water totdat er geen tbc-residu op het oppervlak van de plakjes zit.
    8. Dompel de plakjes gedurende 2 minuten onder in een zwakzure oplossing en was de plakjes gedurende 2 minuten met dubbel gedestilleerd water.
    9. Dompel de plakjes onder in 95% ethanol, 100% ethanol en 100% xyleen (drie keer) achtereenvolgens gedurende 1 minuut per keer.
    10. Voeg een druppel neutrale hars toe aan elk plakje en sluit het af met een dekslip.
  12. Observeer alle plakjes onder een microscoop in een dubbelblinde omgeving om de mate van gewrichtskraakbeendegeneratie te bepalen volgens het scoresysteem van Mankin16.
  13. Immunohistochemie
    1. Dewax en rehydrateer de plakjes routinematig en was de plakjes met PBS gedurende 2 minuten.
    2. Dompel de plakjes onder in natriumcitraatoplossing en plaats de plakjes gedurende 4 uur in een oven op 60 °C om het antigeen te herstellen. Was de plakjes met PBS drie keer gedurende 3 minuten elk.
    3. Dompel de plakjes gedurende 10 minuten onder in een 0,3% Triton X-100-oplossing en was de plakjes twee keer met PBS gedurende telkens 3 minuten.
    4. Blokkeer de endogene peroxidase-activiteit door gedurende 30 minuten een 3% H 2 O2-oplossingin methanol bij kamertemperatuur toe te voegen. Was de plakjes twee keer met PBS gedurende telkens 3 minuten.
    5. Incubeer de secties met 5% geitenserum in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om eventuele niet-specifieke binding te blokkeren. Was de plakjes twee keer met PBS gedurende telkens 3 minuten.
    6. Voeg 100 μL PBS-verdunde primaire antilichamen (anti-col1, 1:50; anti-col3, 1:50; anti-col2, 1:100; en anti-MMP13, 1:100; zie de tabel met materialen) toe aan elke plak en incubeer ze een nacht bij 4 °C. Was de plakjes twee keer met PBS gedurende telkens 3 minuten.
    7. Incubeer elke plak met 100 μL PBS-verdund (1:100) secundair antilichaam (geitenantikonijn of geitenantimuis, zie de materiaaltabel) bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Was de plakjes twee keer met PBS gedurende telkens 3 minuten.
    8. Voeg 100 μL 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB, zie de tabel met materialen) werkoplossing toe aan elke plak.
    9. Observeer en registreer de verschijningstijd van een bruine kleur onder een microscoop; De chromogene reactie maakt de epitoopplaatsen bruin17. Behandel de rest van de monsters met dezelfde geregistreerde reactietijd.
    10. Nadat de plakjes bruin zijn geworden, was je de plakjes twee keer met dubbel gedestilleerd water gedurende telkens 3 minuten.
    11. Bevlek de plakjes opnieuw met hematoxyline gedurende 1 minuut en was de plakjes gedurende 2 minuten met dubbel gedestilleerd water.
    12. Dompel de plakjes 3 s onder in zoutzuur en was de plakjes gedurende 2 minuten met dubbel gedestilleerd water.
    13. Week de plakjes 10 s in 1% ammoniakwater en was de plakjes 2 minuten met dubbel gedestilleerd water.
    14. Dompel de plakjes telkens 1 minuut onder in 95% ethanol, 100% ethanol en 100% xyleen (drie keer).
    15. Voeg een druppel neutrale hars toe aan elk plakje en sluit het af met een dekslip.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit werk werd een rattenmodel van FTCD vastgesteld door gaten in de femorale trochleaire groef te boren en het daaropvolgende pijngedrag en histopathologische veranderingen te detecteren. Zoals te zien is in figuur 1, was 3 dagen na modellering, vergeleken met de schijngroep, de MWT van ratten in de modelgroep significant verminderd, wat wijst op hyperalgesie veroorzaakt door de FTCD. 17 dagen na het modelleren bleef de mechanische ontwenningsdrempel van de ratten in de modelgroep op een ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie beschrijft een diermodel voor het nabootsen van klinische kraakbeendefecten door gaten te boren in de femorale trochleaire groef van ratten (aanvullende figuur 1). Na kraakbeenletsel wordt de prikkelbaarheid of responsiviteit van perifere nociceptoren verbeterd, wat kan resulteren in een verlaging van de pijngrens en de verbetering van de responsiviteit op stimulatie18. In preklinische studies heeft het modelleren van kraakbeendefecten bij verschillend...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door de Zhejiang Natural Science Foundation (subsidienummer LQ20H270009), de Natural Science Foundation of China (subsidienummers 82074464 en 82104890), de Zhejiang Traditional Chinese Medical Science Foundation (subsidienummers 2020ZA039, 2020ZA096 en 2022ZB137) en het Medical Health Science and Technology Project van Zhejiang Provincial Health Commission (subsidienummer 2016KYA196).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3, 3 '-diaminobenzidine  Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.ZLI-9019De kleurstof voor IHC-kleuring
Anti-Collagen III-antilichaamNovusNB600-594Primair antilichaam voor IHC
Anti-Collagen II-antilichaamAbcam (UK)34712Primair antilichaam voor IHC
Anti-Collagen I-antilichaamNovusNB600-408Primair antilichaam voor IHC
Bouin-oplossingShanghai Yuanye Technology Co., Ltd.R20381De kleurstof voor Masson-kleuring
Celestine blauwShanghai Yuanye Technology Co., Ltd.R20381De kleurstof voor Masson-kleuring
Kurkdoppen  Xiaohe Technology Co., Ltd Bedding voor dieren 
EosineSigma-Aldrich861006De kleurstof voor HE-kleuring
Fast Green FCFSigma-AldrichF7252De kleurstof voor SO-kleuring
Geiten anti-muis antilichaamZSGQ-BIO (Beijing, China)PV-9002Secundair antilichaam voor IHC
Geiten anti-konijn antilichaamZSGQ-BIO (Beijing, China)PV-9001Secundair antilichaam voor IHC
HematoxylineSigma-AldrichH3163De kleurstof voor HE-kleuring
MassonShanghai Yuanye Technology Co., Ltd.R20381De kleurstof voor Masson-kleuring
MicroboorRwd Life Science Co., Ltd78001Apparatuur voor chirurgie
MMP13Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)69926Primair antilichaam voor IHC
Modulaire weefselinbeddingscentrumThermo Fisher Scientific (USA)EC 350Paraffineblokjes produceren
Neutrale harsHangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.ZLI-9555Verzegeld voor IHC
Niet-opneembaar hechtmateriaalHangzhou Huawei Medical Supplies Co.,Ltd.4-0Apparatuur voor chirurgie
Pentobarbital natrium Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.WBBTN5GVerdoofd dier
fosfomolybdinezuur Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.R20381De kleurstof voor Masson-kleuring
Ponceau fuchsineShanghai Yuanye Technology Co., Ltd.R20381De kleurstof voor Masson-kleuring
Roterende en schuifmicrotomenThermo Fisher Scientific (USA)HM325Precieze paraffinedelen
Safranine-OSigma-AldrichS2255De kleurstof voor SO-kleuring
ScalpelbladShanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd.11Apparatuur voor chirurgie
Natriumcitraat-oplossing (20x)Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd.HK1222Antigeenretrieval voor IHC
Sprague Dawley (SD) ratten Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd.SDExperimenteel dier
Tissue-Tek VIP 5 JrSakura (Japan)Vacuum Infiltratie Processor
Toluidine BlauwSigma-Aldrich89640De kleurstof voor TB-kleuring
Von Frey filamentUGO Basile (Italië) 37450-275Apparatuur voor MWT-test
Gaasplatform Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd.Apparatuur voor MWT-test

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, Z. Chondrons and the pericellular matrix of chondrocytes. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 21 (3), 267-277 (2015).
  2. Correa, D., Lietman, S. A. Articular cartilage repair: Current needs, methods and research directions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 62, 67-77 (2017).
  3. Kuo, S. M., Wang, Y. J., Weng, C. L., Lu, H. E., Chang, S. J. Influence of alginate on type II collagen fibrillogenesis. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 16 (6), 525-531 (2005).
  4. Li, M., et al. The immune microenvironment in cartilage injury and repair. Acta Biomaterialia. 140, 23-42 (2022).
  5. Epanomeritakis, I. E., Lee, E., Lu, V., Khan, W. The use of autologous chondrocyte and mesenchymal stem cell implants for the treatment of focal chondral defects in human knee joints-A systematic review and meta-analysis. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 4065(2022).
  6. Jiang, Y. H., et al. Cross-linking methods of type I collagen-based scaffolds for cartilage tissue engineering. American Journal of Translational Research. 14 (2), 1146-1159 (2022).
  7. Southworth, T. M., Naveen, N. B., Nwachukwu, B. U., Cole, B. J., Frank, R. M. Orthobiologics for focal articular cartilage defects. Clinics in Sports Medicine. 38 (1), 109-122 (2019).
  8. Chen, Z., et al. Kindlin-2 promotes chondrogenesis and ameliorates IL-1beta-induced inflammation in chondrocytes cocultured with BMSCs in the direct contact coculture system. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 3156245(2022).
  9. Richter, D. L., Schenck, R. C., Wascher, D. C., Treme, G. Knee articular cartilage repair and restoration techniques: A review of the literature. Sports Health. 8 (2), 153-160 (2016).
  10. Tessaro, I., et al. Animal models for cartilage repair. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 32 (6), 105-116 (2018).
  11. Kim, J. E., Song, D. H., Kim, S. H., Jung, Y., Kim, S. J. Development and characterization of various osteoarthritis models for tissue engineering. PLoS One. 13 (3), e0194288(2018).
  12. Mrosek, E. H., et al. Subchondral bone trauma causes cartilage matrix degeneration: An immunohistochemical analysis in a canine model. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (2), 171-178 (2006).
  13. Ralphs, J. R., Benjamin, M., Thornett, A. Cell and matrix biology of the suprapatella in the rat: A structural and immunocytochemical study of fibrocartilage in a tendon subject to compression. Anatomical Record. 231 (2), 167-177 (1991).
  14. Jin, Y., et al. A somatosensory cortex input to the caudal dorsolateral striatum controls comorbid anxiety in persistent pain. Pain. 161 (2), 416-428 (2020).
  15. Zhanmu, O., Yang, X., Gong, H., Li, X. Paraffin-embedding for large volume bio-tissue. Scientific Reports. 10 (1), 12639(2020).
  16. Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 53 (3), 523-537 (1971).
  17. Levey, A. I., et al. A light and electron microscopic procedure for sequential double antigen localization using diaminobenzidine and benzidine dihydrochloride. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (11), 1449-1457 (1986).
  18. Pace, M. C., et al. Neurobiology of pain. Journal of Cellular Physiology. 209 (1), 8-12 (2006).
  19. Zhang, X., et al. Magnetic nanocarriers as a therapeutic drug delivery strategy for promoting pain-related motor functions in a rat model of cartilage transplantation. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 32 (4), 37(2021).
  20. Siebold, R., Suezer, F., Schmitt, B., Trattnig, S., Essig, M. Good clinical and MRI outcome after arthroscopic autologous chondrocyte implantation for cartilage repair in the knee. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 26 (3), 831-839 (2018).
  21. Katagiri, H., Mendes, L. F., Luyten, F. P. Definition of a critical size osteochondral knee defect and its negative effect on the surrounding articular cartilage in the rat. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (9), 1531-1540 (2017).
  22. Farnham, M. S., Larson, R. E., Burris, D. L., Price, C. Effects of mechanical injury on the tribological rehydration and lubrication of articular cartilage. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 101, 103422(2020).
  23. Wu, L., et al. Lysophosphatidic acid mediates fibrosis in injured joints by regulating collagen type I biosynthesis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (2), 308-318 (2015).
  24. Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. Animal models for cartilage regeneration and repair. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).
  25. Murphy, M. P., et al. Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells. Natural Medicines. 26 (10), 1583-1592 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cartilage DefectsFull Thickness CartilageRat ModelKnee Joint InjuryFemoral CondylePain BehaviorHistopathological StainingChondrocyte LossType II CollagenMatrix Metalloproteinase MMP13

Related Articles