Erytrocytenbezinkingssnelheid: een door fysica aangedreven karakterisering in een medische context

Samenvatting

Erytrocytenbezinkingssnelheid (ESR) is een fysieke parameter, vaak gebruikt bij routinematige gezondheidscontroles en medische diagnose. Een theoretisch model dat het mogelijk maakt om fysisch zinvolle parameters uit de hele sedimentatiecurve te extraheren, gebaseerd op moderne colloïdale kennis, is onlangs ontwikkeld. Hier presenteren we een protocol om de ESR in de loop van de tijd automatisch te verzamelen en de parameters van dit recente model uit deze geautomatiseerde gegevensverzameling te halen. Deze verfijnde parameters zullen waarschijnlijk ook de medische getuigenis verbeteren.

Samenvatting

Erytrocyt (of rode bloedcel) sedimentatiesnelheid (ESR) is een fysiek afgeleide parameter van bloed die vaak wordt gebruikt bij routinematige gezondheidscontroles en medische diagnose. In het geval van ontsteking wordt bijvoorbeeld een hogere ESR waargenomen als gevolg van de bijbehorende toename van fibrinogeen en andere plasma-eiwitten. Er werd aangenomen dat deze toename te wijten was aan de vorming van grotere aggregaten van rode bloedcellen (RBC's) veroorzaakt door de toename van fibrinogeen. Inderdaad, fibrinogeen is een agent-bevorderende aggregatie van RBC's en in het Stokes-regime - verondersteld te worden waargenomen in bloed-grotere aggregaten sediment sneller. Alle modellen van ESR-metingen op basis van deze hypothese vereisen echter verdere specifieke fysische aannames, die in geen enkel ander systeem vereist zijn. Bovendien hebben moderne studies op het gebied van colloïdale suspensies aangetoond dat aantrekkelijke deeltjes percolerende aggregaten vormen (d.w.z. aggregaten zo breed als de container). De sedimentatie van deze colloïden volgt dan op een zogenaamde "colloïdale gel collapse". Onlangs is aangetoond dat RBC's eigenlijk hetzelfde gedrag volgen. Deze hypothese maakt het ook mogelijk om de sedimentatiecurve van RBC's efficiënt en analytisch te modelleren, waaruit robuuste en fysisch betekenisvolle descriptoren kunnen worden geëxtraheerd. Dit manuscript beschrijft hoe een dergelijke analyse moet worden uitgevoerd en bespreekt de voordelen van deze aanpak.

Inleiding

De erytrocytenbezinkingssnelheid (ESR) is een medisch in vitro klinisch hulpmiddel, formeel geïntroduceerd in evidenced-based medicine in de twintigste eeuw 1,2,3,4. Het wordt momenteel wereldwijd gebruikt als een niet-specifieke ontstekingstest, of om de evolutie van sommige specifieke aandoeningen te volgen 5,6,7,8. Dit komt voornamelijk door een toename van de fibrinogeenconcentratie, maar ook in andere plasmacomponenten zoals IgM 1,9,10,11. Volgens het huidige Westergren-standaardprotocol worden ESR-waarden gerapporteerd als de meting van de celvrije plasmalaag op een bepaald tijdstip (30 min of 1 h) na het verlaten van een verticale buis van een typische grootte van 20 cm verticaal in rust¹². Deze meetmethode is echter bekritiseerd omdat kwalitatief verschillende stadia in het sedimentatieproces zijn gemeld, waaronder een vertraging voordat de maximale bezinkingssnelheid¹³ is bereikt. Deze vertraging duurt meer dan 1 uur bij ongeveer de helft van de gezonde monsters¹⁴. De snelheid tijdens deze fase gehoorzaamt aan een andere schaalvergroting dan tijdens de tweede, snellere fase van de sedimentatie¹⁵. Door de uitlezing te beperken tot de gemiddelde bezinkingssnelheid gedurende het eerste uur, wordt vervolgens een verschillende mix van verschillende bloedeigenschappen tussen verschillende individuen vergeleken.

Bovendien is onlangs aangetoond dat de gebruikelijke theoretische overwegingen achter dit protocol onjuist waren^16,17,18. Bij fysiologische hematocriet (boven ongeveer 25%) sedimenteren rode bloedcellen (RBC's) niet als afzonderlijke aggregaten, maar eerder als een continu, zogenaamd doorsijpelend, netwerk van RBC's 17,18, gehoorzamend aan een andere set fysische vergelijkingen dan de gewoonlijk genoemde Stokes-sedimentatie ^16,17. Het is aangetoond dat het overwegen van een fysische beschrijving op basis van de tijd-opgeloste metingen van de sedimentatie (hele curve) robuuster was in sommige nieuwe medische contexten^19,20. Bovendien kunnen deze metingen worden gebruikt om licht te werpen op de fysieke mechanismen die de ESR veranderen in pathologieën waarin celvormen worden veranderd^19,20. Bovendien kan een langzame ESR een nuttige medische interpretatie hebben, zoals aangegeven in de metingen van een cohort van patiënten met neuroacanthocytosesyndroom^19,20. Dit artikel bespreekt hoe de meting van fysiek betekenisvolle parameters praktisch kan worden geïmplementeerd, op basis van de hele ESR-kinetiek. Nauwkeuriger gezegd, de hier gepresenteerde methode extraheert de maximale sedimentatiesnelheid U_m, waarvan de waarde kan worden gecorrigeerd om rekening te houden met het effect van de hematocriet van de donor^16,17. Deze parameter is nauwkeuriger en dus betrouwbaarder dan de traditionele meting^16,17,19,20.

Bovendien is het in sommige fundamentele onderzoeken, in plaats van de ontstekingstoestand van een bepaalde patiënt te monitoren, interessant om het effect van hematocriet op de ESR 21,22,23 uit te sluiten, of om de rol van RBC's in een gemodificeerde ESR 19,20,24,25 te onderzoeken tussen verschillende donoren. Het kan nuttig zijn om monsters te vergelijken die niet direct volbloedmonsters van patiënten zijn. Daarom kan het resuspendiëren van RBC's met een gecontroleerde hematocriet in het autologe plasma of in een plasmasubstituent worden gebruikt als de eerste stap van ESR-meting. Oplossingen van Dextran 70 kDa met een concentratie van 55 mg/ml in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) produceren bijvoorbeeld een sedimentatiebereik binnen het controlebereik voor gezonde cellen¹⁹. Dit manuscript laat ook zien hoe dergelijke stappen moeten worden uitgevoerd en dat de gepresenteerde analyse ook in deze gevallen relevant is.

Protocol

Bloedafname en experimenten werden goedgekeurd door de "Ärztekammer des Saarlandes", ethiek votum 51/18, en uitgevoerd na geïnformeerde toestemming was verkregen volgens de Verklaring van Helsinki. Standaardmetingen moeten worden uitgevoerd met ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)-antistollingsbloed (standaard EDTA-concentratie van 1,6 mg/ml bloed, Europese norm NF EN ISO 6710), in Westergren-buizen. Het volume dat nodig is om de Westergren-buis te vullen, is afhankelijk van de fabrikant (omdat lagere delen soms een breder reservoir bevatten); Het volume moet ongeveer 1 ml volbloed zijn en 800 μl voor de buizen die in de materiaaltabel zijn aangegeven. De hieronder beschreven methode is echter geldig, ongeacht de specifieke suspensie en de vorm van de container, zolang de hematocriet van de onderzochte monsters hoger is dan 25%¹⁶. Volumes, recipiënten, suspensiemedium en additieven moeten daarom worden geselecteerd op basis van de specifieke doelstellingen van het uitgevoerde onderzoek.

1. Experimenten en metingen

OPMERKING: Noteer elke minuut de sedimentatiesnelheid van het monster.

1. Monstervoorbereiding (indien nodig): Als een controlehematocriet of suspensievloeistof nodig is, begin dan met het wassen van de cellen en het voorbereiden van de monsters (als voorbeeld laten we zien hoe monsters met verschillende fibrinogeenniveaus kunnen worden bereid, door autoloog serum en plasma te mengen). Serum kan inderdaad worden benaderd als fibrinogeenvrij plasma^26,27 en kan worden gebruikt om de aggregatie van RBC's te verminderen^, in anders fysiologische omstandigheden. Om verschillende monsters te bereiden, verzamelt u het bloed in standaard EDTA-buizen van 9 ml en het serum in standaard serumbuizen (met silicakorrels als stollingsactivatoren) van 9 ml.
   1. Centrifugeer de bloedmonsters (d.w.z. 9 ml standaard EDTA en serumbuizen in het gekozen voorbeeld) op 3.000 x g gedurende ten minste 7 minuten, voor een optimale verdichting van de verpakte erytrocyten. Vervang het supernatant door PBS of de gewenste suspensievloeistof, als er voldoende hoeveelheid beschikbaar is. Als het alleen nodig is om de hematocriet in autoloog plasma te regelen, ga dan direct verder met stap 1.1.3. Anders voorzichtig mengen na opname van het supernatant voor het wassen.
   2. Herhaal dit drie keer. Voer de laatste wasbeurt in ieder geval uit met de gewenste suspensievloeistof.
      1. Bereid in het gekozen voorbeeld mengsels van autoloog plasma en serum met bepaalde verhoudingen (bijv. 25%/75%, 50%/50% of 75%/25% plasma-serumvolumefractie). Voeg bijvoorbeeld bij het bereiden van 2,5 ml van het 25% / 75% plasma-serummengsel 0,625 ml plasma toe aan 1,875 ml serum.
   3. Extraheer het vereiste volume van verpakte cellen en suspensie het in de gewenste vloeistof. Verwerk de verpakte cellen als een zeer viskeuze vloeistof (met behulp van standaard pre-pipetteren en/of reverse-pipetteren of een verdringerpipet²⁸). In het gekozen voorbeeld, voor een monster van 4 ml bij een hematocriet van 45%, suspensie 1, 8 ml verpakte cellen binnen 2, 2 ml van het plasma-serummengsel.
2. Als de hematocriet van het monster niet wordt gecontroleerd, bepaal deze dan met behulp van microcentrifugatie met hoge snelheid (andere standaardmethoden zijn ook geschikt).
   1. Extraheer de benodigde hoeveelheid monster voor hematocrietbepaling: vul de micro-hematocrietcapillairen door de onderste punt in de vloeistof onder te dompelen. Stop het door de bovenste opening te bedekken wanneer de vereiste hoeveelheid monster in de buis stijgt door capillaire zuiging.
   2. Sluit de haarvaten af met afdichtingswas. Plaats ze in de micro-hematocrietcentrifuge en laat deze gedurende 5 minuten op 15.000 x g (12.000 tpm) draaien, of volgens de instructies van de fabrikant.
   3. Lees het hematocrietniveau op het capillair en schrijf het op ter referentie.
3. Stel een camera in voor het opnemen van de sedimentatie van de monsters. Om te voorkomen dat het geheugen overbelast raakt of de batterij leegloopt, voedt u het apparaat van het lichtnet en slaat u de foto's rechtstreeks op een computer of externe harde schijf op.
   1. Plaats een stabiele camera voor de houder waar de ESR-buizen in rust worden gelaten. Gebruik een witte, verlichte achtergrond (witte vellen papier op de achtergrond werken perfect).
   2. Met behulp van lege Westergren-buizen, bij voorkeur zonder markeringen, stelt u de focus en het gezichtsveld van de camera in om de hoogste resolutie te verkrijgen waar de monsters worden geplaatst. Zorg er bij voorkeur voor dat de randen van de afbeeldingen in verticale en horizontale richting zijn uitgelijnd.
   3. Maak een foto van een geschaalde buis om de pixelresolutie te extraheren. Het gebruik van RGB-afbeeldingen wordt aanbevolen.
   4. Stel het licht en de belichtingstijd van de camera in op een witte achtergrond, maar geen verzadiging. Het voorbeeld in figuur 1 is verkregen met een Canon EOS M50, met een belichtingstijd van 1/15s, een diafragma van F8.0, wolfraam witbalans, in single shot modus met handmatige scherpstelling en een ISO snelheid van 1.000.
4. Bereid de ESR-buizen voor en plaats ze.
   1. Vul de onderste container van de Westergren-buis met het volume dat overeenkomt met de instructies van de fabrikant. Plaats de Westergren-buis in de onderste container zoals aangegeven door de fabrikant.
   2. Zodra de eerste buis klaar is, plaatst u deze in de houder en start u de camera-opname. Het opnemen van één foto per minuut geeft meestal een goede resolutie van de ESR kinetische curve.
   3. Bereid de volgende monsters voor en plaats ze. Zorg ervoor dat u niet voor een monster gaat staan wanneer een foto wordt gemaakt.
   4. Laat de metingen minstens 2 uur lopen, om te vergelijken met standaardmetingen op 30 min, 1 h en 2 h. Het is echter ook beter om de verzadiging en stilstand van de sedimentatie te zien. Voor gezonde monsters, of in geval van ontsteking, is het registreren van de monsters 's nachts, tussen 12 uur en 24 uur, meer dan voldoende, omdat de kromming van de snelste monsters zichtbaar is binnen 3 uur^13,19. Als een aandoening echter de sedimentatiesnelheid verlaagt, zoals een afname van de fibrinogeenconcentratie (d.w.z. in het gekozen voorbeeld, hoge serumvolumefractie), kunnen opnames van 50 uur of meer nodig zijn om de meest nauwkeurige informatie te verkrijgen^16,19.

2. Beeldanalyse

OPMERKING: Zodra de beelden zijn opgenomen, extraheert u de ESR-curve. Een voorbeeld van Matlab-code wordt gegeven als Aanvullend bestand 1 (MatlabCodeImageAnalysisSampled.m).

1. Selecteer of identificeer een interessant gebied (ROI) waar slechts één buis zichtbaar is, waarbij de ondergrens zich onder de laagste positie van de erytrocytencelvrije plasma-interface bevindt, maar binnen het monster (zie figuur 1A, B). Draai de afbeelding indien nodig zodat de verticale richting wordt uitgelijnd langs het eerste onderdeel van de afbeelding.
2. Zet de ROI van de RGB-afbeelding om in een grijswaardenafbeelding of matrix Gr. Meestal is het combineren van de driekleurige kanalen (rood [R], groen [G] en blauw [B]) als Gr = 2 * R - B - G zeer efficiënt met een duidelijke achtergrond (zie Figuur 1C en MatlabCodeImageAnalysisSampled.m lijnen 121-128).
3. Binarize de foto. Voor een gezonde steekproef geeft het gebruik van de Otsu-drempel²⁹ meestal een consistent resultaat (zie figuur 1D en regel 133 van MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). Voor monsters met een hoge hematocriet of met enige hemolyse, is het misschien beter om het handmatig aan te passen of een andere automatische methode te gebruiken (zoals gedaan in regels 129-131 van MatlabCodeImageAnalysisSampled.m), afhankelijk van het exacte contrast dat wordt verkregen tussen de verschillende fasen in de buis.
4. Verkrijg het gemiddelde van de pixelwaarden (of elementen) van Gr langs de horizontale richting. Deze stap minimaliseert de ruis en neemt efficiënt het gemiddelde van de mogelijke interface-onregelmatigheden (zie Figuur 1E en MatlabCodeImageAnalysisSampled.m regel 137).
5. Voordat u de variaties berekent, moet u de curve gladstrijken met een voortschrijdend gemiddelde, vooral als de buizen enkele horizontale markeringen bevatten (zie figuur 1F). Voor de gegeven voorbeelden werd een bewegend venster van ~2,5 mm (50 pixels) gebruikt voor dit proces (zie regel 138 van MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). Identificeer vervolgens de interfacepositie als het punt met de hoogste intensiteitsvariatie (zie figuur 1G).
6. Herhaal dit voor elke afbeelding en elk voorbeeld. Sla voor elk voorbeeld de posities van de interface in de loop van de tijd op in een geschikt formaat om het fysieke model te passen bij elke geschikte software.

3. Aanpassing van het fysieke model

1. Met behulp van een geschikte software, die de hematocriet en de beginhoogte van de bloedkolom h 0 kent, vindt u de waarden van de vertragingstijd t₀, de dimensieloze tijd γ en de uiteindelijke verpakte volumefractie Φ_mvan de erytrocyten die de som van kwadratische restafwijkingen voor het fysieke model¹⁷ minimaliseert. Een Matlab-code (ShapeAnalyzerIntegrated.m) wordt geleverd als aanvullend bestand 2 als een voorbeeld van hoe een dergelijke fit moet worden uitgevoerd. Zie Aanvullend dossier 2 voor verdere instructies. Zoals elders beschreven^16,17, erytrocyten bij fysiologisch hematocrietsediment als een zachte deeltjesgel, waarbij de belangrijke fysische parameters het verschil in dichtheid zijn tussen het plasma en RBC's van de donor Δρ, de RBC-karakteristieke diameter r_RBC^, de plasmaviscositeit bij kamertemperatuur η en de hematocriet Φ van de donor . Met behulp van deze parameters, en ervan uitgaande dat de zwaartekrachtspanning het belangrijkste drijvende proces is voor het plasma om omhoog te stromen door het poreuze netwerk gevormd door de erytrocyten na een vertragingstijd t₀, verkrijgt men de temporele evolutie^16,17:
   
   met , en zijnde de gemiddelde schijfstraal van een erytrocyt. Een voorbeeld van een Matlab-code die dit uitvoert, wordt geleverd als bijlage (ShapeAnalyzerIntegrated.m past bij de functie die is gedefinieerd in SedimFit.m [Aanvullend bestand 3]). Als alternatief kan G/γ ook direct worden gebruikt als een fitparameter met eenheden van 1/t.
2. Zodra de kwantitatieve curve uit de afbeelding is geëxtraheerd, slaat u de fysieke parameters van het monster op. Traditionele ESR-waarden op 30 min, 1 h of 2 h kunnen nog steeds uit de curve worden geëxtraheerd ter referentie (zie ShapeAnalyzerIntegrated.m lijnen 123-132).

Resultaten

Een voorbeeld van een correct verkregen beeldreeks wordt gegeven als Aanvullende film 1 (MovieS1.avi). Een reeks karakteristieke pasvormen van het model is weergegeven voor verschillende omstandigheden in figuur 2. De fibrinogeenconcentratie werd bepaald aan de hand van de fibrinogeenconcentratie in het plasma Fib₀, ervan uitgaande dat het serum helemaal geen fibrinogeen bevat. Vandaar dat Fib = C Fib₀, waarbij C de plasmavolu...

Discussie

Om het geautomatiseerde protocol efficiënt te laten werken, is het belangrijk om een duidelijke achtergrond en de juiste verlichting te hebben. Een donkere achtergrond kan het bestaan van een efficiënte binarisatiedrempel voorkomen. Voor monsters met enige hemolyse, die meestal optreedt (toeneemt) in de loop van de tijd, is het belangrijk om eerst te verifiëren of de gekozen binarisatiedrempel relevant is voor zowel de eerste als de uiteindelijke foto's.

Als het gaat om het binarisatieproces v...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anticoagulant (EDTA or Heparin) tube (voor bloedmonster)	SARSTEDT	267001 of 265	Anticoaguleerde bloedmonster om te karakteriseren
Camera EOS M50	Canon	Kit EF-M18-150 IS STM	Elke camera zou moeten werken, op voorwaarde dat sectorvoeding, verbinding met de computer voor geautomatiseerde opnames en aangepast objectief beschikbaar zijn
Centrifuge	HERMLE	302.00 V03 - Z 36 HK	Vereisten: minimaal 3000 x g gedurende 7 min.
Micro-centrifuge	MLW	TH21	of een andere manier om de hematocriet te bepalen
Micro-hematocriet capillaires	Fisher scientific	11884040	of andere capillairen/containers voor hematocriet bepaling
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)	ThermoFisher	10010023	1x PBS, pH 7.4, 298 Osm
Pipetten (bijv. positieve verplaatsingspipet)	Gilson	FD10006	Pipet vereist om bloed en/of gepakte cellen te manipuleren. Andere modellen zijn natuurlijk ook geschikt, maar wees voorzichtig bij het behandelen van bloed en gepakte cellen als zeer stroperige vloeistoffen.
Wax verzegelingsplaat	Hirschmann	9120101	Sealing wax voor de micro-hematocriet capillaires
Westergren buisjes	Praxindo	A9244560	Elk ander standaard Westergren buisje zou ook moeten werken
Witte achtergrond met verlichting	/	/	Witte vellen papier achter de monsters, met gebruikelijke kamerlicht is volkomen voldoende.