Methodenartikel

Ecotoxicologische methodologieën om biomarkers op verschillende schalen te evalueren bij neotropische anura's

DOI:

10.3791/64520

⸱

28 april 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Química de San Luis (INQUISAL), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas Y Técnicas (CONICET), Facultad de Ciencias de la Salud (FCS), Universidad Nacional de San Luis (UNSL), 2Departamento de Ciencias Ambientales y Producción, Universidad Nacional de Los Comechingones (UNLC), 3Laboratório de Patologia Experimental - LAPEx, Instituto de Biociências - INBIO Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, 4Cátedra de Citología, Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Universidad Nacional de La Plata, 5Área de Biología, Departamento de Biología, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis (UNSL), 6Instituto de Recursos Biológicos, Centro de Investigaciones de Recursos Naturales (CIRN), Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), 7Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel worden gestandaardiseerde ecotoxicologische methoden gepresenteerd voor de evaluatie van biomarkers in neotropische anura-soorten. In het bijzonder beschrijft dit artikel verschillende methodologieën op verschillende schalen van ecotoxicologische evaluatie, zoals genetisch, cellulair-histologisch, biochemisch, morfologisch en individueel niveau.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De nieuwe vragen in de ecotoxicologie benadrukken het belang van het toepassen van een reeks biomarkers, omdat dit resulteert in ecotoxicologische voorspellingen die niet alleen de interpretatie van de effecten van milieustressoren op organismen verbeteren, maar ook de bepaling van hun mogelijke impact. Het is algemeen bekend dat het gebruik van ecotoxicologische biomarkers op verschillende organisatieniveaus het mogelijk maakt de biologische reacties van organismen op milieustressoren te voorspellen, wat nuttig is bij de beoordeling van milieurisico's.

Niettemin is het noodzakelijk om de optimalisatie van basisprocedures te overwegen, om historische gegevens in controlegroepen te genereren en om specifieke bioassays te gebruiken om reacties in organen en weefsels te evalueren om de aard en variatie van de waargenomen effecten op te helderen. Daarom heeft het huidige werk tot doel verschillende ecotoxicologische methodologieën te beschrijven die in alle stadia van neotropische anura's op verschillende ecologische niveaus worden gebruikt en deze te valideren als nuttige biomarkers die zowel in het wild als in laboratoriumomstandigheden kunnen worden gebruikt. In dit werk werden deze biomarkers toegepast op individueel/organismisch niveau (lichaamsconditie-index), histologisch/fysiologisch niveau (histopathologie, histometrische en pigmentanalyses), biochemisch niveau (oxidatieve stressenzymen) en genetisch niveau (directe en oxidatieve schade in DNA door komeettest).

Hoewel deze methodologieën kleine variaties of aanpassingen hebben, afhankelijk van de soort, bieden deze technieken effectieve biomarkers voor het evalueren van het effect van xenobiotica op anura's, die bepaalde kenmerken bezitten die ze tot nuttige indicatorsoorten van aquatische en terrestrische ecosystemen maken. Concluderend is de reeks biomarkers die in de huidige studie worden gebruikt, geschikt gebleken voor het schatten van toxische reacties in neotropische anura's en kan verder worden aanbevolen als bio-indicatoren voor het identificeren van de impact van verontreinigende stoffen op de aquatische ecosystemen van de regio. Ten slotte wordt aanbevolen om de standaardisatie van deze belangrijke biomarkers voor anura's in specifieke regio's te realiseren en ze eventueel mee te nemen in risicobeoordelingen en besluitvorming.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De inbreng van milieustressoren in natuurlijke waterlichamen kan de gezondheid van het aquatische ecosysteem beïnvloeden1. Blootstelling aan deze milieustressoren kan de overleving of fitheid van in het water levende organismen beïnvloeden via verschillende toxiciteitsmechanismen, waaronder directe blootstelling (zowel op korte als op lange termijn)2. Daarom kunnen gestandaardiseerde laboratoriumbioassays om toxicologische eindpunten met betrekking tot fitheid en overleving te beoordelen, een onbetrouwbare schatting zijn van de vele indirecte effecten van stress in het veld. Bovendien kunnen veranderingen in normale fysiologische niveaus en effecten op individuen, bijvoorbeeld in termen van het vangen van prooien, betere langetermijnindicatoren zijn van de impact op overleving en reproductieve fitheid van organismen en, uiteindelijk, op de gezondheid van het ecosysteem 1,3. Het voorspellen van veranderingen in de samenstelling en functie van ecosystemen, evenals de gezondheid van organismen, op basis van een bekende reeks milieuparameters en concentraties van verontreinigende stoffen, is belangrijk voor het verbeteren van het beheer van verontreiniging1.

Biomarkers worden gedefinieerd als biochemische, fysiologische of histologische veranderingen als gevolg van blootstelling aan of de effecten van xenobiotische chemicaliën 4,5. Biomarkers zijn zeer nuttig gebleken als vroege waarschuwingssignalen 4,5. Een belangrijke vraag die biomarkers helpen beantwoorden, is of bepaalde stressoren in voldoende hoge concentraties in het milieu aanwezig zijn om nadelige effecten te veroorzaken. Deze informatie draagt bij aan de beoordeling of het de moeite waard is om de aard en omvang van de schade en de veroorzakers te onderzoeken of dat er in dat geval niet meer middelen moeten worden geïnvesteerd 6,7,8. Bovendien, aangezien het concept van het evalueren van een enkele biomarker als bio-indicator mogelijk niet adequaat is 5,7,8,9,10, is er een groeiende trend om een uitgebreide evaluatie van meerdere biomarkers uit te voeren om vroege waarschuwingssignalen te detecteren en zo onomkeerbare effecten op ecosystemen te voorkomen.

Het is erg belangrijk op te merken dat alle toxische effecten beginnen met de interactie van een stressor met biomoleculen. In die zin kunnen effecten zich cascaderen door de biochemische, subcellulaire, cellulaire, weefsel-, orgaan-, individu-, populatie-, gemeenschaps-, ecosysteem-, landschaps- en biosferische organisatieniveaus. Cellen zijn de primaire plaats van interactie tussen omgevingsstressoren en biologische systemen. Het begrijpen van moleculaire en genetische effecten stelt onderzoekers dus in staat om lage en hoge niveaus van ecologische organisatie met elkaar te associëren en helpt hen om het effect van milieuverontreinigende stoffen te voorspellen, bijvoorbeeld op de menselijke gezondheid, die nog niet zijn getest5. Bovendien zijn cellen, vanwege de hoge specificiteit ervan, niet alleen nuttig voor het evalueren van milieuverontreinigende stoffen, maar ook voor de menselijke gezondheid 5,11. Daarom kan het begrijpen van de effecten van stressoren op biochemisch niveau inzicht geven in de oorzaken van de waargenomen effecten en het mogelijk maken om ze te verbinden met die op het volgende hogere niveau5. Door de biochemische mechanismen van stressoren te begrijpen, kunnen bovendien de effecten van nieuwe stressoren die nog niet toxicologisch zijn geëvalueerd, worden voorspeld met betrekking tot andere bekende contaminanten op basis van hun overeenkomsten in functie. In aanwezigheid van verschillende omgevingsstressoren kunnen genetische en biochemische biomarkers waardevolle informatie opleveren over de specifieke effecten die worden waargenomen. Daarnaast kunnen histochemische evaluaties met betrekking tot biochemische veranderingen informatie verschaffen over toxicodynamica5. Kortom, een uitgebreide analyse van cellulaire, biochemische en histologische biomarkers is noodzakelijk10,12, en dit type analyse moet op zijn beurt worden opgenomen in biomonitoringprogramma's voor lokale soorten 5,13,14.

Het onderzoek van biomarkers onder laboratoriumomstandigheden kan echter enkele problemen opleveren, waaronder problemen bij het opsporen van subletale effecten en chronische effecten na blootstelling aan verontreinigende stoffen en bij de validatie en standaardisatie van de gebruikte methoden, evenals de complexe tijd- of dosisafhankelijke reacties, de onduidelijke of onbepaalde verbanden met fitness en het ontbreken van geïntegreerde mechanistische modellen1, 4. okt. Om deze problemen op te lossen, is de oplossing niet om het aantal gemeten biomarkers te verhogen, maar om zorgvuldig studies en testbare hypothesen op te zetten die bijdragen aan het verklaren van de mechanistische grondslagen van chemische effecten op hele organismen.

De nieuwe vragen in de ecotoxicologie benadrukken het belang van het toepassen van een reeks biomarkers om ecotoxicologische voorspellingen te genereren die de interpretatie van de effecten van milieustressoren op organismen verbeteren, evenals de besluitvorming over hun mogelijke impact. Bovendien is het belang van het combineren van beide concepten - biomarkers en bio-indicatoren - in milieurisicobeoordelingen en biomonitoring dat dit onderzoekers in staat zal stellen te bepalen of organismen in een specifieke omgeving van belang fysiologisch normaal of gestrest zijn. De aanpak die in deze studie wordt gevolgd, lijkt op die van de biochemische analyse die bij mensen wordt uitgevoerd. In die zin kan een reeks biomarkers worden geanalyseerd om te zien of een organisme gezond is, zowel in het veld als in het laboratorium6. Ten slotte zullen biomarkers op twee manieren bijdragen aan ecologische risicobeoordelingen: (1) het beoordelen van de blootstelling van zeldzame en/of langlevende soorten, en (2) het testen van hypothesen over de mechanismen van chemische effecten op verschillende niveaus van biologische organisatie4.

In het afgelopen decennium zijn biomarkers gebruikt in anura's voor het biomonitoren van de blootstelling aan cytotoxische en genotoxische contaminanten. Hiervan zijn de technieken die het vaakst zijn gebruikt de micronucleus (MN) -test en de komeettest of de inductie van enkelstrengs DNA-breuken door eencellige gelelektroforese (SCGE) -assay. Bovendien zijn deze technieken met succes gebruikt om de DNA-schade te schatten die wordt veroorzaakt door verschillende omgevingsstressoren in verschillende neotropische anura's 14,15,16,17,18,19. Andere biomarkers kunnen worden gebruikt om veranderingen in de oxidatieve status te onderzoeken in organismen die worden blootgesteld aan milieuverontreinigende stoffen 16,17,18,19. Oxidatieve stress is een reactie op blootstelling aan verschillende xenobiotica, wat leidt tot verschillende nadelige effecten, waaronder op de antioxidantcapaciteit van de blootgestelde personen 5,6,7,19,20.

In ecotoxicologische studies worden bio-indicatorsoorten gebruikt omdat het organismen zijn die de langetermijninteracties en nadelige effecten van milieustressoren op hogere organisatorische niveaus (bijv. organisme-, populatie-, gemeenschaps- en ecosysteemniveaus) identificeren10,20,21. Door de integratie van de twee concepten - biomarkers en bio-indicatoren - kunnen soorten worden gescreend om biochemische, fysiologische of ecologische structuren of processen breed te definiëren die gecorreleerd of gekoppeld zijn aan gemeten biologische effecten op een of meer niveaus van biologische organisatie. Ten slotte heeft de grote uitdaging om beide concepten te gebruiken om de schattingen van de toxiciteit van een stressor te verbeteren, betrekking op het analyseren van biomarkers en bio-indicatoren die van groot nut zijn bij de evaluatie van ecologische risico's20. In die zin is er consensus over de relevantie van het gebruik van biomarkers en bio-indicatoren als vroege waarschuwingssignalen, omdat ze relevante informatie bieden over de reactie van een testorganisme op omgevingsstressoren 12,20,21.

Amfibieën zijn een van de meest bedreigde en snel afnemende groepen organismen ter wereld. Een van de belangrijkste redenen voor deze afname zijn verontreinigende stoffen die hun leefgebied binnendringen, zoals pesticiden, metalen en opkomende verontreinigende stoffen 22,23,24,25. Anura's hebben verschillende kenmerken die ze nuttig maken als bio-indicatorsoorten, zoals hun doorlaatbare huid, nauwe relatie met water en gevoeligheid voor milieuvervuiling 2,23,24. Deze kenmerken maken amfibieën tot effectieve bio-indicatoren van de gezondheid van het milieu 7,8,22,23,24,26.

Niettemin is het noodzakelijk om niet alleen de optimalisatie van basisprocedures en het genereren van historische gegevens in controlegroepen te overwegen, maar ook om specifieke bioassays te gebruiken om reacties in organen en weefsels te evalueren om de aard en variatie van de effecten die in bio-indicatoren worden waargenomen op te helderen. In die zin heeft het huidige werk tot doel verschillende ecotoxicologische methodologieën te beschrijven die in alle stadia van neotropische anura's op verschillende ecologische niveaus kunnen worden gebruikt en deze te valideren als nuttige biomarkers die zowel in dieren in het wild als in laboratoriumomstandigheden kunnen worden gebruikt. Dit werk presenteert een reeks biomarkers die kunnen worden geïntegreerd en die zijn bewezen voor biomonitoring in laboratoria en in het wild levende dieren bij anura's die zijn blootgesteld aan omgevingsstressoren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De volgende technieken omvatten het eerdere offer van het dier, dat werd uitgevoerd in overeenstemming met internationale ethische normen 46,47,48, en de daaropvolgende dissectie en ablatie van de organen. De dieren werden gevangen met toestemming van het Ministerie van Milieu, Landbouw en Productie van de provincie San Luis (Resolutie 49-PMA2019). De methoden voor het offeren en euthanasie van de dieren werden naar behoren goedgekeurd door de protocollen van het Institutional Animal Care and Use Committee (CICUA, protocol Q-322/19) van de Nationale Universiteit van San Luis. De procedures met anura-organismen werden uitgevoerd volgens de richtlijnen die zijn beschreven in Garber et al.46, CONICET47 en INTA48. Bovendien zijn alle hier gepresenteerde protocollen voor neotropische anura-soorten in hun larvale en volwassen levensfasen; ze zijn al algemeen aanvaard door lokale onderzoekers en worden uitgevoerd volgens een strikt protocol en met toestemming van het "Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (CICUA)" van elke betrokken universiteit. Een lijst van de gebruikte materialen en oplossingen wordt weergegeven in de Tabel met materialen en Tabel 1.

1. Individueel niveau: lichaamsconditie en lever- en gonadale indexen

  1. Lichaamsconditie-index: Geschaalde massa-index
    OPMERKING: Deze index kan zowel bij volwassenen als bij juvenielen en larven worden gebruikt. Deze methodologie is gebaseerd op Peig en Green27, met kleine aanpassingen voor anura's volgens Brodeur et al.28,30 en MacCracken en Stebbings29.
    1. Registreer de lichaamsgewicht van elk monster met behulp van een nauwkeurige analytische schaal.
    2. Leg elk exemplaar op een millimetervel en maak een foto op een afstand van ~15 cm.
      OPMERKING: Het is belangrijk om altijd foto's te maken vanaf dezelfde afstand.
    3. Foto analyse:
      OPMERKING: De foto's kunnen worden geanalyseerd met het ImageJ-programma, dat gratis online beschikbaar is (https://imagej.nih.gov/ij/index.html), of met een ander beeldanalyseprogramma waarmee metingen kunnen worden uitgevoerd vanaf een schaal die in de foto is opgenomen.
      1. Meet de snuit-ventlengte (SVL) van elk monster met behulp van het meetgereedschap van het ImageJ-programma en raadpleeg eerst een bekende maat in het millimetervel.
        OPMERKING: Bij kikkervisjes moet de lichaamslengte worden gemeten tot aan de cloacabuis, zonder rekening te houden met de staartvin.
    4. Geschaalde massa-index (S)
      1. Met de gegevens verkregen uit de lichaamsgewicht en SVL van elke anura, construeert u een niet-lineaire regressielijn van de lichaamsmassa (y-as) tegen SVL (x-as).
      2. Bereken de gemiddelde lengte met de SVL-gegevens van alle gemeten individuen uit de bestudeerde populatie.
      3. Bereken ten slotte de geschaalde massa-index (S) volgens Peig en Green27 en Brodeur et al.28 met behulp van vergelijking (1):
        S = Mi(L0/Li)b (1)
        waarbij Mi en Li respectievelijk de lichaamsgewicht en SVL van het individu i zijn; b is de schaalexponent die wordt geschat door een niet-lineaire vermogensfunctieregressie28; L0 is de gemiddelde lengte voor de bestudeerde populatie; en S is de voorspelde lichaamsgewicht voor de individuele i wanneer de SVL is gestandaardiseerd op de L0-waarde .
        OPMERKING: Het is belangrijk op te merken dat b een soortspecifieke constante is die ook geslachtsspecifiek kan zijn bij seksueel dimorfe soorten.
  2. Hepatosomatische index: Geschaalde leverindex
    OPMERKING: Wat betreft de lichaamsconditie-index, deze index kan worden gebruikt bij individuen in alle stadia van ontwikkeling. De methodologie is gebaseerd op Brodeur et al.28.
    1. Noteer de SVL van elk monster volgens stap 1.1.2 en stap 1.1.3.
    2. Euthanaseer individuen volgens ethische normen voor anura-amfibieën 46,47,48.
    3. Verwijder de hele lever en noteer de massa op een nauwkeurige analytische schaal tot op de milligram.
    4. Met de gegevens verkregen uit de levermassa en SVL van elke anura, construeert u een niet-lineaire regressielijn van de levermassa (y-as) tegen SVL (x-as).
    5. Bereken de gemiddelde lengte met de SVL-gegevens van alle gemeten individuen uit de bestudeerde populatie.
    6. Bereken de geschaalde leverindex (SLI) volgens Brodeur et al.28 met behulp van vergelijking (2):
      SLI = Lmi (L0/Li)b (2)
      waarbij Lmi en Li respectievelijk de levermassa en SVL van het individu i zijn; b is de schaalexponent die wordt geschat door een niet-lineaire vermogensfunctieregressie28; L0 is de gemiddelde lengte voor de bestudeerde populatie; en SLI is de voorspelde levermassa voor de individuele i wanneer de SVL is gestandaardiseerd op de L0.
  3. Gonadale index: Geschaalde gonadale index
    OPMERKING: Deze methodologie is gebaseerd op Brodeur et al.30 en is alleen bruikbaar bij volwassen personen. Het is belangrijk op te merken dat mannelijke en vrouwelijke indices afzonderlijk moeten worden geanalyseerd, omdat ze op verschillende schalen variëren.
    1. Noteer de SVL van elk monster volgens stap 1.1.2 en stap 1.1.3.
    2. Euthanaseer individuen volgens ethische normen voor anura-amfibieën 46,47,48.
    3. Verwijder de rechter- en linkergeslachtsklieren en noteer de massa op een nauwkeurige analytische schaal tot op de milligram.
    4. Construeer met de gegevens verkregen uit de massa van de geslachtsklieren en SVL van elke anuran een niet-lineaire regressielijn van de geslachtskliermassa (y-as) tegen SVL (x-as), vergelijkbaar met stap 1.1.4.1 en stap 1.2.3.
    5. Bereken de gemiddelde lengte met de SVL-gegevens van alle gemeten individuen uit de bestudeerde populatie.
    6. Schat de geschaalde gonadale index (SGI) volgens Brodeur et al.30 voor elk dier met behulp van vergelijking (3):
      SGI = Gmi(L0/Li)b (3)
      waarbij Gmi en Li respectievelijk de massa van de geslachtsklieren en SVL van het individu i zijn, b de schaalexponent is die wordt geschat door een niet-lineaire regressie van de machtsfunctie door Brodeur et al.30, L 0 de gemiddelde lengte is voor de bestudeerde populatie en SGI de voorspelde massa van de geslachtsklieren is voor een individu i wanneer de SVL is gestandaardiseerd op de L0.

2. Morfologisch-histologisch niveau

OPMERKING: Voor deze analyse is het noodzakelijk om histologische secties te gebruiken. De eerste stap is het verzamelen van het weefsel.

  1. Fixatie en uitdroging
    1. Gebruik een fixeeroplossing om de structuren te conserveren. Gebruik voor anura-weefsels bij voorkeur methacarn of Bouin-oplossing, aanbevolen boven de rest van de fixeeroplossingen (tabel 1).
      OPMERKING: Alle stoffen moeten op het moment van gebruik worden gemengd.
    2. Plaats kikkervisjes of een weefselfragment van 50-100 mg in een kegelvormige buis met 1-2 ml fixeeroplossing bij 4 °C gedurende 3 uur. Was de tissue in hetzelfde volume van 70% ethylalcohol gedurende 30 minuten.
    3. Plaats de tissue in een verse oplossing van 70% ethylalcohol.
      OPMERKING: Het is mogelijk om de procedure op dit punt enkele dagen te stoppen voordat u doorgaat met de uitdroging.
    4. Dehydrateer het weefsel in een reeks alcoholoplossingen: ethylalcohol 80% (10 min), alcohol 90% (10 min), ethylalcohol 100% (10 min) en ethylalcohol 100% (10 min).
    5. Voer diafanisatie (klaring) 2 x 10 minuten uit in xyleen.
    6. Smelt de paraffine in een bekerglas. Week het zakdoekje gedurende 10 minuten. Verwijder het weefsel en plaats het in een histologische mal met gesmolten paraffine. Wacht tot het bij kamertemperatuur is gestold.
    7. Plaats 3 μm secties gemaakt op een roterende microtoom op een glasplaatje.
  2. Histometrische analyse
    1. Kleurt de weefselsecties in hematoxyline-eosine31.
    2. Gebruik 10-20 microfoto's voor metingen met een 100x objectief in een lichtmicroscoop. Analyseer 5-10 levercellen in elke microfoto.
      OPMERKING: Hier werd de lever als model gebruikt om de techniek te beschrijven. Het is mogelijk om andere weefsels te gebruiken; Zorg ervoor dat het objectief van de te gebruiken lichtmicroscoop geschikt is voor het type weefsel. Het is noodzakelijk om de te meten cellen te kunnen zien en identificeren.
  3. Histopathologie
    1. Na het kleuren van de weefselsecties in hematoxyline-eosine32, onderzoekt u 5-10 histologische secties onder 10x, 20x, 40x en 100x objectieven.
    2. Zoek naar weefselveranderingen en schat de mate van weefselveranderingen (DTC) index zoals beschreven door Bernet et al.32 met behulp van vergelijking (4):
      DTC = Σalt. (een × w)    (4)
      waarbij Σalt de som van de verandering is; a staat voor het schadestadium (0, afwezig; 1, laag; 2, matig; 3, hoog); en w staat voor de mate van omkeerbaarheid van schade (1, omkeerbaar; 2, gedeeltelijk omkeerbaar; 3, onomkeerbaar).
      OPMERKING: Hier werd de lever als model gebruikt om de techniek te beschrijven. Het is mogelijk om andere weefsels te gebruiken; Zorg ervoor dat het objectief van de te gebruiken lichtmicroscoop geschikt is voor het type weefsel.
  4. Pigment systeem
    1. Nadat u de objectglaasjes in hematoxyline-eosine hebt gekleurd, onderzoekt u 10-20 microfoto's met een 20x objectief.
    2. Kwantificeer het gebied dat door melanine wordt ingenomen door verschillen in de kleurintensiteit te meten met behulp van Image Pro-Plus-software volgens Santos et al.33.
    3. Open de software Image Pro Plus 6.0®.
    4. Selecteer Menu en werkbalk: Biologisch.
    5. Selecteer de ruimtelijke kalibratie van de vergroting die wordt gebruikt om de microfoto's te maken.
    6. Open een histologische afbeelding.
    7. Selecteer Gereedschapstelling | Objecten meten.
    8. Klik op de knop Kleuren selecteren .
    9. Selecteer het druppelaargereedschap en markeer de kleur die in de afbeelding moet worden gemeten.
    10. Sluit het venster en klik op Tellen.
    11. Selecteer Weergave | Statistieken om de resultaten te zien.

3. Biochemisch niveau: Reactieve zuurstofsoorten (ROS) en cholinerge enzymen

  1. Homogenisatie van monsters
    OPMERKING: Zodra het experiment is afgelopen, bewaart u de monsters (weefsels of kikkervisjes) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) als ze op dat moment niet worden verwerkt door ze in te vriezen bij -20 °C (gedurende 2 maanden) of -80 °C (gedurende 6 maanden). Als alternatief kunnen ze op dat moment worden gehomogeniseerd volgens de hieronder voorgestelde aanbevelingen.
    1. Kikkervisjes
      1. Weeg 1 g van een kikkervisje of een plas kikkervisjes af met een analytische precisiebalans.
      2. Doe de 1 g kikkervisjes in een kegelvormige buis van 15 ml met 1 ml PBS en dompel deze onder in een ijsbad (4 °C).
      3. Homogeniseer met een homogenisator met teflonpunt die is aangepast aan een conische buis en werk in koude omstandigheden (4 °C).
        LET OP: Vermijd het gebruik van een groot aantal omwentelingen, omdat dit eiwitten kan vernietigen en de temperatuur kan verhogen.
      4. Breng hetzelfde volume van het vloeibare homogenaat van elk monster over in twee gelabelde microcentrifugebuisjes van 2 ml en werk in koude omstandigheden (4 °C).
      5. Centrifugeer de monsters met het vloeibare homogenaat gedurende 10 minuten bij 4 °C en 9.520 × g.
      6. Extraheer ten slotte het supernatant, plaats het in microcentrifugebuisjes, label het in hoeveelheden van 0,5 ml tot 1 ml en bewaar het in een vriezer bij -80 °C (gedurende 6 maanden) of -20 °C (gedurende 2 maanden) tot de enzymanalyse.
    2. Volwassenen
      1. Verwijder het betreffende weefsel (bijv. lever, spieren, nieren) en weeg 1 g af op een analytische precisiebalans.
      2. Plaats het zakdoekje in een conische buis van 50 ml met 1 ml PBS en dompel het onder in een ijsbad (4 °C).
      3. Homogeniseer met een homogenisator met teflonpunt die is aangepast aan een conische buis en werk koud (4 °C).
        LET OP: Vermijd het gebruik van een hoog toerental, omdat dit eiwitten kan vernietigen en de temperatuur kan verhogen.
      4. Breng hetzelfde volume van het vloeibare homogenaat van elk monster over in twee gelabelde microcentrifugebuisjes van 2 ml en werk koud (4 °C).
      5. Centrifugeer de buisjes met het vloeibare homogenaat gedurende 10 minuten bij 4 °C en 9.520 × g.
      6. Extraheer ten slotte het supernatant, plaats het in microcentrifugebuisjes, label in hoeveelheden van 0,5 ml tot 1 ml en bewaar in een vriezer bij -80 °C (gedurende 6 maanden) of -20 °C (gedurende 2 maanden) tot de enzymanalyse.
  2. Bepaling van eiwitten
    OPMERKING: De eiwitwaarde wordt verkregen om de enzymatische activiteit te schatten in verhouding tot de totale hoeveelheid eiwit, terwijl onderschatting of overschatting van de enzymatische activiteitswaarden wordt vermeden. Deze methodologie is gebaseerd op Bradford34 met kleine aanpassingen voor anura's:
    1. Bereid Bradford-reagens voor (zie tabel 1).
    2. Voeg 100 ml H3PO4 85% (p/v) toe aan Coomassie G-250 + ethanol en breng met gedestilleerd water tot een volume van 1 l.
    3. Bereid de kalibratiecurve voor met runderserumalbumine (BSA) als een bekende eiwitstandaard (tabel 1).
    4. Bereid albuminestandaarden in toenemende concentraties voor op een spectrofotometercuvet van 3 ml. Voor een voorbeeld van de standaardcurve, zie tabel 2.
    5. Meet de extinctie met behulp van een spectrofotometer bij 590 nm (dit is de golflengte waarbij het complex van het reagens en het eiwit wordt gevormd).
      OPMERKING: Het uitvoeren van de Bradford-reactie met het monster voor aflezing in de spectrofotometer met behulp van een glazen cuvet met een maximaal volume van 3 ml en een optisch pad van 1 cm helpt bij de bepaling van het eiwit.
    6. Doe de volgende reactanten in een cuvet in deze volgorde: 2.000 μL van het Bradford-reagens + X μL van het monster (X = 20 μL van het homogenaatmonster van het betreffende orgaan van een volwassen anura, of 40 μL van het homogenaatmonster van een kikkervisje).
    7. Meet ten slotte de extinctie in de spectrofotometer bij 590 nm.
      OPMERKING: Het is niet nodig om bij 4 °C te werken.
  3. Katalase
    OPMERKING: Deze methodologie is gebaseerd op Aebi35 met kleine aanpassingen voor anura's.
    1. Incubeer 1.900 μL PBS + 40 μL waterstofperoxide (H202) + 20 μL van het monster (zuiver in kikkervisjes en verdund 1/25 voor volwassen weefsel) in een kwartscuvet van 3 ml met een weglengte van 1 cm.
      LET OP: Volg de bovenstaande volgorde voor de toevoeging van de reagentia en het monster tijdens de incubatie. De reactanten kunnen bij kamertemperatuur (25 °C) worden geïncubeerd, aangezien anura's fysiologisch ectotherm zijn.
    2. Lees de catalasekinetiek bij 240 nm gedurende 2 minuten af in een UV-spectrofotometer.
    3. Bereken de enzymactiviteit met de volgende vergelijking (5)35:
      k (mmol∙min-1∙mg-1 Prt) = (Δ absorptie/1.000)/eiwitconcentratie (5)
      OPMERKING: In onderzoeken met gezuiverde enzympreparaten wordt de specifieke activiteit k'0 verkregen door k te delen door de molaire extinctiecoëfficiënt (e = 43,6); k' = (k/e).
  4. Glutathion S-transferase (GST)
    OPMERKING: Deze methodologie is gebaseerd op Habig et al.36 met kleine aanpassingen voor anura's.
    1. Incubeer 300 μL GST + 10 μL 1-choro-2, 4-dinitrobenzeno (CDNB) (0,1 M) + 10 μL van het monster (zuiver in kikkervisjes en verdund 1/25 voor volwassen weefsel) in de cuvet.
      LET OP: Respecteer de volgorde van toevoeging van de reagentia en het bovenstaande monster tijdens de incubatie. De reagentia kunnen bij kamertemperatuur (25 °C) worden geïncubeerd, aangezien anura's fysiologisch ectotherm zijn.
    2. Bereid de GST voor (tabel 1).
    3. Lees de GST-kinetiek bij 340 nm gedurende 2 minuten af in de spectrofotometer.
    4. Bereken de enzymactiviteit met de volgende vergelijking (6):
      Activiteitssnelheid van GST (mmol/per minuut/mg eiwit) = ([Δ absorptie/1.000]/9,6 × 104)/eiwitconcentratie (6)
      Waarbij 9,6 mM−1 cm−1 = molaire extinctiecoëfficiënt.
  5. Lipide peroxidatie (TBARS)
    OPMERKING: Deze methodologie is gebaseerd op Buege en Aust37 met kleine aanpassingen voor anura's.
    1. Construeer een kalibratiecurve met MDA als standaard en 0,7% TBA (Tabel 3).
    2. Bereid de standaard MDA-oplossing (10 mM) voor (tabel 1). Voer THP-hydrolyse tot MDA uit door de oplossing gedurende 1 uur in een waterbad van 50 °C te plaatsen.
    3. Bereid een 0,7% (w/v) oplossing van TBA (tabel 1) met behulp van een magnetische kookplaatroerder.
    4. Centrifugeer het monster vervolgens gedurende 30 minuten bij 9.520 × g en 4 °C.
    5. Extraheer 500 μL van het supernatant, voeg 100 μL 6 M NaOH toe en plaats in een thermaal bad bij 60 °C gedurende 30 min.
    6. Voeg na het thermale bad 250 μL 35% HClO4 toe en plaats het vervolgens 30 minuten in een ijsbad (4 °C).
    7. Centrifugeer na die tijd gedurende 12 minuten bij 9.520 × g en extraheer 300 μL van het supernatant.
    8. Voeg 300 μL 0,7% TBA toe aan het supernatans (monster) en plaats het gedurende 30 minuten in een thermaal bad (97,5 °C).
    9. Lees de extinctie af van het complex gevormd door het monster en TBA bij 532 nm en bepaal de MDA-concentratie in de monsters door de absorptiewaarden in de vergelijking van de curve te vervangen (Figuur 1).
  6. Acetylcholinesterase (AChE)
    OPMERKING: Deze methodologie is gebaseerd op die voorgesteld door Ellman et al.38 met kleine aanpassingen voor anura's.
    1. Stel op het moment van meting de reagentia DTNB en acetylthiocholinejodide (ATCh) in.
    2. Bereid de DTNB-reactie voor (tabel 1).
    3. Bereid de AChE-reactie voor (tabel 1).
    4. Bereid in een glazen cel met een optisch pad van 1 cm de AChE-reactie voor door deze reagentia in de volgende volgorde te plaatsen: 150 μL PBS-buffer (pH = 8) + 150 μL DTNB + 50 μL ATCh + 10 μL van het monster (puur bij kikkervisjes en verdund 1/10 bij volwassen anura's).
    5. Lees de AChE-kinetiek af bij 412 nm gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    6. Verkrijg de waarde van AChE-activiteit met behulp van de volgende vergelijking (7):
      Activiteitsgraad van AChE (mmol∙min-1∙mg-1 eiwit) = ([Δ absorptie/1.000]/1,36)/eiwitconcentratie (7)

4. Genetisch en cellulair niveau: Micronucleus en komeettest

  1. Micronucleus (MN) test
    OPMERKING: De methodologie is in overeenstemming met die voorgesteld door Fenech39 met kleine aanpassingen voor neotropische anura's.
    1. Verdoof de monsters door onderdompeling in ijswater (4 °C) en verkrijg bloedmonsters door ze achter het operculum in kikkervisjes te snijden of door hartpunctie bij volwassenen.
    2. Smeer twee druppels perifeer bloed van de monsters op voorgereinigde objectglaasjes.
    3. Laat de objectglaasjes daarna aan de lucht drogen, fixeer ze gedurende 20 minuten met 100% (v/v) koude methanol (4 °C) en beits ze vervolgens gedurende 12 minuten met 5% Giemsa-oplossing.
    4. Laat één onderzoeker de dia's coderen en blindcoderen met een vergroting van 1.000x.
    5. Bepaal de frequentie van MN's door 1.000 rijpe erytrocyten van elk monster te analyseren en uit te drukken als het totale aantal MN's per 1.000 cellen.
    6. Gebruik de volgende criteria voor de juiste identificatie van MN's:
      1. Zoek naar MN's met een diameter kleiner dan 1/3 van die van de hoofdkern.
      2. Zorg ervoor dat de kleuring van de MN niet breekbaar is, maar een kleuringsintensiteit heeft die gelijk is aan of lichter is dan die van de hoofdkern.
      3. Zoek naar een MN-grens die te onderscheiden is van de hoofdkerngrens zonder enige verbinding met de kern of overlappend met de hoofdkern.
      4. Zorg ervoor dat het aantal MN's in de cellen niet meer dan vier MN's overschrijdt die bij de kern horen.
  2. Komeettest of eencellige gelelektroforese (SCGE)
    1. Verdoof monsters door onderdompeling in ijswater en verkrijg bloedmonsters door ze achter het operculum in kikkervisjes te snijden of door hartpunctie bij volwassenen.
    2. Verdun het bloed met 1 ml PBS, centrifugeer (381 × g, 9 min) en resuspendeer in een eindvolume van 50 ml PBS.
    3. Meng 30 μL van het bloedmonster in 70 μL agarose met een laag smeltpunt (LMPA) met een concentratie van 0,5% agarose om laag 2 te vormen. Plaats vervolgens 50 μl laag 2 op een objectglaasje dat eerder is bedekt met laag 1 met 100 μl agarose van 0,5% normaal smeltpunt.
    4. Dek de glaasje af met een dekglaasje en leg het 10 minuten in de kou (4 °C) om laag 2 te laten stollen.
    5. Verwijder na het stollen het dekglaasje en vorm de derde laag door 100 μL 0,5% LMPA neer te leggen.
    6. Wanneer de derde laag stolt, verwijdert u het dekglaasje en dompelt u elk objectglaasje onder in een Copilin-pot van 100 ml met lysisoplossing (tabel 1) die op dezelfde dag is bereid en op 4 °C is gehouden. Plaats de Coplin-potten 1 uur in een koud bad in het donker (4 °C) om lysis te laten optreden.
      OPMERKING: Het experiment kan worden gepauzeerd en later opnieuw worden gestart. Er is gemeld dat de lysisperiode 1 uur tot 1 maand duurt.
    7. Verwijder aan het einde van de lysis de objectglaasjes en dompel ze onder in de elektroforesebufferoplossing (tabel 1) in de elektroforesetank. Voer deze stap uit in het donker gedurende 15 minuten bij 4 °C om het DNA te laten afwikkelen. Voer na het afwikkelen van nucleair DNA elektroforese uit op dezelfde buffer bij een temperatuur van 4 °C gedurende 10 minuten bij 25 V en 250 mA.
    8. Neutraliseer aan het einde van de elektroforese de monsters in de objectglaasjes 3 x 5 min door 2 ml Tris-HCl-oplossing toe te voegen (tabel 1).
    9. In de laatste stap van de komeetanalysetechniek droogt u de monsters uit door de monsters in 100 ml Optlin-potten met alcohol (95%) bij 4 °C te plaatsen.
    10. Kleurt ten slotte de monsters door 10 μL 4′,6-diamino-2-fenylindool (DAPI) in het midden van het objectglaasje te plaatsen en plaats een dekglaasje dat de kleurstof door de monsters verspreidt. Bestudeer de objectglaasjes onder een fluorescentiefotomicroscoop met een WB-filter.
      LET OP: Het hele proces moet in het donker worden uitgevoerd om DNA-fotodegradatie te voorkomen.
    11. Kwantificeer de DNA-schade door de lengte van de DNA-migratie van de nucleoïde te evalueren. Bepaal het in dit geval visueel op 100 willekeurig geselecteerde cellen zonder overlapping. Classificeer de DNA-schade in vier klassen: 0-I (geen schade), II (minimale schade), III (gemiddelde schade) en IV (maximale schade). Druk de gegevens uit als het gemiddelde aantal beschadigde cellen (som van de klassen II-IV) en de gemiddelde komeetscore voor elke behandelingsgroep. Bereken op basis van deze gegevens de genetische schade-index (GDI) voor elk testorganisme met behulp van de volgende vergelijking (8):
      GDI = (1[I] + 2[II] + 3[III] + 4[IV])/N[I-IV]) (8)
      waarbij I-IV het type nucleoïde schade vertegenwoordigt en NI-NIV het totale aantal nucleoïden vertegenwoordigt dat is gescoord volgens Pitarque et al.40.

5. Gecorreleerde biomarkers

OPMERKING: In recente tijden kunnen biomarkers op alle niveaus worden geïntegreerd door gebruik te maken van de biomarker response (IBR) index voorgesteld door Beliaeff en Burgeot49 en aangepast voor neotropische anura's. De IBR biedt een numerieke waarde die alle biomarkerresponsen integreert; hogere IBR-waarden duiden op hogere stressniveaus49. In termen van de IBR-schatting voor een bepaald station of de behandeling van een bepaalde enquête zijn de opeenvolgende gegevensverwerkingsstappen om de eindscore te bepalen als volgt:

  1. Bereken de gemiddelde schatting (X) wanneer individuele resultaten beschikbaar zijn; Gebruik anders de waarde van de gepoolde steekproef bij elk bemonsteringsstation.
  2. Bereken voor elke biomarker het algemene gemiddelde (m) en de standaarddeviatie (s) van X voor alle stations en/of onderzoeken, afhankelijk van de te maken vergelijkingen.
  3. Standaardiseer X om Y te verkrijgen . Bereken een waarde met de naam Y: Y = (X- m)/s.
  4. Bereken de Z-waarde als volgt: Z = Y of Z = −Y, in het geval van een biologisch effect dat respectievelijk overeenkomt met remming of activering als reactie op een stressor.
  5. Bereken ten slotte de score (S), met S = Z + |Min|, waarbij S ≥ 0 en |Min| is de absolute minimumwaarde die is bepaald.
  6. Plot een spin- of sterdiagram na het berekenen van de waarde van S voor elke biomarker (Si) en het uitvoeren van de summatory om de IBR te verkrijgen.
    OPMERKING: raadpleeg het originele document49 voor alle details van de berekeningen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle biomarkertechnieken die hier worden gepresenteerd, zijn eenvoudige, snelle, handige, gevoelige, goedkope en nauwkeurige methoden. Voor elke biomarker is het belangrijk om het volgende op te merken.

Individueel niveau
Geschaalde massa-index
Het maken van foto's op millimeterschaal is van groot belang, aangezien deze waarde zal worden gebruikt om de software te kalibreren, en dit resulteert in een betere objectiviteit...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De biomarkers op individueel niveau zijn zeer eenvoudig te bepalen en zeer goedkoop, aangezien voor het onderzoeken van deze biomarkers slechts een paar apparaten nodig zijn die gewoonlijk in elk onderzoekslaboratorium beschikbaar zijn. Daarnaast geven deze biomarkers algemene informatie over de gezondheid en fitheid van de dieren. Het aantal dieren dat in elk protocol wordt gebruikt, is van cruciaal belang voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten. Vanwege de variabiliteit van de g...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs zijn dankbaar voor het Instituto de Química de San Luis "Dr. Roberto Olsina"- Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (INQUISAL-CONICET), Universidad Nacional de San Luis (Project PROICO 2-1914), Laboratório de Patologia Experimental (LAPEx) - Instituto de Biociências (INBIO) - Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS), Cátedra de Citología - Universidad Nacional de La Plata (UNLP) en Agencia Nacional de Promoción Científica (FONCYT; PICT-2018-02570 en PICT-2018-01067) voor financiële steun. We willen ook native speaker Lidia Unger en GAECI-UNSL (scientific writing assistance center) van de National University of San Luis bedanken voor het proeflezen van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Analytische schaal
Elektroforese voeding Enduro E0203-250V 
Eosine Merck
Fluorescentie fotomicroscoop Olympus BX50Uitgerust met een geschikte filtercombinatie
Hematoxylinen van HarrisMerck
Hoge resolutie fotocamera  >16 megapixels
Homogenisator
Horizontale elektroforese kamer Sigma
MicrocentrifugeDenver Instrument
MicroscoopLeicaDM4000 BUitgerust met beeldopname systeem Leica DFC 280
MicrotoomLeica2265
ParaplastSigmaP3558
Persoonlijke computer Uitgerust met Mac OS X, Lynux of Windows
Gekoelde centrifuge
UV–Vis spectrofotometerRayleigh723GMet UV-lamp

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hook, S. E., Gallagher, E. P., Batley, G. E. The role of biomarkers in the assessment of aquatic ecosystem health. Integrated Environmental Assessment and Management. 10 (3), 327-341 (2014).
  2. Connon, R. E., et al. Linking mechanistic and behavioral responses to sublethal esfenvalerate exposure in the endangered delta smelt; Hypomesus transpacificus (Fam. Osmeridae). BMC Genomics. 10, 608(2009).
  3. Scholz, N. L., et al. A perspective on modern pesticides, pelagic fish declines, and unknown ecological resilience in highly managed ecosystems. Bioscience. 62 (4), 428-434 (2012).
  4. Forbes, V. E., Palmqvist, A., Bach, L. The use and misuse of biomarkers in ecotoxicology. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (1), 272-280 (2006).
  5. Newman, M. C. Fundamentals of Ecotoxicology: The Science of Pollution., Fifth edition. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2019).
  6. Walker, C. Ecotoxicology: Effects of Pollutants on the Natural Environment. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2014).
  7. Venturino, A., et al. Biomarkers of effect in toads and frogs. Biomarkers. 8 (3-4), 167-186 (2003).
  8. Lajmanovich, R. C., et al. Técnicas para el relevamiento de anfibios en ambientes contaminados. Manual de Técnicas y Protocolos para el Relevamiento y Estudio de Anfibios de Argentina., 1a Edition. , Universidad Nacional de Jujuy. San Salvador de Jujuy, Argentina. (2021).
  9. Vander Oost, R., Beyer, J., Vermeulen, N. P. Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment: A review. Environmental Toxicology and Pharmacology. 13 (2), 57-149 (2003).
  10. Pérez-Iglesias, J. M., González, P., Calderón, M. R., Natale, G. S., Almeida, C. A. Comprehensive evaluation of the toxicity of the flame retardant (decabromodiphenyl ether) in a bioindicator fish (Gambusia affinis). Environmental Science and Pollution Research. 29 (33), 50845-50855 (2022).
  11. Bickham, J. W., Sandhu, S., Hebert, P. D., Chikhi, L., Athwal, R. Effects of chemical contaminants on genetic diversity in natural populations: Implications for biomonitoring and ecotoxicology. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 463 (1), 33-51 (2000).
  12. Adams, S. M., Ham, K. D. Application of biochemical and physiological indicators for assessing recovery of fish populations in a disturbed stream. Environmental Management. 47 (6), 1047-1063 (2011).
  13. Rautenberg, G. E., Amé, M. V., Monferrán, M. V., Bonansea, R. I., Hued, A. C. A multi-level approach using Gambusia affinis as a bioindicator of environmental pollution in the middle-lower basin of Suquía River. Ecological Indicators. 48, 706-720 (2015).
  14. Larramendy, M. L. Ecotoxicology and Genotoxicology: Non-Traditional Terrestrial Models. , Royal Society of Chemistry. London, UK. (2017).
  15. Guilherme, S., Gaivão, I., Santos, M. A., Pacheco, M. DNA damage in fish (Anguilla anguilla) exposed to a glyphosate-based herbicide-elucidation of organ-specificity and the role of oxidative stress. Mutation Research. 743 (1-2), 1-9 (2012).
  16. Lajmanovich, R. C., et al. Harmful effects of the dermal intake of commercial formulations containing chlorpyrifos, 2, 4-D, and glyphosate on the common toad Rhinella arenarum (Anura: Bufonidae). Water, Air, & Soil Pollution. 226 (12), 427(2015).
  17. Pérez-Iglesias, J. M., de Arcaute, C. R., Natale, G. S., Soloneski, S., Larramendy, M. L. Evaluation of imazethapyr-induced DNA oxidative damage by alkaline Endo III-and Fpg-modified single-cell gel electrophoresis assay in Hypsiboas pulchellus tadpoles (Anura, Hylidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 142, 503-508 (2017).
  18. Carvalho, W. F., et al. DNA damage exerted by mixtures of commercial formulations of glyphosate and imazethapyr herbicides in Rhinella arenarum (Anura, Bufonidae) tadpoles. Ecotoxicology. 28 (3), 367-377 (2019).
  19. Jacobsen-Pereira, C. H., et al. Markers of genotoxicity and oxidative stress in farmers exposed to pesticides. Ecotoxicology and Environmental Safety. 148, 177-183 (2018).
  20. Bartell, S. M. Biomarkers, bioindicators, and ecological risk assessment-A brief review and evaluation. Environmental Bioindicators. 1 (1), 60-73 (2006).
  21. Hamza-Chaffai, A. Usefulness of bioindicators and biomarkers in pollution biomonitoring. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 3 (1), 19-26 (2014).
  22. Kacoliris, F. P., et al. Current threats faced by amphibian populations in the southern cone of South America. Journal for Nature Conservation. 69, 126254(2022).
  23. Sparling, D. W., Linder, G., Bishop, C. A., Krest, S. K. Ecotoxicology of Amphibians and Reptiles. , SETAC Books. Boca Raton, FL. (2010).
  24. Kiesecker, J. M., Blaustein, A. R., Belden, L. K. Complex causes of amphibian population declines. Nature. 410 (6829), 681-684 (2001).
  25. Brühl, C. A., Schmidt, T., Pieper, S., Alscher, A. Terrestrial pesticide exposure of amphibians: An underestimated cause of global decline. Scientific Reports. 3, 1135(2013).
  26. Wagner, N., Lötters, S., Veith, M., Viertel, B. Effects of an environmentally relevant temporal application scheme of low herbicide concentrations on larvae of two anuran species. Chemosphere. 135, 175-181 (2015).
  27. Peig, J., Green, A. J. New perspectives for estimating body condition from mass/length data: the scaled mass index as an alternative method. Oikos. 118 (12), 1883-1891 (2009).
  28. Brodeur, J. C., et al. Frog body condition: Basic assumptions, comparison of methods and characterization of natural variability with field data from Leptodactylus latrans. Ecological Indicators. 112, 106098(2020).
  29. MacCracken, J. G., Stebbings, J. L. Test of a body condition index with amphibians. Journal of Herpetology. 46 (3), 346-350 (2012).
  30. Brodeur, J. C., et al. Frog somatic indices: Importance of considering allometric scaling, relation with body condition and seasonal variation in the frog Leptodactylus latrans. Ecological Indicators. 116, 106496(2020).
  31. Carson, A. F., Hladik, L. C. Histotechnology: A Self-Instructional Text. , American Society for Clinical Pathology Press. Hong Kong. (2009).
  32. Bernet, D., Schmidt, H., Meier, W., Burkhardt-Holm, P., Wahli, T. Histopathology in fish: Proposal for a protocol to assess aquatic pollution. Journal of Fish Diseases. 22 (1), 25-34 (1999).
  33. Santos, L. R. D. S., Franco-Belussi, L., Zieri, R., Borges, R. E., de Oliveira, C. Effects of thermal stress on hepatic melanomacrophages of Eupemphix nattereri (Anura). Anatomical Record. 297 (5), 864-875 (2014).
  34. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  35. Aebi, H. Catalase in vitro. Methods in Enzymology. 105, 121-126 (1984).
  36. Habig, W. H., Pabst, M. J., Jakoby, W. B. Glutathione S-transferases: The first enzymatic step in mercapturic acid formation. Journal of Biological Chemistry. 249 (22), 7130-7139 (1974).
  37. Buege, J. A., Aust, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).
  38. Ellman, G. L., Courtney, K. D., Andres, V., Featherstone, R. M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochemical Pharmacology. 7 (2), 88-95 (1961).
  39. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
  40. Pitarque, M., et al. Evaluation of DNA damage by the Comet assay in shoe workers exposed to toluene and other organic solvents. Mutation Research. 441 (1), 115-127 (1999).
  41. Nersesyan, A., Kundi, M., Atefie, K., Schulte-Hermann, R., Knasmuller, S. Effect of staining procedures on the results of micronucleus assays with exfoliated oral mucosa cells. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention. 15 (10), 1835-1840 (2006).
  42. Pérez-Iglesias, J. M., Brodeur, J. C., Larramendy, M. An imazethapyr-based herbicide formulation induces genotoxic, biochemical, and individual organizational effects. Leptodactylus latinasus tadpoles (Anura: Leptodactylidae). Environmental Science and Pollution Research. 27 (2), 2131-2143 (2020).
  43. Pérez-Iglesias, J. M., et al. Multiple level effects of imazethapyr on Leptodactylus latinasus (Anura) adult frogs. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 81 (3), 492-506 (2021).
  44. Pérez-Iglesias, J. M., et al. The genotoxic effects of the imidacloprid-based insecticide formulation Glacoxan Imida on Montevideo tree frog Hypsiboas pulchellus tadpoles (Anura, Hylidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 104, 120-126 (2014).
  45. Jha, A. N. Ecotoxicological applications and significance of the comet assay. Mutagenesis. 23 (3), 207-221 (2008).
  46. Garber, J. C., Barbee, R. W., Bielitzki, J. T. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  47. Council, N.S.a.T.R. (Ed.). Reference Ethical Framework for Biomedical Research: Ethical Principles for Research with Laboratory, Farm, and Wild Animals. CONICET. , (2005).
  48. INTA. Guía para cuidado y uso de animales para experimentación. INTA. , Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), Secretaría de Agricultura. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias, Ganadería, Pesca y Alimentación, República Argentina. (2008).
  49. Beliaeff, B., Burgeot, T. Integrated biomarker response: A useful tool for ecological risk assessment. Environmental Toxicology and Chemistry. 21 (6), 1316-1322 (2002).
  50. Pérez-Iglesias, J. M., Natale, G. S., Brodeur, J. C., Larramendy, M. L. Realistic scenarios of pesticide exposure alters multiple biomarkers in BOANA PULCHELLA (ANURA) adult frogs. Ecotoxicology. , (2023).
  51. Bassó, A., Devin, S., Peltzer, P. M., Attademo, A. M., Lajmanovich, R. C. The integrated biomarker response in three anuran species larvae at sublethal concentrations of cypermethrin, chlorpyrifos, glyphosate, and glufosinate-ammonium. Journal of Environmental Science, Part B. 57 (9), 687-696 (2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ecotoxicologische biomarkersComet assayoxidatieve stressenzymenlichaamsconditie indexhistopathologische analysepigmentanalysecatalaseactiviteitDNA schadebeoordelingmilieurisicobeoordeling

Gerelateerde artikelen