Gene digitale circuits op basis van CRISPR-Cas-systemen en anti-CRISPR-eiwitten

Samenvatting

CRISPR-Cas-systemen en anti-CRISPR-eiwitten werden geïntegreerd in het schema van Booleaanse poorten in Saccharomyces cerevisiae. De nieuwe kleine logische circuits toonden goede prestaties en verdiepten het begrip van zowel op dCas9/dCas12a gebaseerde transcriptiefactoren als de eigenschappen van anti-CRISPR-eiwitten.

Samenvatting

Synthetisch gen Booleaanse poorten en digitale circuits hebben een breed scala aan toepassingen, van medische diagnostiek tot milieuzorg. De ontdekking van de CRISPR-Cas-systemen en hun natuurlijke remmers - de anti-CRISPR-eiwitten (Acrs) - biedt een nieuw hulpmiddel om in vivo digitale gencircuits te ontwerpen en te implementeren. Hier beschrijven we een protocol dat het idee van de "Design-Build-Test-Learn" biologische engineeringcyclus volgt en gebruik maakt van dCas9 / dCas12a samen met hun bijbehorende Acrs om kleine transcriptionele netwerken op te zetten, waarvan sommige zich gedragen als Booleaanse poorten, in Saccharomyces cerevisiae. Deze resultaten wijzen op de eigenschappen van dCas9/dCas12a als transcriptiefactoren. In het bijzonder, om maximale activering van genexpressie te bereiken, moet dSpCas9 interageren met een gemanipuleerd steiger-RNA dat meerdere kopieën van het VP64-activeringsdomein (AD) verzamelt. Daarentegen wordt dCas12a bij het C-eindpunt gefuseerd met het sterke VP64-p65-Rta (VPR) AD. Bovendien wordt de activiteit van beide Cas-eiwitten niet versterkt door de hoeveelheid sgRNA/crRNA in de cel te verhogen. In dit artikel wordt ook uitgelegd hoe u Booleaanse poorten kunt bouwen op basis van de CRISPR-dCas-Acr-interactie. Het AcrIIA4 gefuseerde hormoonbindende domein van de menselijke oestrogeenreceptor is de kern van een NOT-poort die reageert op β-oestradiol, terwijl AcrVA's gesynthetiseerd door de induceerbare GAL1-promotor het mogelijk maken om zowel JA- als NOT-poorten na te bootsen met galactose als input. In de laatste circuits vertoonde AcrVA5, samen met dLbCas12a, het beste logische gedrag.

Inleiding

In 2011 stelden onderzoekers een computationele methode voor en ontwikkelden een bijbehorend stuk software voor het automatische ontwerp van digitale synthetische gencircuits¹. Een gebruiker moest het aantal ingangen (drie of vier) opgeven en de waarheidstabel van het circuit invullen; Dit leverde alle benodigde informatie op om de circuitstructuur af te leiden met behulp van technieken uit elektronica. De waarheidstabel werd vertaald in twee Booleaanse formules via de Karnaugh-kaartmethode². Elke Booleaanse formule bestaat uit clausules die logische bewerkingen (som of vermenigvuldiging) beschrijven tussen (een deel van) de circuitingangen en hun negaties (de letterlijke elementen). Clausules worden op hun beurt opgeteld (OF) of vermenigvuldigd (EN) om de circuituitgang te berekenen. Elk circuit kan worden gerealiseerd volgens een van de twee overeenkomstige formules: een geschreven in POS-vorm (product van sommen) en de andere in SOP-representatie (som van producten). De eerste bestaat uit een vermenigvuldiging van clausules (d.w.z. Booleaanse poorten) die een logische som van de letterlijke poorten bevatten. Dit laatste daarentegen is een optelsom van clausules waarbij de letterlijke woorden worden vermenigvuldigd.

Elektrische circuits kunnen worden gerealiseerd, op een breadboard, door verschillende poorten fysiek met elkaar te bedraden. De elektrische stroom maakt de uitwisseling van signalen tussen poorten mogelijk, wat leidt tot de berekening van de uitgang.

In de biologie is de situatie complexer. Een Booleaanse poort kan worden gerealiseerd als een transcriptie-eenheid (TU; d.w.z. de sequentie "promotor-coderende regio-terminator" in eukaryote cellen), waar transcriptie of translatie (of beide) worden gereguleerd. Zo vormen ten minste twee soorten moleculen een biologische bedrading: de transcriptiefactoreiwitten en de niet-coderende, antisense RNA's¹.

Een gen digitaal circuit is georganiseerd in twee of drie lagen poorten, namelijk: 1) de ingangslaag, die is gemaakt van YES (buffer) en NOT poorten en zet de input chemicaliën om in bedradingsmoleculen; 2) de interne laag, die bestaat uit evenveel TU's als er clausules zijn in de overeenkomstige Booleaanse formule. Als het circuit is ontworpen volgens de SOP-formule, produceert elke clausule in de interne laag de circuituitgang (bijvoorbeeld fluorescentie) in een zogenaamde gedistribueerde uitgangsarchitectuur. Als het product van de som (POS) -formule wordt gebruikt, is een 3) laatste laag vereist, die een enkele multiplicatieve poort bevat die de bedradingsmoleculen van de interne laag verzamelt.

Over het algemeen kunnen in de synthetische biologie veel verschillende schema's worden ontworpen voor hetzelfde circuit. Ze verschillen in het aantal en het soort van zowel TU's als bedradingsmoleculen. Om de eenvoudigste oplossing te kiezen die in gistcellen kan worden geïmplementeerd, wordt elk circuitontwerp geassocieerd met een complexiteitsscore S, gedefinieerd als

waarbij A staat voor het aantal activatoren, R voor het aantal repressoren en a voor de hoeveelheid antisense RNA-moleculen. Als activators of repressors afwezig zijn in het circuit, is hun bijdrage aan S nul. Daarom is het moeilijker om een circuitschema in het laboratorium (hoge S) te realiseren wanneer het een groot aantal orthogonale transcriptiefactoren vereist. Dit betekent dat nieuwe activatoren en repressors de novo moeten worden ontworpen om de volledige bedrading in de digitale circuits te realiseren. In principe kunnen nieuwe DNA-bindende eiwitten worden samengesteld met behulp van Zinc Finger-eiwitten³ en TAL-effectoren⁴ als sjablonen. Deze optie lijkt echter te zwaar en tijdrovend; daarom moet men vooral vertrouwen op kleine RNA's en translatieregulatie om complexe gencircuits te voltooien.

Oorspronkelijk werd deze methode ontwikkeld om digitale schakelingen in bacteriën te fabriceren. Inderdaad, in eukaryote cellen is het in plaats van antisense RNA's geschikter om te spreken van microRNA's (miRNA's) of kleine interfererende RNA's (siRNA's)⁵. De RNAi-route is echter niet aanwezig in de gist S. cerevisiae. Daarom moet men kiezen voor volledig transcriptionele netwerken. Stel dat een circuit vijf activators en vijf repressors nodig heeft; de complexiteitsscore zou S = 32 zijn. De complexiteit van het circuit kan worden verminderd door de 10 transcriptiefactoren te vervangen door een enkele dCas9⁶ (nuclease-deficiënt Cas9) gefuseerd tot een activeringsdomein (AD). Zoals getoond in⁷, werkt dCas9-AD als een repressor in gist bij het binden van een promotor tussen de TATA-box en de TSS (transcriptiestartplaats) en als een activator bij het goed binden stroomopwaarts van de TATA-box. Zo kan men 10 transcriptiefactoren vervangen door een enkel dCas9-AD fusie-eiwit en 10 sgRNA's (single guide RNA's) voor een totale complexiteitsscore van S = 11. Het is snel en gemakkelijk om tien sgRNA's te synthetiseren, terwijl, zoals eerder opgemerkt, de assemblage van 10 eiwitten veel langer en ingewikkelder werk zou vereisen.

Als alternatief kan men twee orthogonale dCas-eiwitten gebruiken (bijv. dCas9 en dCas12a): één om te fuseren tot een AD, en de andere kaal of in combinatie met een repressiedomein. De complexiteitsscore zou met slechts één eenheid toenemen (S = 12). Vandaar dat CRISPR-dCas-systemen de sleutel zijn tot de constructie van zeer ingewikkelde digitale gencircuits in S. cerevisiae.

Dit artikel karakteriseert diep de efficiëntie van zowel dCas9- als dCas12a-gebaseerde repressoren en activatoren in gist. De resultaten tonen aan dat ze geen hoge hoeveelheid sgRNA nodig hebben om hun activiteit te optimaliseren, dus episomale plasmiden worden bij voorkeur vermeden. Bovendien zijn op dCas9 gebaseerde activatoren veel effectiever bij het gebruik van een steiger-RNA (scRNA) dat kopieën van de VP64 AD rekruteert. Daarentegen werkt dCas12a goed wanneer het rechtstreeks is samengevoegd met de sterke VPR AD. Bovendien vereist een synthetisch geactiveerde promotor een variabel aantal doellocaties, afhankelijk van de configuratie van de activator (bijvoorbeeld drie bij gebruik van dCas12a-VPR, zes voor dCas9-VP64 en slechts één met dCas9 en een scRNA). Als repressor lijkt dCas12a scherper bij het binden van het coderende gebied in plaats van de promotor.

Als nadeel hebben CRISPR-dCas9/dCas12a echter geen directe interactie met chemicaliën. Daarom kunnen ze van geen nut zijn in de invoerlaag. Om deze reden zijn alternatieve Booleaanse poortontwerpen met anti-CRISPR-eiwitten (Acrs) onderzocht. Acrs werken in op (d)Cas-eiwitten en remmen hun werking⁸. Daarom zijn ze een middel om de activiteit van CRISPR-(d)Cas-systemen te moduleren. Dit artikel analyseert grondig de interacties tussen type II Acrs en (d)Cas9, evenals type V Acrs en (d)Cas12a in S. cerevisiae. Omdat Acrs veel kleiner zijn dan Cas-eiwitten, werd een NOT-poort die reageert op het oestrogeen β-estradiol gebouwd door het hormoonbindende domein van de menselijke oestrogeenreceptor^9-HBD (hER) - te fuseren met AcrIIA4. Daarnaast werden een handvol JA- en NOT-poorten gerealiseerd die dCas12a(-AD) constitutief en AcrVA's uitdrukten bij inductie met galactose. Op dit moment dienen deze poorten alleen als proof of concept. Ze vertegenwoordigen echter ook de eerste stap naar een diepgaande heroverweging van het algoritme om het computationele automatische ontwerp van synthetische gen-digitale circuits in gistcellen uit te voeren.

Protocol

1. Ontwerp en constructie van de sgRNA/crRNA expressie cassette

OPMERKING: Er zijn twee soorten sgRNA/crRNA-expressiecassettes: SNR52^10-met één term bestaat uit de RNA-polymerase III-afhankelijke SNR52-promotor, de sgRNA/crRNA-sequentie en de SUP4-terminator; een andere - afgekort als RGR¹¹ - bestaat uit de RNA polymerase II-afhankelijke ADH1 promotor, de RGR (ribozym-guide RNA-ribozym) structuur die twee ribozymen bevat (een hamerkop ribozym-HH, en een hepatitis delta virus ribozym-HDV) en de sequentie van het sgRNA/crRNA daartussenin, en de ADH1 terminator. De sgRNA-leidende Cas9-homologen zijn gemaakt van een spacersequentie en de karakteristieke directe herhaling¹², terwijl het crRNA voor Cas12a-eiwitten de directe herhaling omvat gevolgd door de spacersequentie^13,14 (zie aanvullende tabel 1 voor alle DNA-sequenties die in deze studie worden gebruikt).

1. Ontwerp de spacersequentie voor Cas9/Cas12a-gemedieerde transcriptionele activering.
   1. Gebruik de bacteriële lexoperatorsequentie (lexOp genaamd) om de doellocatie^15,16 te zijn en plaats deze in de CYC1-promotor die de expressie van het met gist versterkte groene fluorescerende eiwit (yEGFP) aandrijft17. Daarom wordt de spacer-reeks gedefinieerd door en complementair aan de ingevoegde lexOp.
2. Controleer de orthogonaliteit van de afstandsvolgorde via het CRISPRDIRECT-gereedschap¹⁸.
   1. Plak de lexOp-sequentie geflankeerd door de PAM-reeks in het tekstveld, definieer de PAM-sequentie als NRG voor dCas9 en TTTV voor dCas12a en geef de soort uit de vervolgkeuzelijst op als Budding Yeast (Saccharomyces cerevisiae) S288C Genome. Klik op Ontwerpen. Zorg ervoor dat er geen overeenkomende doelsite is in 20mer + PAM of in 12mer + PAM-zoekopdracht.
3. Construeer de sgRNA/crRNA-expressiecassette.
   1. Gebruik touchdown PCR om de DNA-sequenties van standaard biologische delen te versterken, zoals promotors, coderende sequenties en terminators.
      1. Bereid een reactiemengsel dat bestaat uit: 20-40 ng DNA-sjabloon, 1 μL 10 μM voorwaartse primer (d.w.z. ot25, sgRNA/crRNA-expressieplasmideconstructie), 1 μL 10 μM omgekeerde primer (d.w.z. ot26, sgRNA/crRNA-expressieplasmideconstructie), 5 μL 2,5 mM dNTP-mix, 0,5 μL DNA-polymerase, 10 μL 5x DNA-polymerasereactiebuffer, en dubbel gedestilleerd water (ddH₂O) tot een totaal volume van 50 μL.
         OPMERKING: Zie aanvullende tabel 2 voor een lijst van primers die in dit onderzoek zijn gebruikt.
      2. Voer het touchdown PCR-programma uit op een thermocycler:
         Fase 1: 98 °C gedurende 30 s.
         Fase 2 met 10 cycli: 98 °C gedurende 10 s, 68 °C gedurende 20 s en 72 °C gedurende 15 s.
         Fase 3 met 25 cycli: 98 °C gedurende 10 s, 59 °C gedurende 20 s en 72 °C gedurende 15 s.
         Etappe 4: 72 °C gedurende 2 min.
         Houd ten slotte op 4 °C totdat de vervolgexperimenten worden gestart.
         OPMERKING: De 68 °C in fase 2 en 59 °C in fase 3 zijn afhankelijk van de smelttemperaturen van zowel voorwaartse als omgekeerde primers, variërend van verschillende paren primers. De tijd bij 72 °C in fase 2 en 3 wordt bepaald door de lengte van het PCR-product en de snelheid van het DNA-polymerase.
   2. Isoleer de PCR-producten via gelelektroforese (100 V, 30 min). Elueer de DNA-sequenties uit de agarosegel via een DNA-gelextractiekit (zie materiaaltabel).
      OPMERKING: Een 0,8% agarosegel is vereist voor fragmenten langer dan 500 nt, een 1,5% agarosegel voor fragmenten tussen 100 nt en 500 nt en een 2% agarosegel voor fragmenten korter dan 100 nt.
   3. Plaats de TU die sgRNA/crRNA tot expressie brengt in een pRSII404/424 shuttlevector¹⁹, die het ampicillineresistentiegen en het gistselecteerbare auxotrofe markergen-TRP1 bevat.
      1. Vergist de shuttlevector bij 37 °C gedurende 1 uur met de twee restrictie-enzymen SacI en Acc65I. Bereid het reactiemengsel door 5 μg van de shuttlevector, de aanbevolen hoeveelheden enzymen, de verteringsbuffer (volgens de enzyminstructies) en ddH₂O toe te voegen tot een totaal volume van 30 μL.
      2. Controleer de shuttlevectorvertering via gelelektroforese (zie substap 1.3.2). Inactiveer vervolgens de twee enzymen bij 65 °C gedurende 20 minuten.
      3. Gebruik de Gibson-assemblagemethode 20 om de gezuiverde PCR-producten in de opengesneden shuttlevector in te brengen door het equimolaire DNA-mengsel gedurende 1 uur bij⁵⁰ °C binnen te laten.
      4. Transformeer Escherichia coli DH5α competente cellen met het bovenstaande Gibson reactiemengsel via de heat shock transformatiemethode²¹. Breng de getransformeerde E. coli-cellen over op Luria-Bertani (LB) agarplaten die ampicilline bevatten (0,1 g / L). Plaats de platen in de couveuse bij 37 °C en laat de cellen een nacht groeien.
      5. Pluk vier kolonies uit de LB-agarplaat en kweek ze afzonderlijk gedurende een nacht bij 37 °C in een LB-oplossing die ampicilline bevat (0,1 g/l). Gebruik vervolgens de mini-voorbereidingsprocedure om plasmiden uit de E. coli-cellen te extraheren²².
      6. Gebruik de primers ot18 en ot19 (zie aanvullende tabel 2 voor oligosequenties) om de ingevoegde transcriptie-eenheid te sequencen en te bevestigen via de Sanger-methode²³.
         OPMERKING: In latere experimenten zullen de geconstrueerde en bevestigde plasmiden via het PEG/LiAc-protocol²⁴ in het gistgenoom worden ingebracht.

2. Ontwerp en bouw van de steiger RNA-expressiecassette

OPMERKING: Het scaffold guide RNA (scRNA) bestaat uit de sgRNA-sequentie en de MS2-haarspeldstructuren²⁵. Twee soorten MS2 haarspeldstructuren worden gebruikt in dit werk: wild-type MS2 hairpin-wt, en f6 MS2 coat protein (MCP) aptamer-f6.

1. Synthetiseer een scRNA-sjabloon die geschikt is voor verschillende spacersequenties (d.w.z. pSNR52-spacer_DR(SpCas9)-2×MS2(wt+f6)-SUP4t).
   OPMERKING: In deze studie werd het scRNA-sjabloon gesynthetiseerd door een gensynthesebedrijf (zie tabel met materialen).
2. Ontwerp de juiste primers (zie aanvullende tabel 2) om PCR uit te voeren op de benodigde afstandsreeksen.
3. Volg de procedures in stap 1.3 om een scRNA-expressiecassette te maken.

3. dSpCas9 engineering en expressie plasmide constructie

1. Verkrijg het plasmide pTPGI_dSpCas9_VP64 (zie tabel met materialen).
2. Construeer de acceptorvector pRSII406-pGPD-ATG-XbaI-XhoI-CYC1t, gebaseerd op de pRSII406 shuttlevector, via touchdown PCR en de Gibson-assemblagemethode (zie stap 1.3). Het plasmide biedt een sterke constitutieve promotor-pGPD en een terminator-CYC1t.
3. Verwerk het pTPGI_dCas9_VP64 plasmide en de nieuw geconstrueerde acceptorvector (5 μg gedurende 1 uur of 10 μg gedurende de nacht - zie stap 1.3.3.1 als referentie) met XbaI en XhoI bij 37 °C. Scheid en zuiver het inlegfragment en de acceptorvector zoals in stap 1.3.2.
4. Ligate het gezuiverde insertfragment en de acceptorvector met T4 DNA-ligase bij 16 °C gedurende 8 uur. Bereid de ligatieoplossing door 50-100 ng van de gezuiverde acceptorvector, gezuiverde doelfragmenten in equimolaire hoeveelheid met de acceptorvector, 1,5 μL T4-buffer, 0,5 μL T4-ligase en ddH₂O toe te voegen tot een totaal volume van 15 μL.
5. Volg de stappen 1.3.3.3 en 1.3.3.4. Bevestig vervolgens dat het nieuw geconstrueerde plasmide correct is door vertering met XbaI en Xhol (37 °C, 1 uur) en gelelektroforese (zie stap 1.3.2).

4. dCas12a engineering en plasmidebouw

1. Construeer de plasmiden die dCas12a-AD tot expressie brengen.
   1. Synthetiseer twee gistcodon-geoptimaliseerde dCas12a-eiwitten (denAsCas12a en dLbCas12a) geflankeerd door BamHI- en Xhol-restrictie-enzymplaatsen.
      OPMERKING: In deze studie werden de twee voor gistcodon geoptimaliseerde dCas12a-eiwitten gesynthetiseerd door een gensynthesebedrijf (zie tabel met materialen).
   2. Construeer de acceptorvector pRSII406-promoter-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-AD-NLS-TAA-mTGUO1 via touchdown PCR en de Gibson-assemblagemethode (zie stap 1.3), waarbij de "promotor" pGPD of pGAL1 is, "sp" een korte willekeurige reeks vertegenwoordigt en "AD" VPR of VP64 is.
   3. Breng elk dCas12a-eiwit in de twee nieuw geconstrueerde acceptorvectoren in via vertering met BamHI en XhoI en ligatie met T4 DNA-ligase (zie stap 3.3 en 3.4).
2. Construeer de plasmiden die een kale dCas12a uitdrukken.
   1. Construeer een acceptorvector voor de galactose-induceerbare expressiecassettes van dCas12a als pRSII406-Acc651-pGAL1-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-sp-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t met behulp van touchdown PCR en de Gibson-assemblagemethode (zie stap 1.3).
   2. Verwerk de plasmiden die de dCas12a-eiwitten en de bovenstaande acceptorvector bevatten met BamHI en Xhol en ligate ze vervolgens met T4 DNA-ligase om het plasmide pRSII406-pGAL1-Acc651-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t te krijgen (zie stap 3.3 en 3.4).
   3. Verwerk het plasmide verkregen in stap 4.2.2 met Acc65I en BamHI, en vervang vervolgens pGAL1 door pGPD via touchdown PCR en de Gibson-assemblagemethode om pRSII406-pGPD-ATG-NLS-GS-HIStag-GS-BamHI-dCas12a-XhoI-GS-NLS-TAA-CYC1t te construeren.

5. Anti-CRISPR eiwit engineering en plasmide constructie

OPMERKING: Er zijn drie soorten promotors gebruikt om Acrs-expressie te stimuleren: een induceerbare promotor-pGAL1, vier gistconstitutieve promotors-pGPD, pACT1, pTEF1 en pTEF2, en een synthetische constitutieve promotor-genCYC1t_pCYC1noTATA²⁶.

1. Verkrijg de plasmiden met de sequenties van type II Acrs (AcrIIA2, AcrIIA4²⁷ en AcrIIA5 28) en type V-A Acrs (AcrVA1, AcrVA4 en AcrVA5²⁹) van een gensynthesebedrijf.
2. Construeer de plasmiden op basis van de pRSII403 shuttle vector om Acrs uit te drukken.
   1. Maak AcrIIA-expressiecassettes.
      OPMERKING: Gebruik touchdown PCR om vier verschillende promotors (d.w.z. pGPD, pACT1, pTEF2 en genCYC1t_pCYC1noTATA), de drie soorten AcrIIA en twee terminators (ADH1t en CYC1t) te versterken. Bouw een reeks TU's die AcrIIAs uitdrukken, onder verschillende promotors, via de Gibson-assemblagemethode (zie stap 1.3).
   2. Maak AcrVA-expressiecassettes.
      1. Synthetiseer de acceptorsequentie: ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, waarbij "sp" een willekeurige sequentie is die later zal worden vervangen door AcrVA's.
         OPMERKING: In deze studie werden de acceptorsequenties gesynthetiseerd door een gensynthesebedrijf (Table of Materials).
      2. Verzamel de acceptorvectoren pRSII403-promoter-ATG-FLAGtag-GS-BamHI-sp-XhoI-NLS-GS-NLS-TAA-Tsynth6, waarbij de "promotor" is: pGAL1, pTEF1 en genCYC1t_pCYC1noTATA. Gebruik de Gibson-assemblagemethode (zie stap 1.3).
      3. Plaats elk van de drie AcrVA's in de acceptorvector beschreven in stap 5.2.2.2 (via touchdown PCR en de Gibson-assemblagemethode [zie stap 1.3]) om een set plasmiden te bouwen die AcrVA's produceren.
3. Verder ingenieur AcrIIA4 door zijn sequentie uit te breiden met de sequenties van de GS-linker en HBD (hER). Dit maakt de bouw van een β-oestradiol-responsief circuit mogelijk.
   1. Gebruik touchdown PCR om GS-HBD- en AcrIIA4-onderdelen afzonderlijk te verkrijgen (zie stap 1.3.1).
   2. Plaats AcrIIA4, GS-HBD en de shuttlevector in het Gibson-mengsel en construeer het volledige plasmide via de Gibson-methode (zie stap 1.3.3).

6. crRNA-detectie: RT-qPCR en het ontwerp van primers

OPMERKING: crRNA-detectie werd bereikt via RT-qPCR, die in drie stappen is georganiseerd.

1. Voer de RNA-extractie en -zuivering uit gistcellen uit via een RNA-kit.
   1. Kweek gistcellen 's nachts in 2 ml synthetisch gedefinieerd compleet medium (SDC, 1 L volume: 20 g glucose, 2 g AA-mix, 6,7 g YNB, 396 mg Leucine, 79,2 mg tryptofaan, 79,2 mg histidine en 79,2 mg uracil) met behulp van een 24-well plaat (240 rpm, 30 °C).
   2. Verdun 's ochtends de celcultuur (1:100) tot 2 ml verse SDC en laat de gistcellen nog 4 uur groeien bij 30 °C, 240 tpm.
   3. Oogst de volledige 2 ml van de celoplossing en centrifugeer gedurende 2 minuten op 20,238 x g . Verwijder het supernatant voorzichtig omdat de celkorrel klein is.
   4. Extraheer het RNA uit gistcellen met behulp van een RNA-kit.
   5. Controleer de RNA-kwaliteit.
      1. Bereid een 1% agarose gel. Meng 5 μL van elk RNA-monster met 1 μL DNA-ladingskleurstof. Laad vervolgens het mengsel op de gel en laat het lopen.
      2. Zorg ervoor dat twee duidelijke banden op ~ 4.000 nt en ~ 2.000 nt, overeenkomend met ribosomaal RNA (25S / 18S), aanwezig zijn op de gel. Een verdere wazige band is te zien bij ~80 nt voor tRNA.
   6. Gebruik de RNA-monsters onmiddellijk voor cDNA-synthese of bewaar ze bij -80 °C voor toekomstig gebruik.
2. Omgekeerde transcriptie: Gebruik de stam-lusmethode 30 om de eerste streng cDNA te vormen die overeenkomt met het crRNA (⁴⁰ nt). Voor de reverse transcriptie van het sgRNA (bijna 100 nt) is de procedure dezelfde als die voor de cDNA-synthese van het referentiegen ACT1.
   OPMERKING: De methode voor de omgekeerde transcriptie van het crRNA verschilt van die gebruikt met het sgRNA en het ACT1 mRNA. Omdat het crRNA erg kort is, werd het behandeld als een microRNA en gebruikte het de microRNA reverse transcriptiemethode (stam-loop benadering) om het overeenkomstige cDNA te verkrijgen. Twee cDNA-synthesekits (een stam-luskit voor het crRNA en een gebruikelijke reverse transcriptiekit voor het ACT1-gen ) werden gebruikt bij de kwantificering van crRNA. Dezelfde hoeveelheid RNA werd gebruikt in de twee kits (zie Tabel met materialen) om de experimentresultaten vergelijkbaar te maken. De primer die met de stengel-luskit werd gebruikt, was ontworpen volgens de stamlussequentie en de laatste zes nucleotiden aan het 3'-uiteinde van het crRNA (voor de stamlus- en primersequentie, zie aanvullende tabel 2).
   1. Stem-loop methode voor crRNA reverse transcriptie
      1. Haal het RNA-sjabloon, de primer en de buffers uit de vriezer en laat ze smelten op ijs.
      2. Genomische DNA-verwijdering: Bereid eerst 10 μL van het reactiemengsel volgens de instructies van de kit. Doe het mengsel gedurende 2 minuten in een thermische cycler bij 42 °C. Breng het ten slotte over op ijs.
      3. Synthese van de eerste cDNA-streng: Bereid 20 μL van het reactiemengsel door 10 μL van het mengsel toe te voegen vanaf stap 6.2.1.2, 1 μL steel-lusprimer (2 μM-concentratie), 2 μL 10x RT-reactiebuffer, 2 μL reverse transcriptie-enzymmengsel (met het reverse transcriptase) en 5 μL RNase-vrije H₂O.
      4. Plaats het reactiemengsel in een thermische cycler en voer het volgende programma uit: 25 °C gedurende 5 minuten, 50 °C gedurende 15 minuten en 85 °C gedurende 5 minuten. Gebruik het product onmiddellijk voor de qPCR-reactie of bewaar het bij -80 °C.
   2. sgRNA en ACT1 mRNA reverse transcriptie
      1. Eerste reactie: Bereid een mengsel van 13 μL voor, bestaande uit de primermix, dNTP-mix, RNA-sjabloon (50 pg-5 μg) en RNase-vrij water (afgezien van de RNA-sjabloon, allemaal geleverd door de kit), volgens de instructies van de kit. Gebruik 1 μg RNA-sjabloon. Doe het mengsel gedurende 10 minuten in een thermische cycler bij 70 °C.
      2. Tweede reactie (cDNA-synthese): Bereid het reactiemengsel door de reagentia (zoals beschreven in de kitinstructies) toe te voegen aan de 13 μL van de eerste reactieoplossing tot een eindvolume van 20 μL. Plaats het mengsel gedurende 15 minuten in een thermische cycler bij 50 °C en vervolgens nog eens 5 minuten bij 85 °C. Gebruik het product onmiddellijk voor de qPCR-reactie of bewaar het bij -80 °C.
3. SYBR-kit voor qPCR: Ct-waardedetectie
   OPMERKING: De omgekeerde primer die in de qPCR van het crRNA wordt gebruikt, is gefixeerd omdat deze overeenkomt met het omgekeerde complement van de stamlussequentie (zie aanvullende tabel 2). De voorwaartse primer daarentegen is variabel en hangt af van de volgorde van het crRNA. De voorwaartse en omgekeerde primers voor het sgRNA en ACT1 mRNA qPCR zijn ontworpen op https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/. Twee primers worden geselecteerd wanneer het verschil tussen hun smelttemperaturen niet groter is dan 2 °C (zie aanvullende tabel 2). Elk monster wordt gemeten in drie replicaties.
   1. Bereid het qPCR-reactiemengsel volgens de instructies van de fabrikant voor de SYBR-kit.
   2. Stel het volgende qPCR-programma in op een real-time PCR-machine.
      Preïncubatie: 10 min bij 95 °C.
      PCR-stadium: 15 s bij 95 °C, gevolgd door 34 s bij 55 °C. Stel de cyclus van de PCR-fase in op 45 keer. Smeltfase: 10 s bij 95 °C, gevolgd door 60 s bij 65 °C en ten slotte 1 s bij 97 °C.
   3. Bereken de relatieve mRNA-expressiewaarden via de Pfafl-formule³¹.

7. Immunofluorescentie om Cas-eiwitten te detecteren

OPMERKING: Cas-eiwitten (CasP) zijn gefuseerd tot een His_tag.

1. Gistcelpreparaat
   1. Pluk wat gistcellen met behulp van een steriele lus en kweek ze in 5 ml YPD-rijk medium gedurende een nacht bij 240 tpm bij 30 °C. Voeg 's ochtends 500 μL van de celoplossing toe aan 20 ml verse YPD en laat ze groeien bij 240 tpm bij 30 °C tot OD₆₀₀ 0,6 bereikt.
   2. Neem 5 ml van de cultuur en meng het met 500 μL 37% formaldehyde. Laat het mengsel 10 minuten op kamertemperatuur (RT) staan. Oogst de cellen door centrifugeren op 1.500 x g gedurende 5 minuten.
   3. Verwijder het supernatant en resuspensie van de cellen met 1 ml fixatiebuffer (0,1 M KH 2 PO₄, 0,5 M MgCl₂, 3,7% formaldehyde, pH = 6,5). Houd de celoplossing gedurende 20 minuten bij RT.
   4. Centrifugeer de celoplossing gedurende 5 minuten op 1.500 x g . Gooi het supernatant weg en resuspensie de cellen in 1 ml wasbuffer (0,1 M KH 2 PO 4,_1,2M sorbitol, pH = 6,5) aangevuld met 4 μL bèta-mercaptoethanol en₄ μL lysaatoplossing (5 mg/ml). Breng de celoplossing gedurende 20 minuten in een incubator bij 37 °C.
   5. Centrifugeer de celoplossing gedurende 5 minuten op 1.500 x g en gooi het supernatant weg. Was de celpellet tweemaal met 1 ml PBS door centrifugeren (1.500 x g gedurende 5 minuten).
   6. Resuspendeer de cellen in 100 μL PBS plus 0,05% Tween 20 en voeg 4 μL BSA-oplossing (10 mg/ml) toe. Houd de celoplossing gedurende 20 minuten bij RT.
2. Incubatie met primair antilichaam
   1. Voeg het primaire antilichaam van de Anti-His-tag toe aan het mengsel in stap 7.1.6 met een verdunning van 1:400. Houd de oplossing 2 uur op RT.
   2. Centrifugeer het mengsel in stap 7.2.1 bij 1.500 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Voeg 1 ml PBST en centrifugeer (1.500 x g) gedurende 5 minuten toe om de celpellet te wassen. Herhaal deze bewerking twee keer. Gooi ten slotte het supernatant weg en suspensie de cellen in 100 μL 1x PBST.
3. Microscopie cel detectie
   1. Monteer de cellen op een dia; neem 2 μL van de celoplossing uit stap 7.2.2 en plaats deze op een glazen glaasje. Bedek het met een coverslip.
   2. Observeer de cellen onder een fluorescentiemicroscoop. Schakel de fluorescerende lichtbron, microscoop en computer in. Noteer het nummer van de fluorescerende lichtbron en open de microscoopsoftware op de computer.
   3. Plaats de dia op het microscooppodium. Kies de 40x objectieflens en observeer de cellen onder het groene licht (550 nm). Beweeg de grove scherpstelknop totdat de contouren van gistcellen verschijnen. Verplaats de fijne scherpstelknop om de cellen scherp te stellen.
   4. Detecteer de cellen met de microscoopsoftware. Sluit het gezichtsveld van de microscoop en schakel over naar het computerscherm. Klik op Live, wacht 3-5 s en klik op Capture om een foto te maken. Sla de afbeelding op.
   5. Schakel de computer, microscoop en fluorescerende lichtbron uit.

8. Data-acquisitie: FACS

OPMERKING: Groene fluorescentie wordt gedetecteerd via flowcytometrie (d.w.z. fluorescentie-geactiveerde celsortering [FACS] metingen). Gistcellen worden over het algemeen gekweekt bij 30 °C en 240 rpm om FACS-experimenten uit te voeren. Cellen kunnen echter enkele voorzorgsmaatregelen vereisen, afhankelijk van hun genetische inhoud. Cellen die het dCas12a-VPR-gen bevatten (gecontroleerd door de GPD-constitutieve promotor) moeten gedurende 24 uur in de SDC-oplossing worden gekweekt. Daarna worden cellen verdund in een verhouding van 1:100 in verse SDC en nog eens 12 uur gekweekt voordat de fluorescentie-intensiteit wordt gemeten. Cellen gemodificeerd met het AcrIIA4-HBD(hER)- gen vereisen ook verdunning. Bovendien moet OD₆₀₀ worden gecontroleerd. Ten eerste mogen de cellen 's nachts (meer dan 14 uur) in SDC groeien. In de ochtend wordt OD₆₀₀ gemeten. Vervolgens wordt de cultuur verdund in SDC, geleverd met een diverse concentratie β-oestradiol, tot OD₆₀₀ = 0,1. Vóór FACS-experimenten worden de cellen nog eens 7 uur gekweekt, zodat OD₆₀₀ 0,8-1,0 bereikt. Cellen die dCas9-VP64 of dCas12a-VP64 tot expressie brengen, worden gedurende 20-24 uur in SDC gekweekt zonder verdunning en verdere groei vóór de metingen aan de FACS-machine.

1. Schakel de FACS-machine 20 minuten voor de metingen in om de laser op te warmen.
2. Bereid de monsters voor (verdunning): meng 20 μL van de celcultuur met 300 μL ddH₂O.
3. Voer de FACS-software uit op de computer die is aangesloten op de FACS-machine en maak een nieuw experiment. Stel de meetparameters in (d.w.z. FSC(SSC)-A/H/W en histogram).
4. Selecteer het filter op basis van de excitatie- en emissiegolflengten van de monsters. Het doeleiwit hier is bijvoorbeeld yEGFP, waarvan de excitatie- en emissiegolflengten respectievelijk 488 nm en 507 nm zijn. Selecteer dus het FITC- of GFP-filter (excitatiegolflengte: 488 nm; emissiegolflengte: 527/32 nm). Stel het aantal acquisitiecellen in op 10.000.
5. Pas de FITC-filterspanning aan door de intensiteit van fluorescerende kralen te meten. Zorg ervoor dat het relatieve verschil in de intensiteit van de kralen tussen twee opeenvolgende experimenten niet groter is dan 5%.
6. Was de machine met ddH₂O gedurende enkele seconden om eventuele overtollige kralen te verwijderen.
7. Meet de fluorescentie-intensiteit van het monster. Klik op Preview en wacht 3-5 s voor de stabiliteit van de monsterinjectie. Klik ten slotte op Verwerven.
8. Meet de kralen opnieuw aan het einde van het experiment. De spanning is de spanning die werd gebruikt tijdens de eerste kralenmeting (zie stap 8.4, 438-441 V). Controleer of het relatieve verschil tussen de afmetingen van de twee kralen groter is dan 5%.
9. Exporteer de FACS-gegevens als FCS-bestanden.
10. Analyseer de FCS-bestanden met R Studio-software.

9. Data-analyse

OPMERKING: Gebruik het Flowcore R Bioconductor-pakket ³² binnen R studio. De FCS-bestanden werden geanalyseerd met behulp van een script geschreven in R-taal.

1. Open R studio en laad het script Bdverse analyse. R om de FCS-bestanden te analyseren.
2. Stel de experimentnaam (ename), de map (pad) in waar de FCS-bestanden zich bevinden
   Opgeslagen (dir_d) en waar de resultaatbestanden worden gemaakt (dir_r).
3. Stel het fluorescentiekanaal in. Bijvoorbeeld, select_ch = "GPA-A" als groene fluorescentie werd gemeten.
4. Stel het aantal monsters in dat is gemeten (s_num).
5. Stel de afmetingen van elke dot plot (sxlim, sylim) in. Stel de maximale lengte van de x- en y-as in voor staafplots en boxplots (xlimit, ylimit). xlimit moet groter zijn dan of gelijk zijn aan s_num.
6. Kies de gating-methode door de # uit de overeenkomstige regels te verwijderen.
   OPMERKING: morphGate is een automatische gating-methode die wordt uitgevoerd door het script (d.w.z. het gebied van de puntplots waar de cellen dichter zijn, wordt herkend en geselecteerd door het programma). polygonGate en rectangleGate vereisen om naar de puntplots te kijken en de hoekpunten van een veelhoek of de zijkant van een rechthoek te definiëren die de zone omvat waar de meeste cellen liggen.
7. Selecteer het object flowSet gated, dat overeenkomt met de gekozen gatingmethode. Selecteer de resolutie van de puntplot (res; moet ten minste gelijk zijn aan 256).
8. Verwijder het commentaar flt_low <- filter_low(sp) om metingen te verwijderen waarbij de fluorescentie negatief is. Verwijder het commentaar flt_sp <- filter(flt_lw) om uitschieters als gevolg van andere experimenten te verwijderen.
9. Druk op Bron en voer het script uit. Alle bestanden met de resultaten van de analyse worden in dir_r gemaakt.

Resultaten

sgRNA/crRNA-expressie door een RNA-polymerase III-type promotor
Ten eerste had dit werk betrekking op de engineering van het transcriptionele activeringscircuit (circuit 1) weergegeven in figuur 1A. Het bevatte drie basiscomponenten: 1) het gen dat codeert voor yEGFP (de reporter), dat werd voorafgegaan door een reeks verschillende synthetische promotors die doellocaties leverden voor dCas9 / dCas12a-AD; 2) een voor gistcodon geoptimaliseerde versie van dCas9 of dCas12a g...

Discussie

Het protocol toonde een mogelijke complete workflow voor synthetische gen-digitale circuits, volgens de "Design-Build-Test-Learn" (DBTL) biologische engineeringcyclus en met betrekking tot zowel dry-lab als wet-lab experimenten. Hier hebben we ons gericht op het CRISPR-Cas-systeem, voornamelijk dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a en de bijbehorende anti-CRISPR-eiwitten, door kleine transcriptionele netwerken van S. cerevisiae te ontwerpen en in te bouwen. Sommigen van hen bootsten Booleaanse poorten na, die de basis...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.1 mL PCR 8-strip tubes	NEST	403112
0.2 mL PCR tubes	Axygen	PCR-02-C
1.5 mL Microtubes	Axygen	MCT-150-C
15 mL Centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011150
2 mL Microtubes	Axygen	MCT-200-C
50 mL Centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011500
Agarose-molecular biology grade	Invitrogen	75510-019
Ampicillin sodium salt	Solarbio	69-52-3
Applied biosystems veriti 96-well thermal cycler	Thermo Fisher Scientific	4375786
AxyPrep DNA gel extraction kit	Axygen	AP-GX-250
BD FACSuite CS&T research beads	BD	650621	Fluorescent beads
BD FACSVerse flow cytometer	BD	-
Centrifuge	Eppendorf	5424
Centrifuge Sorvall ST 16R	Thermo Fisher Scientific	75004380
E. coli competent cells (Strain DH5α)	Life Technologies	18263-012
ECL select Western Blotting detection reagent	GE Healthcare	RPN2235
Electrophoresis apparatus	Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd	JY300C
Flat 8-strip caps	NEST	406012
Gene synthesis company	Azenta Life Sciences		https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences
Goat anti-Mouse IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11004
HiFiScript cDNA synthesis kit	CWBIO	CW2569M	Kit gebruikt in stap 6.2.2.1
Lysate solution (Zymolyase)	zymoresearch	E1004-A
Nikon Eclipse 80i fluorescence microscope	Nikon	-	Fluorescentiemicroscoop
Pipet tips—10 μL	Axygen	T-300-R-S
Pipet tips—1000 μL	Axygen	T-1000-B-R-S
Pipet tips—200 μL	Axygen	T-200-Y-R-S
pRSII403	Addgene	35436
pRSII404	Addgene	35438
pRSII405	Addgene	35440
pRSII406	Addgene	35442
pRSII424	Addgene	35466
pTPGI_dSpCas9_VP64	Addgene	49013
Q5 High-fidelity DNApolymerase	New England Biolabs	M0491
Restriction enzyme-Acc65I	New England Biolabs	R0599
Restriction enzyme-BamHI	New England Biolabs	R0136
Restriction enzyme-SacI-HF	New England Biolabs	R3156
Restriction enzyme-XhoI	New England Biolabs	R0146
Roche LightCycler 96	Roche	-	Real-Time PCR Instrument
S. cerevisiae CEN.PK2-1C	-	-	The parent strain. The genotype is: MATa; his3D1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289; MAL2-8c; SUC2
Stem-Loop Kit	SparkJade	AG0502	Kit gebruikt in stap 6.2.1.3
T100 Thermal Cycler	BIO-RAD	186-1096
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202
T5 Exonuclease	New England Biolabs	M0363
Taq DNA ligase	New England Biolabs	M0208
Taq DNA polymerase	New England Biolabs	M0495
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye)	Takara	RR820Q
YeaStar RNA kit	Zymo Research	R1002
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E8875