Engineering oncogene heterozygote gain-of-function mutaties in menselijke hematopoietische stam- en voorlopercellen

Summary

Nieuwe strategieën om somatische mutaties in hematopoietische stam- en voorlopercellen (HSPC's) getrouw te modelleren, zijn nodig om de hematopoëtische stamcelbiologie en hematologische maligniteiten beter te bestuderen. Hier wordt een protocol beschreven om heterozygote gain-of-function mutaties in HSPC's te modelleren door het gebruik van CRISPR/Cas9 en dual rAAV donortransductie te combineren.

Abstract

Gedurende hun hele leven verwerven hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) somatische mutaties. Sommige van deze mutaties veranderen de functionele eigenschappen van HSPC, zoals proliferatie en differentiatie, waardoor de ontwikkeling van hematologische maligniteiten wordt bevorderd. Efficiënte en nauwkeurige genetische manipulatie van HSPC's is nodig om de functionele gevolgen van terugkerende somatische mutaties te modelleren, te karakteriseren en beter te begrijpen. Mutaties kunnen een schadelijk effect hebben op een gen en resulteren in functieverlies (LOF) of, in schril contrast, kunnen de functie verbeteren of zelfs leiden tot nieuwe kenmerken van een bepaald gen, genaamd gain-of-function (GOF). In tegenstelling tot LOF-mutaties komen GOF-mutaties bijna uitsluitend heterozygoot voor. De huidige protocollen voor genoombewerking laten de selectieve targeting van individuele allelen niet toe, waardoor het vermogen om heterozygote GOF-mutaties te modelleren wordt belemmerd. Hier bieden we een gedetailleerd protocol over het engineeren van heterozygote GOF-hotspotmutaties in menselijke HSPC's door CRISPR / Cas9-gemedieerde homologie-gerichte reparatie en recombinante AAV6-technologie te combineren voor efficiënte dna-donorsjabloonoverdracht. Belangrijk is dat deze strategie gebruik maakt van een dubbel fluorescerend reportersysteem om het volgen en zuiveren van succesvol heterozygote HSPC's mogelijk te maken. Deze strategie kan worden gebruikt om nauwkeurig te onderzoeken hoe GOF-mutaties de HSPC-functie beïnvloeden en hun progressie naar hematologische maligniteiten.

Introduction

Met de ontwikkeling van de geclusterde regelmatig interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9-technologie is een nieuw en uiterst krachtig instrument toegevoegd aan de toolkit van wetenschappers. Deze technologie maakt de nauwkeurige engineering van het genoom mogelijk en heeft bewezen uiterst nuttig te zijn, niet alleen voor onderzoeksdoeleinden (herzien in Hsu et ^al.1), maar is meer recentelijk ook met succes vertaald naar de klinische setting ^2,3,4. CRISPR/Cas9-bewerkingsstrategieën zijn gebaseerd op de activiteit van een Cas9-eiwit en een single-guide RNA (sgRNA)^5,6,7. In de gastheercel wordt het Cas9-eiwit naar een specifieke plaats in het DNA geleid die complementair is aan de sgRNA-sequentie en een DNA-dubbelstrengsbreuk (DSB) introduceert. Zodra een DSB is gegenereerd, zijn er twee belangrijke en concurrerende reparatiemechanismen die kunnen optreden: niet-homologe eindverbinding (NHEJ) en homologie-gerichte reparatie (HDR). NHEJ is een foutgevoelig, voornamelijk gebruikt reparatiemechanisme dat leidt tot inserties en deleties (indels), terwijl HDR, door de zusterchromatide als reparatiesjabloon te gebruiken, zeer nauwkeurig is, maar beperkt tot de S- of G2-fase van de celcyclus⁸. In genome engineering kan HDR worden gebruikt voor de gerichte modificatie van DNA door een donorsjabloon te bieden die wordt geflankeerd door homologiearmen die identiek zijn aan beide DNA-uiteinden van de Cas9-geïnduceerde DSB (figuur 1). Het type donorsjabloon dat voor HDR wordt gebruikt, kan de bewerkingsefficiëntie sterk beïnvloeden. Voor genetische manipulatie in menselijke HSPC's is onlangs beschreven dat adeno-geassocieerd virus serotype 6 (AAV6) een uitstekend voertuig is voor de levering van enkelstrengs DNA-sjablonen ^9,10.

CRISPR/Cas9 genome engineering kan therapeutisch worden gebruikt om schadelijke mutaties te corrigeren¹¹, maar kan ook worden gebruikt om pathogene mutaties in het DNA te introduceren om de ontwikkeling van kanker te modelleren¹². Bloedkanker, zoals leukemie, ontwikkelt zich via de sequentiële verwerving van somatische mutaties in gezonde HSPC's^13,14. Vroege genetische gebeurtenissen leiden tot een klonaal proliferatief voordeel, resulterend in klonale hematopoëse van onbepaald potentieel (CHIP)^15,16. Verdere verwerving van mutaties zal uiteindelijk leiden tot leukemische transformatie en de ontwikkeling van de ziekte. Somatische mutaties kunnen worden gevonden in genen die zelfvernieuwing, overleving, proliferatie en differentiatie regelen¹⁷.

Het introduceren van individuele mutaties via genome engineering in gezonde HSPC's maakt het mogelijk om dit stapsgewijze leukemogene proces nauwkeurig te modelleren. Het beperkte aantal terugkerende mutaties in myeloïde neoplasmata zoals acute myeloïde leukemie (AML)^18,19 maakt deze ziekte bijzonder vatbaar voor een samenvatting met behulp van genoomtechnologietools.

Somatische mutaties kunnen op slechts één allel (monoallelische/heterozygote mutaties) of op beide allelen (biallelische/homozygote mutaties) ontstaan en kunnen diepgaande effecten hebben op de functie van het gen, wat een functieverlies (LOF) of een gain-of-function (GOF) kan veroorzaken. LOF-mutaties leiden tot een verminderde (als één allel wordt aangetast) of volledige (als beide allelen zijn aangetast) LOF van het gen, terwijl GOF-mutaties leiden tot een verhoogde activering of nieuwe functie van het gen. GOF-mutaties zijn meestal heterozygoot²⁰.

Belangrijk is dat de zygositeit (hetero- versus homozygoot) grote implicaties heeft voor de poging om een mutatie getrouw te modelleren; daarom is de gerichte manipulatie van slechts één allel van een gen nodig om heterozygote hotspot GOF-mutaties te ontwikkelen. Foutgevoelige NHEJ leidt tot indels van verschillende lengtes²¹ die kunnen leiden tot verschillende, onvoorspelbare biologische gevolgen. Aangezien NHEJ echter het overheersende reparatieprogramma is dat door cellen wordt gebruikt na de introductie van een DSB, laten de meeste CRISPR / Cas9-platforms die momenteel worden gebruikt om HSPC's te manipuleren, het niet toe om de genetische uitkomst nauwkeurig te voorspellen^22,23. Daarentegen maakt de introductie van een CRISPR/Cas9-gemedieerde dubbelstrengsbreuk (DSB's), gecombineerd met het gebruik van recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) vectorgebaseerde DNA-donorsjablonen voor genoomtechnologie via HDR, de allelspecifieke insertie van mutaties in menselijke HSPC's^11,24 mogelijk. De gelijktijdige integratie van een mutant en een wild-type (WT) sequentie in combinatie met verschillende fluorescerende reporters op de individuele allelen kan worden uitgevoerd om te selecteren op een heterozygoot genotype (figuur 2). Deze strategie kan worden gebruikt als een krachtig hulpmiddel om de effecten van terugkerende, leukemische, heterozygote GOF-hotspotmutaties op de HSPC-functie, ziekte-initiatie en progressie nauwkeurig te karakteriseren.

In dit artikel wordt een gedetailleerd protocol gegeven voor de efficiënte engineering van recidiverende heterozygote GOF-mutaties in primaire menselijke HSPC's. Deze strategie combineert het gebruik van CRISPR/Cas9 en een dubbele AAV6-transductie om WT- en mutant DNA-donorsjablonen te bieden voor de prospectieve generatie van de heterozygote GOF-mutatie. Als voorbeeld zal engineering van de recidiverende type 1 mutaties (52 bp deletie) in het calreticuline (CALR) gen worden getoond²⁵. De heterozygote GOF-mutatie in exon 9 van CALR wordt herhaaldelijk aangetroffen bij myeloproliferatieve aandoeningen zoals essentiële trombocytemie (ET) en primaire myelofibrose (PMF)²⁶. CALR is een endoplasmatisch reticulum resident eiwit dat voornamelijk een kwaliteitscontrolefunctie heeft in het vouwproces van nieuw gesynthetiseerde eiwitten. De structuur kan worden onderverdeeld in drie hoofddomeinen: een amino (N)-terminal domein en een proline-rijk P-domein, die betrokken zijn bij de chaperonnefunctie van het eiwit, en een C-domein, dat betrokken is bij calciumopslag en regulatie^27,28. CALR-mutaties veroorzaken een +1 frameshift, wat leidt tot de transcriptie van een nieuw verlengd C-terminal uiteinde en het verlies van het endoplasmatisch reticulum (ER)-retentiesignaal (KDEL). Van mutant CALR is aangetoond dat het de trombopoietinereceptor bindt, wat leidt tot TPO-onafhankelijke signalering met verhoogde proliferatie²⁹.

Figuur 1: NHEJ- en HDR-reparatie. Vereenvoudigde schematische weergave van NHEJ- en HDR-reparatiemechanismen na de introductie van een dubbelstrengsbreuk in het DNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Schematisch overzicht van biallelische HDR-bewerkingsstrategie. Schematische weergave van de integratie van de donorsjablonen in de beoogde allelen, gevolgd door hun vertaling in functionerende mRNA's. De oranje gestippelde vakken geven de gebieden aan die overeenkomen met de linker homologiearm (LHA) en de rechter homologiearm (RHA). De ideale grootte van de HAs is 400 bp elk. Het groene vak met stippen vertegenwoordigt het gebied dat overeenkomt met de SA-reeks. De omvang van de SA is 150 bp. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Protocol

Dit protocol vereist het gebruik van gezonde van donoren afgeleide CD34⁺ HSPC's en vereist ethische goedkeuring van de lokale institutionele toetsingscommissies (IRB) en ondertekende geïnformeerde toestemming. De CD34⁺ HSPC's die in dit protocol werden gebruikt, werden geïsoleerd uit het navelstrengbloed (UCB) van termijnleveringen (>34 weken zwangerschap). Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de moeders voorafgaand aan de bevalling, en ethische goedkeuring voor de inzameling van UCB werd verkregen (IRB-goedkeuring: 31-322 ex 18/19) van de Medische Universiteit van Graz. Een volledige lijst van materialen die in dit protocol worden gebruikt, is te vinden in de tabel met materialen.

1. sgRNA-ontwerp en evaluatie van snij-efficiëntie

1. Zoek naar de locatie van de gewenste mutatie en het juiste transcript op een online databasetool (bijv. COSMIC, https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic).
2. Selecteer een sgRNA naast de mutatie (exonische targeting) of in de vorige intron (intronic targeting) met behulp van een sgRNA-ontwerptool. In dit protocol wordt de online tool van Benchling gebruikt. Zie De tabel met materialen voor een lijst met mogelijke online tools voor sgRNA-ontwerp.
3. Selecteer de optie + (maken) > DNA-sequentie > DNA-sequenties importeren > importeren uit databases. Voer het gewenste gen in, bijvoorbeeld CALR en selecteer de mens als de soort > Zoek > Selecteer het juiste transcript (bijv. CALR-201 -ENST00000316448) > Import. Selecteer de regio waarin u de DS-pauze wilt introduceren (bijvoorbeeld intron 7).
4. Selecteer de CRISPR-optie aan de rechterkant van het scherm en selecteer Hulplijnen ontwerpen en analyseren. Selecteer enkele hulplijn, houd de lengte van de gids op 20 bp en PAM-reeks voor bewerking met SpCas9 (NGG).
5. Kies een gids met een hoge on-target score (hoge kans op bewerking op de gewenste locus) en een hoge off-target score (lage kans op bewerken bij ongewenste loci). Kies ten minste drie gidsen om te testen om het best presterende sgRNA te vinden. Bestel het sgRNA als chemisch gemodificeerd synthetisch sgRNA bij een commerciële leverancier.
   OPMERKING: Het is in dit stadium raadzaam om een kleine hoeveelheid van de synthetische sgRNA's voor het eerste scherm te bestellen. Zodra een goed presterend sgRNA is geïdentificeerd, gaat u verder met een grotere orde van het geselecteerde sgRNA.
6. Ontdooi 2 x 10^5-5 x 10⁵ CD34⁺ HSPC's. Breng de cellen over in 10 ml voorverwarmd RPMI1640 aangevuld met 1% antibiotica (bijv. Penicilline / streptomycine).
   OPMERKING: CD34⁺ HSPC's met een zuiverheid >90% moeten worden gebruikt om de beste en meest reproduceerbare resultaten te bereiken.
7. Centrifugeer bij 350 x g bij kamertemperatuur (RT) gedurende 10 min. Tel de cellen met een hemocytometer en suspensie de cellen in SFEM II-medium aangevuld met 0,2% penicilline /streptomycine (P / S), 100 ng / ml trombopoietine (TPO), 100 ng / ml stamcelfactor (SCF), 100 ng / ml FMS-achtig tyrosinekinase 3 ligand (FLT3L), 100 ng / ml interleukine-6 (IL-6), 35 nM UM171 en 0,75 μM StemRegenin1 (SR1) tot een concentratie van 2,5 x 10⁵ cellen / ml . Incubeer bij 37 °C/5% CO₂ gedurende 48 h - 72 h.
   OPMERKING: Het volledige medium wordt voortaan het HSPC-retentiemedium genoemd.
8. Verzamel de cellen in een buis van 15 ml en tel de cellen. Controleer de levensvatbaarheid van de cel door trypan blue-uitsluiting.
   1. Voordat u begint, schakelt u het transfectiesysteem in en selecteert u de optie voor de cuvetten. Selecteer het juiste programma en de juiste nucleofectieoplossing voor HSPC's (zie Materiaaltabel). Tussen 2 x 10⁵ en 5 x 10^{kunnen 6} cellen worden gekernamineerd in één cuvette van 100 μL. Zet een klein aantal cellen opzij (bijv. 1 x 10^5-2 x 10⁵) om gedurende 48 uur in cultuur te houden om als WT-controle te worden gebruikt.
9. Bereid het RNP-complex voor. Voeg in een buis van 1,5 ml 15 μg Cas9 en 8 μg sgRNA (molaire verhouding 1:2,5) toe en incubeer bij 25 °C gedurende 10 minuten in een verwarmingsblok.
10. Terwijl het RNP-complex broedt, centrifugeer je de cellen op 350 x g bij RT gedurende 5 minuten en gooi je het supernatant weg met behulp van een pipet. Suspensie de cellen in 100 μL nucleofectionoplossing.
11. Meng de cellen met het RNP-complex en breng over in de cuvette. Tik voorzichtig op de cuvette om eventuele luchtbellen te verwijderen die zich tijdens de overdracht hebben gevormd.
12. Steek de cuvette in de houder van het transfectiesysteem en elektroporaat de cellen met het DZ-100-programma.
13. Voeg onmiddellijk na elektroporatie 400 μL voorverwarmd HSPC-retentiemedium toe zonder P/S.
14. Breng de cellen met een fijne transferpipet over in een kweekplaat met voorverwarmd HSPC-retentiemedium zonder P/S. Gebruik, afhankelijk van het celnummer, een geschikte kweekplaat (24-, 12- of 6-wellsplaat) om een dichtheid tussen 0,25 x 10⁶ en 1 x 10⁶ cellen/ml te bereiken.
15. Breng de plaat over naar de incubator bij 37 °C/5% CO₂. Incubeer de nucleofecteerde cellen gedurende 6-8 uur.
16. Verwijder na 6-8 uur het oude medium en vervang het door vers voorverwarmd HSPC-retentiemedium aangevuld met P / S. Suspensie de cellen in een concentratie tussen 2,5 x 10⁵ en 5 x 10⁵ en breng over naar een celkweekplaat (24-, 12- of 6-wellsplaat). Incubeer de cellen gedurende 48 uur bij 37°C/5% CO₂.
17. Oogst 2 x 10⁵ cellen en centrifugeer bij 350 x g bij RT gedurende 5 min. Stel voordat u begint de verwarmingsblokken in op 65 °C en 98 °C.
18. Gooi het supernatant weg en hang de cellen in 1 ml 1x DPBS in een buis van 1,5 ml. Centrifugeer bij 350 x g bij RT gedurende 5 min.
19. Gooi het supernatant weg en suspensie de cellen in 50 μL DNA-extractieoplossing. Vortex voor 15 s.
20. Incubeer gedurende 6 min bij 65 °C. Vortex gedurende 15 s en incubeer gedurende 2 min bij 98 °C.
21. Versterk het gebied van de DSB door PCR met behulp van primers die een amplicon van ongeveer 400-600 bp genereren met de DSB in het midden. Gebruik 0,5-1 μL geëxtraheerd DNA voor de PCR-reactie.
    OPMERKING: Vanwege de samenstelling van de DNA-extractieoplossing kunnen de DNA-concentraties niet nauwkeurig worden gekwantificeerd door spectrofotometrie.
22. Voer het PCR-product met een DNA-ladder uit op een 1,5 % agarose-gel bij 100 V gedurende 45-60 minuten. Plaats de gel op een blauw licht of UV-transilluminator.
23. Haal de DNA-band van de juiste grootte uit de gel met behulp van een in de handel verkrijgbare kit volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
24. Rangschik de monsters door Sanger-sequencing met behulp van de voorwaartse primer of omgekeerde primer van de PCR. Voor PCR-producten met een lengte van 400-600 bp is 75 ng DNA nodig voor sequencing met een concentratie van 5 ng/ml in een totaal volume van 15 μL.
25. Analyseer de bewerkingsefficiëntie van de sgRNA's door de sequencingbestanden te uploaden naar een programma dat is ontworpen om de bewerkingsefficiëntie te berekenen door de invoeging en verwijderingen te identificeren die door het sgRNA worden geproduceerd. Selecteer het best presterende sgRNA om mee door te gaan.
    OPMERKING: Speciale online tools worden vermeld in de materiaaltabel. Deze analyse vereist de .ab1-bestanden van de getransfecteerde en WT HSPC's, de sgRNA-sequentie en de PAM-sequentie.

2. Homologie-gerichte reparatie (HDR) vectorconstructie

1. HDR-sjabloonontwerp
   OPMERKING: Er moeten twee HDR-sjablonen worden ontworpen: een sjabloon voor de WT-reeks en een sjabloon voor de gemuteerde reeks.
   1. Importeer de genomische sequentie en de coderingssequentie (CDS) van het gewenste gen in een geschikte software voor moleculair klonen (speciale hulpmiddelen zijn te vinden in de tabel met materialen). Ontwerp uit het genomische sequentiebestand de linker homologiearm (HA) door idealiter 400 bp te selecteren aan het 5'-uiteinde van de DSB. Plak deze reeks in een nieuw bestand.
   2. Als een intron wordt aangevallen met het sgRNA, moet een splice acceptor (SA) sequentie worden opgenomen. Selecteer de laatste 150 bp van de beoogde intron en plak deze na de linker HA. Als het exon direct gericht is, is deze volgorde niet nodig (figuur 3).
   3. Selecteer in het CDS-bestand de interessante cDNA. In het geval dat een exonische sequentie wordt gericht, zorg er dan voor dat het cDNA onmiddellijk stroomafwaarts van de DSB-site begint en alle volgende exonen van het gen van belang en het stopcodon omvat. In het geval dat een intron wordt gericht, zorg er dan voor dat het cDNA begint met het eerste codon van het volgende exon. Codon-optimaliseer de cDNA en plaats deze na de SA-sequentie. Gebruik hiervoor speciale online tools (materiaaltabel).
   4. Plaats een polyadenylation (PolyA)-signaal van 3' na het cDNA van belang (bijv. SV40 of bGH) (tabel 1). Voeg na de PolyA een promotorsequentie in (bijv. miltfocusvormend virus [SFFV] of polyubiquitine C [UBC], tabel 1) voor het fluorescerende eiwit.
   5. Plaats de sequentie voor het fluorescerende eiwit (d.w.z. GFP, BFP of mCherry). Plaats een tweede maar ander PolyA-signaal.
      OPMERKING: Het invoegen van een andere PolyA-sequentie voorkomt problemen zoals bacteriële recombinatie van het plasmide of problemen met het uitlijnen van de sequentie vanwege twee identieke sequenties in de sjabloon.
   6. Ontwerp uit het genomische sequentiebestand de juiste HA door idealiter 400 bp te selecteren aan het 3'-uiteinde van de DSB. Plaats deze reeks na de tweede PolyA.
   7. Maak een kopie van de hele sjabloon en wijzig het cDNA van belang zodat het de volgorde van de gewenste mutatie bevat.
   8. Wissel het fluorescerende eiwit uit met een ander fluorescerend eiwit. Als GFP bijvoorbeeld is gebruikt voor de WT-sjabloon, wisselt u deze in met BFP of mCherry voor de mutantensjabloon. Construeer en kloon de HDR-sjablonen in het pAAV-MCS-plasmide (of andere geschikte backbones).
      OPMERKING: De fragmenten die nodig zijn voor de assemblage kunnen worden geproduceerd door PCR of commercieel worden besteld en moeten overlappende sequenties bevatten met hun aangrenzende fragmenten. Als de mutatie van belang een puntmutatie, een kleine insertie of een kleine deletie is, kan het gemuteerde cDNA door PCR worden geproduceerd door een locatiegerichte mutagenese uit te voeren op de HDR-sjabloon die de WT cDNA bevat.
   9. Transformeer competente Escherichia coli met het geassembleerde product met behulp van de heat shock-methode. Plaats voordat je begint de bacteriën om te ontdooien op ijs gedurende 10 minuten.
   10. Voeg 2 μL van de geassembleerde producten toe aan 50 μL bacteriën. Meng de inhoud door zachtjes te vegen.
   11. Leg de monsters gedurende 30 minuten op ijs. Breng de monsters gedurende 30 s over naar een thermoblok op 42 °C.
   12. Breng de monsters gedurende 5 minuten over op ijs. Voeg 450 μL SOC-medium op kamertemperatuur toe en incubeer de monsters bij 37 °C gedurende 1 uur.
   13. Verdeel de monsters over LB-agarplaten die ampicilline bevatten. Verdeel voor elk monster 100 μL van drie verschillende verdunningen van de bacteriële oplossing (onverdund, 1:5 en 1:10) om LB-agarplaten te verkrijgen met enkele kolonies die kunnen worden geplukt. Incubeer de platen een nacht bij 37 °C.
   14. Kies de volgende dag drie kolonies per monster. Breng de kolonies over in buizen van 15 ml met doppen met 4 ml LB-medium aangevuld met ampicilline en incubeer 's nachts in een shaker bij 37 °C.
   15. Aliquot 500 μL van de bacteriële oplossing uit elke kolonie en bewaar het in de koelkast voor later gebruik. Voer een mini-voorbereiding uit om plasmide-DNA te extraheren volgens de instructies van de fabrikant.
   16. Stuur de monsters voor Sanger-sequencing om de juiste assemblage van de plasmiden te bevestigen. Gebruik voldoende primers verdeeld over het plasmide om een ononderbroken sequentiebevestiging te garanderen, idealiter om elk gebied twee keer te bedekken met voorwaartse en omgekeerde metingen.
   17. Voeg 200 μL van de bacteriële oplossing die het correct geassembleerde plasmide bevat toe aan 200 ml LB-media aangevuld met ampicilline en incubeer in een shaker gedurende een nacht bij 37 °C.
   18. Voer een midi- of maxi-prep uit om het plasmide-DNA te extraheren volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar het plasmide-DNA bij −20 °C.
2. Recombinante AAV6-voorbereiding
   OPMERKING: Er moeten twee afzonderlijke AAV6-voorbereidingen worden uitgevoerd: één voor de rAAV6 met de WT HDR-sjabloon en één voor de rAAV6 met de gemuteerde HDR-sjabloon. In dit gedeelte worden de stappen beschreven die nodig zijn voor de bereiding van slechts één virus.
   1. Ontdooi HEK293T-cellen, breng de cellen over in 10 ml voorverwarmde DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% P / S en 25 mM HEPES en centrifugeer bij 350 x g bij RT gedurende 5 minuten.
   2. Suspensie de cellen in een concentratie van 1 x 10⁵ cellen/ml en breng ze over in een geschikte kolf (bijvoorbeeld een kolf van 175 cm² ). Breng de kolf over in een broedmachine bij 37 °C/5% CO₂.
      OPMERKING: HEK293T-cellen moeten van tevoren worden ontdooid om de cellen volledig te laten herstellen en een voldoende aantal cellen te verkrijgen (11 x 10⁷ cellen zijn nodig voor de productie van één virus). Het wordt aanbevolen om de cellen na minimaal drie passages te gebruiken en de cellen onder de 20 passages te houden. HEK293T-cellen moeten drie keer per week worden gesplitst. Met behoud van de cellen mogen deze niet groter zijn dan 70% -80% samenvloeiing. De DMEM die in het AAV-preparaat wordt gebruikt, moet ook al worden aangevuld met L-glutamine en natriumpyruvaat.
   3. Verzamel de cellen in een buis van 50 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 350 x g bij RT.
   4. Suspensie de cellen in 20 ml DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% P / S en 25 mM HEPES en tel met een hemocytometer. Gebruik trypan blue voor het uitsluiten van dode cellen.
   5. Zaad 3 x 10⁶ cellen in 20 ml DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% P/S en 25 mM HEPES in een 175 cm² kolf. Bereid voor de productie van één virus ten minste vier kolven van 175 cm² . Incubeer de cellen bij 37 °C/5% CO₂ gedurende 3 dagen.
      OPMERKING: Deze stap kan het beste op een vrijdag worden uitgevoerd, omdat het de cellen in staat stelt om tijdens het weekend uit te breiden.
   6. Oogst en tel de HEK293T cellen.
   7. Bereid voor de bereiding van een van de virussen tien schotels van 150 mm met elk 11 x 10⁶ HEK293T in 20 ml DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% P / S en 25 mM HEPES.
   8. Zet de gerechten in de couveuse op 37 °C/5% CO₂ gedurende 24 uur. Gooi het oude medium voorzichtig weg en vervang door 20 ml antibioticavrije DMEM aangevuld met 10% FBS, 25 mM HEPES en 1 mM natriumbutyraat. Controleer voordat u verder gaat of de samenvloeiing van de cellen niet hoger is dan 80%.
   9. Bereid twee buizen van 15 ml die de transfectiemengsels bevatten. Voeg aan buis 1 5 ml gereduceerd serummedium, 60 μg rAAV6 gemuteerd HDR-plasmide en 220 μg pDGM6 (helperplasmide) toe. Voeg aan buis 2 5 ml gereduceerd serummedium en 1120 μl polyethylenimine-oplossing (PEI, transfectiereagens) toe aan buis 2.
   10. Voeg de inhoud van buis 2 toe aan buis 1 en vortex gedurende 30 s. Incubeer gedurende 15 minuten bij RT om een goede inkapseling van het DNA in de PEI-micellen te garanderen.
       OPMERKING: Bewaar de oplossing niet langer dan 20 minuten.
   11. Voeg voorzichtig druppelsgewijs 1,1 ml van de oplossing toe aan elk gerecht en verdeel door voorzichtig te draaien. Zet de gerechten in de incubator op 37 °C/5% CO₂ gedurende 48 uur.
   12. Voeg na 48 uur 250 μL 0,5 M EDTA toe aan elk gerecht en plaats de gerechten gedurende 10 minuten in de couveuse. Oogst de cellen door ze van de schaal te wassen en over te brengen naar een centrifugebuis van 500 ml of meerdere buizen van 50 ml.
   13. Centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg. Om de volledige verwijdering van het supernatant te garanderen, moet u opnieuw centrifugeren bij 2.000 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C.
   14. Gooi alle resterende supernatant weg. Elk resterend supernatant kan de viruszuivering aantasten.
   15. Maak de pellet los door vortexing en extraheer het virus met behulp van een AAV-zuiveringskit (zie Materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant. U kunt ook extractie uitvoeren door iodixanol gradiënt ultracentrifugatie^30,31.
   16. Aliquot het gezuiverde virus en bewaar bij −80 °C. Titreer de AAV functioneel of kwantificeer de AAV-titer door middel van digitale druppel PCR (ddPCR)³² om de optimale transductiecondities te bepalen.
   17. Herhaal dit proces voor de bereiding van het rAAV6 WT HDR plasmide.
3. AAV-titratie door ddPCR
   1. Stel voordat u begint de verwarmingsblokken in op 65 °C en 98 °C.
   2. Extraheer viraal DNA door 15 μL DNA-extractieoplossing toe te voegen aan 5 μL van het virus. Vortex voor 15 s.
   3. Incubeer gedurende 6 min bij 65 °C. Vortex voor 15 s. Incubeer gedurende 2 minuten bij 98 °C.
   4. Gebruik het geëxtraheerde DNA (een 1:4 verdunning van het virale DNA) om seriële verdunningen (1:400, 1:40.000, 1:160.000, 1:640.000) te bereiden met nucleasevrij (nf) H₂O voor de ddPCR.
      OPMERKING: De verdunningen kunnen worden bewaard bij −20 °C als de ddPCR niet onmiddellijk wordt uitgevoerd.
   5. Selecteer drie van de verdunningen voor de ddPCR. De keuze van de te gebruiken verdunning hangt af van de concentratie van het virus. Gebruik bij voorkeur drie verschillende verdunningen (bijv. 1:40.000, 1:160.000 en 1:640.000) om de beste verdunning te vinden die binnen de detectiegrens van de machine valt.
   6. Houd de reagentia op ijs tijdens het werk. Bereid een hoofdmix voor (alle monsters worden in duplicaten gemeten). Bereid voor elke reactie het volgende: 12,5 μL ddPCR Supermix voor probes, geen dUTP, 1,25 μL PrimeTime Std qPCR Assay, AAV-ITR (zie Materiaaltabel) en 6,25 μL nf-H₂O.
   7. Meng 5 μL DNA met 20 μL van de mastermix. Voer dit uit voor de verdunningen 1:40.000, 1:160.000 en 1:640.000.
   8. Plaats een cartridge in de cartridgehouder. Voeg 70 μL druppelolie toe aan de sondes in de rij die als olie wordt aangeduid. Pas op dat je geen bubbels genereert.
   9. Voeg 20 μL van het monstervolume toe in de rij die als monster wordt aangeduid. Pas op dat je geen bubbels genereert.
   10. Sluit de patroon af met de pakking en plaats deze in de druppelgenerator. Genereer de druppels door op de startknop op de machine te drukken, verwijder de pakking en breng voorzichtig, met een meerkanaals pipet, 40 μL van de gegenereerde druppels over in een 96-well plaat. Werk langzaam om vernietiging van de druppels en luchtbellen te voorkomen.
   11. Sluit de 96-well plaat af met pierce foil (de rode streep naar boven gericht) met behulp van de PCR platensealer. Plaats de plaat in een thermocycler.
   12. Stel het volume in op 40 μL, de dekseltemperatuur op 105 °C en de hellingsnelheden op 2 °C/s. Voer het PCR-programma uit zoals beschreven in tabel 2.
   13. Zet de druppellezer 30 minuten voor gebruik aan. Open de software op het bureaublad.
   14. Voer de plaatindeling in en selecteer ABS op het experimenttabblad en ddPCR Supermix op het tabblad Supermix. Druk vervolgens eerst op PRIME, gevolgd door op FLUSH SYSTEM op de software te klikken om het systeem te starten.
   15. Voer de plaat in de lezer in. Start de run en exporteer de gegevens als u klaar bent als csv-bestand voor verdere analyse als spreadsheet.
       OPMERKING: De getallen die door de software worden gegenereerd, zijn genoomkopieën (GC) per μL. Deze moeten worden vermenigvuldigd met de verdunningsfactoren: GC/μL x 5 (verdunning van het DNA in het mastermengsel) x initiële verdunning (d.w.z. 40.000 of 160.000).

Figuur 3: Schematisch overzicht van intronische en exonische targeting tijdens CRISPR/Cas9 HDR knock-in. Schematische vergelijking tussen intronische en exonische targetingstrategieën voor CRISPR / Cas9 HDR knock-in. (A) Tijdens intronisch richten wordt een dubbelstrengsbreuk ingebracht in een intron van het DNA. De HDR-sjabloon bestaat uit een LHA-, cDNA-reeks en RHA. De intronische targeting vereist bovendien de aanwezigheid van een slice acceptor met de 3 'splice site, branch point en het polypyrimidinekanaal. Dit zorgt voor een correcte splicing. Het groene vak met stippen vertegenwoordigt het gebied dat overeenkomt met de SA-reeks. De grootte van de SA is 150 bp. (B) Exonische targeting is afhankelijk van de productie van een dubbelstrengs breuk direct in het exon. De HDR-sjabloon bestaat uit een LHA-, cDNA-reeks en RHA. De oranje gestippelde vakken geven de gebieden aan die overeenkomen met de LHA en RHA. De ideale grootte van de HAs is 400 bp elk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Initiatiefnemers
Naam	Lengte	Beschrijving
SFFV	492 bp	Milt Focus Vormen Virus promotor. Sterke zoogdierpromotor. Constitutief uitgedrukt
UBC	400 bp	Promotor afgeleid van het humane ubiquitine C-gen. Constitutief uitgedrukt.
Cmv	508 bp	Promotor afgeleid van het Cytomegalovirus. Het kan een enhancer-regio bevatten. Constitutief uitgedrukt. Sterke zoogdierpromotor. Kan het zwijgen worden opgelegd.
EF-1a	1182 bp	Menselijke eukaryote translatie-elongatiefactor 1 alfapromotor. Constitutief uitgedrukt. Sterke zoogdierpromotor.
EFS	200-300 bp	EF-1 alfa-intron-loze korte vorm
CAG	584 bp	Hybride zoogdierpromotor met de CMV early enhancer (C), de chicken beta actin promoter (A) en de splice acceptor voor het rabbit beta-globin gen (G). Constitutief uitgedrukt.
Polyadenylation (PolyA) signalen
Afkorting	Lengte	Beschrijving
SV40 PolyA	82-122 bp	Simian virus 40 polyadenylation signaal
BGH PolyA	224 bp	Bovine groeihormoon polyadenylation signaal
RbGlob PolyA	56 bp	Konijn beta globine polyadenylation signaal

Tabel 1: Promotors en polyadenylation signalen.

Stap	Temperatuur	Tijd	Cycli
Enzymactivering	95°C	10 minuten	1x
Denaturatie	94 °C	30 seconden	42x
Annealing	60°C	1 minuut
Extensie	72 °C	30 seconden
Enzym deactivering	98 °C	10 minuten	1x
Houden	4 °C	∞

Tabel 2: Digitaal druppel PCR-programma.

3. Bewerken van HSPC's

1. Transfectie en transductie van HSPC's
   1. Ontdooi CD34⁺ HSPC's en breng de cellen over in 10 ml voorverwarmd RPMI aangevuld met 1% P/S. Centrifugeer bij 350 x g bij RT gedurende 10 minuten.
   2. Suspensie de cellen in HSPC-retentiemedium tot een concentratie van 2,5 x 10⁵ cellen /ml en incubeer bij 37 °C/5% CO₂ gedurende 48 h - 72 h.
   3. Oogst de cellen in een buis van 15 ml. Tel de cellen en controleer de levensvatbaarheid van de cel door trypan blue-uitsluiting. Tussen 2 x 10⁵ en 5 x 10^{kunnen 6} cellen worden gekernamineerd in een enkele cuvette. Bereid het juiste aantal cuvetten voor, afhankelijk van uw berekende celnummer.
   4. Bereid het RNP-complex voor. Voeg in een buis van 1,5 ml 15 μg Cas9 en 8 μg sgRNA (molaire verhouding 1:2,5) toe en incubeer bij 25 °C gedurende 10 minuten in een verwarmingsblok.
   5. Terwijl het RNP-complex broedt, centrifugeer je de cellen gedurende 5 minuten op 350 x g en gooi je het supernatant weg.
   6. Suspensie de cellen in 100 μL nucleofectionoplossing. Meng de cellen met het RNP-complex en breng over in de cuvette.
   7. Tik voorzichtig op de cuvette om eventuele resterende luchtbellen te verwijderen die zich tijdens de overdracht hebben gevormd.
   8. Plaats het cuvet in de houder van het transfectiesysteem en elektroporaat de cellen zoals eerder beschreven in de sgRNA-ontwerpsectie.
   9. Voeg onmiddellijk na elektroporatie 400 μL voorverwarmd HSPC-retentiemedium zonder P/S toe en breng de cellen met een fijne transferpipet over in een weefselkweekplaat met 500 μL voorverwarmd HSPC-retentiemedium zonder P/S. Gebruik, afhankelijk van het celnummer, een geschikte kweekplaat (24-, 12- of 6-wellsplaat) om een dichtheid te bereiken tussen 0,25 x 10⁶ en 1 x 10⁶ cellen/ml. Breng de plaat over naar de incubator bij 37 °C/5% CO₂.
   10. Ontdooi de injectieflacons met de bevroren rAAVs op ijs. Transduceer de cellen door de optimale hoeveelheid van elke rAAV6 naar de celsuspensie te pipetteren. Voer de transductie uit binnen 20-30 minuten na de elektroporatie om hoge transductie-efficiënties te krijgen.
       OPMERKING: De optimale concentratie van elk virus (één virus voor de WT HDR-sjabloon en een ander afzonderlijk virus voor de gemuteerde HDR-sjabloon) moet experimenteel worden bepaald. Gewoonlijk resulteren 5.000-10.000 GC / cel (bijv. 5 x 10⁹ GC voor 1 x 10⁶ cellen) in hoge transductie.
   11. Meng de celsuspensie voorzichtig met de pipet. Incubeer de getransduceerde cellen gedurende 6-8 uur bij 37 °C/5% CO₂. Na 6-8 uur verzamelt u de cellen in een buis en centrifugeert u gedurende 5 minuten bij 350 x g bij RT.
   12. Gooi het oude medium weg en vervang het door vers voorverwarmd HSPC-retentiemedium aangevuld met P/S.
   13. Suspensie de cellen in een concentratie tussen 2,5 x 10^5-5 x 10⁵ cellen / ml en breng over naar een met weefsel behandelde celkweekplaat (24-, 12- of 6-wellsplaat). Incubeer de cellen gedurende 48 uur bij 37 °C/5% CO₂ voordat u verder gaat met sorteren.
2. Flowsortering van de gemanipuleerde HSPC's met de heterozygote GOF-mutatie
   1. Oogst de cellen in een buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 350 x g bij RT. Verwijder het supernatant, suspensie de cellen in 1 ml DPBS met 0,1% BSA en centrifugeer opnieuw bij 350 x g bij RT gedurende 5 minuten.
   2. Gooi het supernatant weg en hang de cellen op in een geschikt volume DPBS + 0,1% BSA, afhankelijk van het celnummer.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de cellen op te schorten bij een minimumvolume van 200 μL en niet meer dan 1 x 10⁷ cellen / ml om het risico op verstopping van de sorteerder te verminderen.
   3. Breng de cellen over in een steriele FACS-buis uitgerust met een dop. Voeg 7-AAD of andere levensvatbaarheidskleurstof (afhankelijk van hun compatibiliteit met de fluorescerende eiwitten) toe aan de celsuspensie voor uitsluiting van levende / dode cellen.
   4. Sorteer de levende cellen die dubbel positief zijn voor de fluorescerende reportereiwitten in een verzamelbuis met 200 μL HSPC-retentiemedium.
      OPMERKING: Er moeten passende controles worden toegevoegd die bestaan uit cellen die alleen met AAV's worden overgeladen om ervoor te zorgen dat de gaten tijdens de sorteerprocedure goed worden vastgezet.
   5. Centrifugeer de gesorteerde cellen bij 350 x g bij RT gedurende 5 minuten en suspensie de cellen in HSPC-retentiemedium in een concentratie van 2,5 x 10⁵ cellen / ml voor verdere uitbreiding in cultuur of gebruik de cellen direct voor functionele testen.

4. Bevestiging van succesvolle genbewerking

1. Genomische DNA-extractie
   1. Stel voordat u begint de verwarmingsblokken in op 65 °C en 98 °C. Oogst 2 x 10⁵ genoom-bewerkte en sorteer-gezuiverde cellen en centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 min.
   2. Extraheer de gDNA zoals eerder beschreven. Gebruik de DNA-oplossing direct voor PCR of bewaar bij −20 °C.
2. In-Out PCR
   1. Ontwerp twee primers om de inbrengplaats van 5' te versterken (figuur 4A): primer forward 1 richt zich op de genomische locus buiten de linker homologiearm; primer reverse 2 richt zich op de geïntegreerde reeks.
   2. Bereid voor de in-out PCR de volgende PCR-mix per reactie:
      10 μL PCR Master Mix (2x; zie Materiaaltabel)
      1 μL primer forward 1 (10 μM voorraad)
      1 μL primer reverse 2 (10 μM bouillon)
      0,5-1,0 μL geëxtraheerd DNA
      Nucleasevrij H₂O tot een eindvolume van 20 μL
      OPMERKING: Voor meer dan één reactie is het raadzaam om een hoofdmix te bereiden die één extra reactie bevat om rekening te houden met pipetteerfouten. Het is belangrijk om een niet-sjablooncontrole en sjabloon-DNA op te nemen van een met mock behandeld monster.
   3. Voer de PCR-reacties uit met het juiste thermische cyclusprogramma (zie de instructies van de fabrikant).
      LET OP: Het is raadzaam om eerst het primerpaar uit te testen op de optimale gloeitemperatuur. Dit kan worden gedaan door de Tm te berekenen en vervolgens door de PCR uit te voeren met een thermocycler die een gradiënttemperatuur kan uitvoeren.
   4. Voer de PCR-producten met een DNA-ladder uit op een 1,5% agarose-gel bij 100 V gedurende 45-60 minuten (figuur 4B). Plaats de gel op een blauw licht of UV-transilluminator. Snijd de banden uit de gel.
   5. Haal het DNA uit de banden met behulp van een DNA-gelextractiekit. Stuur de geëxtraheerde PCR-monsters met de juiste primers voor Sanger-sequencing om de juiste en naadloze integratie van het gewenste cDNA op de endogene genlocus te bevestigen.

Figuur 4: Validatie van genomische integratie door in-out PCR. (A) Schematische weergave van de in-out PCR-strategie. In de afgebeelde strategie werden twee primers ontworpen. De primer forward 1 richt zich op de genomische locus buiten de LHA en de primer reverse 2 richt zich op de codon-geoptimaliseerde sequentie. (B) Schematische weergave van een agarose gel elektroforese. Alleen bewerkte cellen (RNP + AAV) genereren een PCR-product tijdens de in-out PCR, terwijl de onbewerkte voorbeelden (alleen AAV) geen PCR-product genereren. Afkorting: NTC = non-template control. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Results

Door toepassing van het hierboven beschreven protocol werden heterozygote type 1 CALR-mutaties reproduceerbaar geïntroduceerd in van navelstrengbloed afgeleide HSPC's. Deze mutatie bestaat uit een 52 bp deletie in exon 9 (het laatste exon van CALR), wat resulteert in een +1 frameshift, wat leidt tot de vertaling van een nieuw positief geladen C-terminal domein^26,33. Om de CALR-mutatie bij de endogene genlocus te introduceren, werd een intronische targetingstrategie vóór exon 9 gevolgd, omdat dit ongewenste veranderingen in de coderingssequentie zou omzeilen in gevallen waarin de cas9-geïnduceerde DSB niet via het HDR-mechanisme werd gerepareerd. In dit specifieke geval werd een sgRNA voor intron 7 ontworpen vanwege de beschikbaarheid van hoge on-target en lage off-target sequenties in combinatie met gunstige homologiearmen (gebrek aan sequentieherhalingen; Figuur 5A).

Twee donorsjablonen werden vervolgens ontworpen en verpakt in AAV6-vectoren. Om correcte splicing van de endogene exonen naar het geïntegreerde cDNA mogelijk te maken, bevatten de donorsjablonen (i) een SA-sequentie inclusief de 3'-splice-site, het vertakkingspunt en het polypyrimidinekanaal, (ii) de codon-geoptimaliseerde cDNA-sequentie van exonen 8-9, hetzij met de WT (CALR^WT) of de gemuteerde sequentie (CALR^DEL ) met inbegrip van een stopcodon, iii) een simianvirus 40 (SV40) polyA-signaal, iv) een sequentie die codeert voor een fluorescerend eiwit onder controle van de afzonderlijke interne promotor, de miltfocusvormende viruspromotor (SFFV), gevolgd door v) een boviene groeihormoon (bGH) polyA-signaal. Het donorsjabloon met de CALR^WT cDNA is ontworpen om een GFP-cassette te bevatten, terwijl het donorsjabloon met de CALR^DEL cDNA-sequentie is ontworpen om een BFP-cassette te bevatten. Het hele bouwwerk werd geflankeerd door een links en rechts HA (figuur 5A).

Twee dagen na transfectie met het RNP-complex en transductie met de rAAV6-virussen werden de cellen geanalyseerd met flowcytometrie. Er konden vier hoofdpopulaties worden gedetecteerd: (i) cellen die noch de GFP noch de BFP tot expressie brengen, die cellen vertegenwoordigen zonder hdr-gebaseerde genoombewerking, (ii) cellen die alleen positief zijn voor GFP, die cellen vertegenwoordigen die alleen het WT-construct hadden geïntegreerd, (iii) cellen die alleen positief zijn voor BFP, die cellen vertegenwoordigen die alleen het gemuteerde construct hadden geïntegreerd, en (iv) GFP- en BFP-dubbelpositieve cellen, de cellen vertegenwoordigen die zowel de WT- als de gemuteerde sequenties hadden geïntegreerd (figuur 5B). Om zuivere populaties van HSPC's met de heterozygote type 1 CALR-mutatie te verkrijgen, werden de dubbelpositieve cellen gesorteerd door flowcytometrie. HSPC's waarin twee WT-sequenties werden ingeklopt, werden gebruikt als controlecellen (GFP+ mCherry+; Figuur 5B). Een geldig alternatief om te gebruiken als controlecellen zou HSPC's zijn met een biallelische integratie van de fluorescerende eiwitten in een veilige haven locus (d.w.z. AAVS1; niet getoond). Celtelling door trypanblauwe uitsluiting uitgevoerd op de gesorteerde HSPC's gaf aan dat meer dan 90% van de cellen levensvatbaar was.

Naadloze on-target integratie van de constructen werd bevestigd door de toepassing van de in-out PCR-strategie (figuur 6A). In dit specifieke geval voerden we twee afzonderlijke in-out PCR's uit, één voor de knocked-in CALR^WT-sequentie (lane 1 van de gel-elektroforese in figuur 6A) en één voor de knocked-in CALR^{DEL-sequentie} (lane 2 van de gel-elektroforese van figuur 6A). Sanger-sequencing uitgevoerd op het DNA geëxtraheerd uit de gelbanden bevestigde de juiste insertie van de WT en gemuteerde sequenties in de CALR^{DEL / WT} HSPCs (figuur 6B).

Figuur 5: Generatie van HSPC's met de heterozygote CALR-mutatie. (A) Representatief schema dat de bewerkingsstrategie weergeeft voor het inbrengen van de heterozygote CALR-mutatie . Het RNP-complex richt zich op het intron tussen exon 7 en exon 8 van het CALR-gen . Twee AAV's, een met de gemuteerde exonen 8-9 en een BFP en de andere met de WT-exonen 8-9 en een GFP, zullen dienen als donorreparatiesjablonen en zullen de integratie van de gemuteerde sequentie in één allel en de integratie van de WT-sequentie in het resterende allel bevorderen. (B) Representatieve flowcytometrieplots die de expressie van GFP en BFP of GFP weergeven en mCherry 48 h na de transfectie en transductie van HSPC's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Validatie van succesvolle heterozygote CALR-mutatie in HSPC's. (A) Gel-elektroforese van de producten van de in-out PCR uitgevoerd op genomisch DNA geëxtraheerd uit AAV-controles, CALR^{WT / WT} en CALR^{DEL / WT}. Er werd gebruik gemaakt van een DNA-ladder van 100 bp. Afkorting: NTC = non-template control. (B) Sanger-sequencingresultaten verkregen van de in-out PCR's uitgevoerd op CALR^DEL/WT die een succesvolle integratie van de WT en gemuteerde sequenties bevestigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De efficiënte en nauwkeurige genetische manipulatie van menselijke primaire HSPC's biedt een geweldige kans om de processen te onderzoeken en te begrijpen die de normale hematopoëse beïnvloeden, en vooral de leukemische transformatie van hematopoëtische cellen.

In dit protocol werd een efficiënte strategie beschreven om menselijke HSPC's te engineeren om terugkerende heterozygote GOF-mutaties tot expressie te brengen. Deze procedure maakte gebruik van CRISPR/Cas9-technologie en rAAV6-vectoren als donoren voor DNA-sjablonen om nauwkeurig WT- en mutante DNA-sequenties in hun endogene genloci in te voegen. Het koppelen van de gemanipuleerde cDA's (WT en mutant) met gescheiden fluorescerende reportereiwitten maakt de verrijking en tracking van cellen met een definitieve heterozygote toestand mogelijk.

Deze strategie biedt verschillende voordelen ten opzichte van de veelgebruikte lentivirale (LV)-gebaseerde methoden. Een groot voordeel is dat het crispr/cas9-gebaseerde systeem een nauwkeurige bewerking in de endogene loci mogelijk maakt, wat resulteert in het behoud van de endogene promotors en regulerende elementen. Dit leidt tot homogeniteit in de expressie van het bewerkte gen in de cellen, een doel dat nauwelijks haalbaar is wanneer een LV-gebaseerde methode wordt gebruikt. Genoverdracht met LV-vectoren leidt tot semi-willekeurige integratie van het gen met voorkeur voor transcriptioneel actieve sites³⁴. Dit kan zich vertalen in overexpressie van het overgedragen gen en heterogeniteit tussen de bewerkte cellen, wat uiteindelijk resulteert in moeilijkheden om de rol van mutaties en geninteracties te onderzoeken en te analyseren. Een tweede voordeel is dat het beschreven systeem, omdat het een sitespecifiek bewerkingssysteem is, de risico's van insertionele mutagenese^{elimineert 35}.

De dual fluorescent reporter-strategie maakt de nauwkeurige verrijking en tracking mogelijk van cellen die met succes op beide allelen zijn bewerkt, waarbij één allel het WT-cDNA integreert en het andere allel de gemuteerde cDNA-sequenties integreert. Cellen die slechts één reporter uitdrukken, vertegenwoordigen alleen monoallelische integratie of biallelische integratie van HDR-sjablonen met dezelfde fluorescerende reporter. Beide scenario's kunnen alleen nauwkeurig worden onderscheiden als van één cel afgeleide klonen worden geproduceerd en individueel worden geanalyseerd. HSPC's hebben echter slechts een beperkte proliferatieve capaciteit in vitro, en wanneer ze gedurende langere tijd in cultuur worden gehouden, beginnen HSPC's zich te onderscheiden in meer volwassen nakomelingen en verliezen ze hun zelfvernieuwings- en transplantatiecapaciteit. Dit maakt het selecteren en uitbreiden van eencellige klonen met de gewenste heterozygote mutatie onhaalbaar. De toepassing van de dual fluorescente eiwitstrategie en verrijking door flowcytometrie voor cellen met de heterozygote mutatie maakt het mogelijk om de problemen te omzeilen die worden veroorzaakt door uitgebreide in vitro kweek.

In dit specifieke voorbeeld werd met succes aangetoond dat HSPC's efficiënt konden worden ontworpen en gesorteerd om zuivere populaties van HSPC's te verkrijgen die de heterozygote CALR^{DEL/WT-mutatie} dragen.

Dit systeem is echter niet beperkt tot het engineeren van heterozygote frameshift-mutaties, maar kan ook gemakkelijk worden toegepast om andere mutatietypen te creëren, waaronder missense- en onzinmutaties. Door verschillende combinaties van AAV's met WT of gemuteerde sequenties met verschillende fluorescerende reportereiwitten toe te passen, kan dit systeem ook worden gebruikt voor de introductie van homozygote mutaties (gelijktijdige transductie met twee rAAVs die beide mutant cDNA dragen maar verschillende fluorescerende reporters) of zelfs de correctie van mutaties (gelijktijdige transductie met twee AAV's die beide WT cDNA dragen, maar verschillende fluorescerende reporters). Daarnaast is het belangrijk om te vermelden dat deze strategie niet beperkt is tot de introductie van oncogene GOF-mutaties. In feite kan het beschreven protocol worden gebruikt voor meerdere alternatieve strategieën, waaronder gen knock-out, genvervanging^36,37, gerichte knock-in van transgenen (d.w.z. chimere antigeenreceptoren)³⁸, en zelfs voor de correctie van ziekteveroorzakende mutaties^11,39.

De strategie om CRISPR/Cas9 en AAV6 te combineren met meerdere fluorescerende melders is ook toepasbaar gebleken in vele andere celtypen, waaronder T-cellen, plasmacytoïde dendritische cellen, geïnduceerde pluripotente stamcellen, neuronale stamcellen en luchtwegstamcellen 24,38,40,41,42,43,44 . Deze strategie kan worden geïmplementeerd voor de productie van superieure chimere antigeenreceptor (CAR) T-cellen. Onlangs werd bijvoorbeeld gepubliceerd dat CRISPR / Cas9-gemedieerde knock-out van het TGFBR2-gen in CAR T-cellen hun functie in de onderdrukkende TGF-β rijke tumormicro-omgeving aanzienlijk verhoogt⁴⁵. Een dergelijke aanpak zou een eenstapsprotocol kunnen bieden om zowel de T-cellen te engineeren om de CAR tot expressie te brengen als om het TGFBR2-gen uit te schakelen door de CAR specifiek in beide allelen van het TGFBR2-gen in te brengen. Bovendien zou deze aanpak ook nuttig kunnen zijn om universele CAR T-cellen te genereren door de CAR te integreren in het T-celreceptor alfaconstante (TRAC) gen^46,47.

Om de reproduceerbaarheid te vergroten en een efficiënte bewerking van de cellen te garanderen, moeten enkele belangrijke overwegingen worden overwogen. De belangrijkste kritieke punten voor een succesvolle bewerking van de cellen liggen in (i) de selectie van het sgRNA, (ii) het ontwerp van de HDR-sjabloon en (iii) de rAAV6-productie.

De selectie van een goed presterend sgRNA is cruciaal omdat het het maximale aantal allelen bepaalt waarin de HDR-sjabloon kan worden geïntegreerd. Door de vele software die nu beschikbaar is, is de zoektocht naar kandidaat-sgRNA's vereenvoudigd. Door de regio van belang te selecteren, kan de software een reeks sgRNA's voorstellen met een on-target score en een off-target score die de kansen voor bewerking op respectievelijk de gewenste locus en ongewenste loci aangeven. Deze scores worden berekend op basis van eerder gepubliceerde scoringsmodellen^48,49. Hoewel dit een goed uitgangspunt is voor het selecteren van een goed presterend sgRNA, moet de prestatie van het sgRNA worden bevestigd, omdat de voorspelde prestaties in silico niet altijd overeenkomen met een efficiënt sgRNA in vitro. Daarom wordt het ten zeerste aanbevolen om ten minste drie sgRNA's te ontwerpen en uit te testen om de kans op het vinden van het beste sgRNA te vergroten. Zodra een echt goed presterend sgRNA is geïdentificeerd, wordt voorgesteld om door te gaan met het ontwerp van de HDR-sjabloon.

Voorzorgsmaatregelen moeten in overweging worden genomen bij het ontwerpen van de HDR-sjabloon. De linker- en rechter homologiearmen (respectievelijk LHA en RHA) moeten elk respectievelijk 400 bp stroomopwaarts en stroomafwaarts van de sgRNA-cut-site beslaan, omdat kortere HAs kunnen resulteren in verminderde HDR-frequenties. De grootte van de cDNA die via HDR kan worden geïntroduceerd, is afhankelijk van de verpakkingsmogelijkheden van AAV's, die ongeveer 4,7 kb is. Vanwege de vele elementen die verplicht zijn binnen de HDR-sjabloon (LHA, RHA, SA, PolyA, promotor en fluorescerende reportersequentie), is de resterende ruimte voor de gemuteerde of WT cDNA beperkt. Dit is onproblematisch als de gewenste mutatie zich in de buurt van het 3'-uiteinde van een gen bevindt of in genen met een algehele korte CDS. In gevallen waarin de mutatie zich echter in de buurt van de transcriptionele startzijde (TSS) van de genen bevindt met een lang CDS (dat de resterende verpakkingsruimte van de AAV overschrijdt), is deze beschreven aanpak mogelijk niet haalbaar. Om dit probleem te omzeilen, is onlangs een strategie ontwikkeld die afhankelijk is van het splitsen van de HDR-sjabloon in twee AAV's door Bak en collega's. Deze strategie is gebaseerd op twee afzonderlijke HDR-gemedieerde integraties om de uiteindelijke naadloze integratie van een groot gen⁵⁰ te verkrijgen.

De kwaliteit van het virus en zijn titer zijn bijkomende factoren die de succesvolle genoomtechnologie van de cellen kunnen maken of breken. Voor een optimale opbrengst is het belangrijk om de HEK293T niet volledig te laten samenvloeien terwijl hij in cultuur wordt gehouden. Idealiter zouden de HEK293T-cellen moeten worden gesplitst wanneer 70% -80% samenvloeiing is bereikt. Bovendien mag de HEK293T niet voor lange tijd worden gekweekt, omdat dit hun vermogen om virus te produceren kan verminderen. Nieuwe HEK293T-cellen moeten na 20 passages worden ontdooid. Het verkrijgen van hoge virustiters is belangrijk voor het verhogen van de efficiëntie en reproduceerbaarheid van de experimenten. Lage virale titers vertalen zich in grote hoeveelheden rAAV-oplossing die nodig zijn voor de transductie van de HSPC's. Als algemene regel geldt dat de rAAV-oplossing die aan de nucleofecteerde cellen wordt toegevoegd, niet meer dan 20% van het totale volume van het HSPC-retentiemedium mag bedragen. Hogere volumes AAV-oplossing kunnen leiden tot verhoogde celdood, lagere proliferatie en verminderde transductie-efficiëntie. In het geval van lage virustiters is het daarom aan te raden om het virus verder te concentreren.

Samenvattend biedt dit protocol een reproduceerbare aanpak om menselijke HSPC's nauwkeurig en efficiënt te manipuleren door het gelijktijdige gebruik van CRIPSR / Cas9- en rAAV6-donorsjablonen met extra dubbele fluorescerende melders. Deze aanpak is een geweldig hulpmiddel gebleken bij het bestuderen van normale hematopoëtische stamcelbiologie en de bijdragen die mutaties leveren aan leukemogenese.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
175 cm2 Cell Culture Flask, Vent Cap, TC-treated	Corning	431080
150 mm x 25 mm dishes	Corning	430599
293T	DSMZ	ACC 635	https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635
4D Nucleofector Core Unit	Lonza	-	For nucleofection of human HSPCs use the DZ-100 program.
4D Nucleofector X Unit	Lonza	-
500 ml Centrifuge Tube	Corning	431123
7-AAD	BD Biosciences	559925
AAVpro Purification Kit	Takara	6666
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3	Integrated DNA Technologies (IDT)	1081058
Avanti JXN-30 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	-
Benchling sgRNA design tool			Online tool for sgRNA design: http://www.benchling.com/crispr
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906-100G
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad	-
Chemically modified synthetic sgRNA	Synthego		Website: https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna Sequence for the sgRNA targeting intron 7 of CALR: 5’-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3’         An 80 nucleotide SpCas9 scaffold is added to the 20 nucleotide RNA sequence to complete the sgRNA. Chemical modifications of 2'-O-Methyl are added to the first and last 3 bases and 3' phosphorothioate bonds are added in the first 3 and last 2 bases.     *Alternatively chemically modified synthetic sgRNAs can be acquired from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr) and Trilink (https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos)
CHOPCHOP sgRNA design tool			Online tool for sgRNA design: http://chopchop.cbu.uib.no
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Corning	3526
CRISPick sgRNA design tool			Online tool for sgRNA design: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
CRISPOR sgRNA design tool			Online tool for sgRNA design: http://crispor.tefor.net
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad	12001925
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)	Bio-Rad	1863024
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator	Bio-Rad	1864008
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator	Bio-Rad	1863009
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	1863005
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose	Sigma-Aldrich	D6429-6X500ML
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
FACSAria Fusion	BD Biosciences	-
Falcon 5 mL Round Bottom	Corning	352054
Fetal Bovine Serum (FBS) Good Forte (heat inactivated), 500 ml	Pan Biotech	P40-47500
FlowJo 10.8.0	BD Biosciences	-
GenAgarose L.E.	Inno-train	GX04090
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0321
Gibson Assembly Master Mix	New England Biolabs Inc. (NEB)	E2611L
HEK293T
HEPES solution	Sigma-Aldrich	H0887-100ML
ICE	Synthego		https://ice.synthego.com
IDT codon optimization tool	IDT		https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool
IDT sgRNA design tool			Online tool for sgRNA design: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM
LB Broth (Lennox) EZMix powder microbial growth medium	Sigma-Aldrich	L7658-1KG
LB Broth with agar (Lennox) EZMix powder microbial growth medium	Sigma-Aldrich	L7533-1KG
Midori Green Advance	Nippon Genetics	MG04
Monarch Plasmid Miniprep Kit	NEB	T1010L
Monarch DNA Gel Extraction Kit	NEB	T1020L
NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency)	NEB	C2987U
Nuclease-Free Water, 5X100 ml	Ambion	AM9939
NucleoBond Xtra Midi	Macherey-Nagel	740410
Opti-MEM, Reduced Serum Medium, 500 ml	Gibco	31985070
P3 Primary Cell 4D-Nucleofetor  X Kit L	Lonza	V4XP-3024	The Lonza Primary P3 solution is supplied as a 2.25 mL P3 Primary Cell Nucleofector Solution and 0.5 mL Supplement 1. To reconstitute, add the Supplement 1 to the P3 Primary Cell Nucleofector Solution and mix.
pAAV-MCS2	Addgene	46954
PCR Plate Heat Seal Foil, pierceable	Bio-Rad	1814040
pDGM6	Addgene	110660
Penicillin-Streptomycin (P/S)	Gibco	15140122
Polyethylenimine (PEI)	Polysciences	23966	Add 50 mL of PBS 4.5 pH (made with HCl) to 50 mg of PEI in a tube. Dissolve by placing the tube in a 70°C water bath and vortexing every 10 minutes until the solution is dissolved. After the solution has reached RT, filter sterilze through a 0.22 μm filter, make 1120 μL aliquots, and store at -80°C.
Polystyrene Test Tube, with Snap Cap
Primers	Eurofins	-	Primers were ordered from Eurofins (eurofinsgenomics.eu) as unmodified salt free custom oligos. The primers were designed by using PRIMER-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)                                                     Primer 1 Fwd:    AAGTGATCCGTTCGCCATGAC;                Primer 2 Rev CALR WT specific: ACGTCCTCTTCCTCGTCCTC;                     Primer 2 Rev CALR DEL specific: CCAACCCTGGAGACACGCTTC
PrimeTime qPCR Primer Assay	IDT	-	PrimeTime qPCR Probe Assays (1 probe/2 primers)  that can be ordered from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry). Scale: Std - qPCR Assay 500 reactions; Primer 1 Forward (5'-3') : GGAACCCCTAGTGATGGAGTT; Primer 2 Reverse (5'-3'): CGGCCTCAGTGAGCGA; Probe (5'-3'): CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG; 5' Dye/3' Quencher: FAM/ZEN/IBFQ; Primer to probe ratio: 3.6
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad	1814000
QuantaSoft Software	Bio-Rad
Quick Extract DNA Extraction Solution	Lucigen	QE0905T
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	1864002
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad
Recombinant human Flt3-ligand	Peprotech	300-19
Recombinant human IL-6	Peprotech	200-06
Recombinant Human SCF	Peprotech	300-07
Recombinant Human TPO	Peprotech	300-18
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758-6X500ML
SnapGene	Dotmatics		Molecular cloning software https://www.snapgene.com *Alternatively also Benchling (https://www.benchling.com) and Geneious (https://www.geneious.com) can be used.
Soc outgrowth medium	NEB	B9020S
Sodium-butyrate	Sigma-Aldrich	B5887-1G
Stem Regenin 1 (SR1)	Biogems	1224999
StemSpan SFEM II	STEMCELL Technologies	9655
TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) 50X	Thermo Scientific	B49
TIDE			http://shinyapps.datacurators.nl/tide/
Trypan blue 0.4%	Sigma-Aldrich	T8154-100ML
TrypLE (with phenol red), 500 ml	Thermo Scientific	16605-028
UltraPure 0.5: EDTA, pH 8.0, 100 ml	Thermo Scientific	15575-038
UM171	STEMCELL Technologies	72914
Vector Builder codon optimization tool	Vector Builder		https://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html