Methodenartikel

Gebruik van time-lapse microscopie en stadiumspecifieke nucleaire uitputting van eiwitten om meiose in S. cerevisiae te bestuderen

DOI:

10.3791/64580

⸱

11 oktober 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Indiana University, 2Stowers Institute for Biomedical Research

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Time-lapse microscopie is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van meiose in ontluikende gist. Dit protocol beschrijft een methode die celcyclussynchronisatie, time-lapse-microscopie en voorwaardelijke uitputting van een doeleiwit combineert om aan te tonen hoe de functie van een specifiek eiwit tijdens meiotische chromosoomsegregatie kan worden bestudeerd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Time-lapse fluorescentiemicroscopie heeft een revolutie teweeggebracht in het begrip van meiotische celcyclusgebeurtenissen door temporele en ruimtelijke gegevens te verstrekken die vaak niet worden gezien door het afbeelden van vaste cellen. Ontluikende gist is een belangrijk modelorganisme gebleken om meiotische chromosoomsegregatie te bestuderen, omdat veel meiotische genen sterk geconserveerd zijn. Time-lapse microscopie van meiose in ontluikende gist maakt de monitoring van verschillende meiotische mutanten mogelijk om aan te tonen hoe de mutatie meiotische processen verstoort. Veel eiwitten functioneren echter op meerdere punten bij meiose. Het gebruik van functieverlies of meiotische nulmutanten kan daarom een vroeg proces verstoren, het latere proces blokkeren of verstoren en het moeilijk maken om de fenotypen te bepalen die bij elke individuele rol horen. Om deze uitdaging te omzeilen, beschrijft dit protocol hoe de eiwitten voorwaardelijk uit de kern kunnen worden uitgeput in specifieke stadia van meiose, terwijl meiotische gebeurtenissen worden gevolgd met behulp van time-lapse-microscopie. Specifiek beschrijft dit protocol hoe de cellen worden gesynchroniseerd in profase I, hoe de anker weg techniek wordt gebruikt om eiwitten uit de kern uit te putten in specifieke meiotische stadia, en hoe time-lapse beeldvorming wordt gebruikt om meiotische chromosoomsegregatie te monitoren. Als voorbeeld van het nut van de techniek werd het kinetochore-eiwit Ctf19 op verschillende tijdstippen tijdens meiose uit de kern uitgeput en werd het aantal chromatinemassa's geanalyseerd aan het einde van meiose II. Over het algemeen kan dit protocol worden aangepast om verschillende nucleaire eiwitten uit de kern uit te putten terwijl de meiotische delingen worden bewaakt.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Time-lapse fluorescentiemicroscopie is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van de dynamiek van meiotische chromosoomsegregatie in ontluikende gist 1,2. Ontluikende gistcellen kunnen worden geïnduceerd om meiose te ondergaan door uithongering van belangrijke voedingsstoffen3. Tijdens meiose ondergaan cellen één ronde van chromosoomsegregatie gevolgd door twee delingen om vier meiotische producten te creëren die in sporen zijn verpakt (figuur 1). Individuele cellen kunnen worden gevisualiseerd in elk stadium van meiose, wat ruimtelijke en temporele gegevens genereert die gemakkelijk kunnen worden gemist door beeldvorming met vaste cellen. Dit protocol laat zien hoe het combineren van time-lapse fluorescentiemicroscopie met twee eerder vastgestelde methoden, het induceerbare NDT80-systeem (NDT80-in) en de ankerwegtechniek, kan worden gebruikt om de functie van specifieke eiwitten in verschillende meiotische stadia te bestuderen.

Het NDT80-in systeem is een krachtig hulpmiddel voor meiotische celcyclussynchronisatie dat vertrouwt op de induceerbare expressie van de transcriptiefactor van de middelste meiose NDT80 4,5. NDT80-expressie is vereist voor profase I-uitgang 6,7. Met het NDT80-in-systeem staat NDT80 onder controle van de GAL1-10-promotor in cellen die de Gal4-transcriptiefactor tot expressie brengen die is gefuseerd tot een oestrogeenreceptor (Gal4-ER)4,5. Omdat Gal4-ER alleen de kern binnenkomt wanneer het gebonden is aan β-oestradiol, arresteren NDT80-in-cellen in profase I bij afwezigheid van β-oestradiol, wat de synchronisatie van cellen in profase I mogelijk maakt (figuur 1). β-oestradioltoevoeging bevordert de translocatie van de Gal4-ER transcriptiefactor in de kern, waar het GAL1-10 bindt om de expressie van NDT80 aan te drijven, wat leidt tot synchrone toegang tot de meiotische delingen. Hoewel time-lapse microscopie zonder synchronisatie kan worden uitgevoerd, is het voordeel van het gebruik van synchronisatie de mogelijkheid om een remmer of een medicijn toe te voegen terwijl cellen zich in een specifiek stadium van meiose bevinden.

De anker weg techniek is een induceerbaar systeem waarbij een eiwit uit de kern kan worden uitgeput met de toevoeging van rapamycine8. Deze techniek is ideaal voor het bestuderen van nucleaire eiwitten tijdens celdeling in ontluikende gist omdat gistcellen gesloten mitose en meiose ondergaan, waarbij de nucleaire envelop niet afbreekt. Bovendien is deze techniek zeer nuttig voor eiwitten die meerdere functies hebben tijdens meiose. In tegenstelling tot deleties, mutante allelen of meiotische nul-allelen, brengt het verwijderen van een doeleiwit uit de kern in een specifiek stadium de doeleiwitactiviteit in eerdere stadia niet in gevaar, waardoor een nauwkeuriger interpretatie van de resultaten mogelijk is. Het ankersysteem maakt gebruik van het sluiten van ribosomale subeenheden tussen de kern en het cytoplasma die optreedt bij ribosomale rijping8. Om het doeleiwit uit de kern uit te putten, wordt het doeleiwit gelabeld met het FKBP12-rapamycine-bindingsdomein (FRB) in een stam waarin de ribosomale subeenheid Rpl13A is gelabeld met FKBP12. Zonder rapamycine werken FRB en FKBP12 niet op elkaar in en blijft het FRB-gelabelde eiwit in de kern. Bij toevoeging aan rapamycine vormt de rapamycine een stabiel complex met FKBP12 en FRB, en het complex wordt uit de kern gehaald vanwege de interactie met Rpl13A (figuur 1). Om celdood bij toevoeging van rapamycine te voorkomen, herbergen cellen de tor1-1-mutatie van het TOR1-gen . Bovendien bevatten deze cellen fpr1Δ, een nulallel van het S. cerevisiae FKBP12-eiwit, dat voorkomt dat endogene Fpr1 Rpl13A-FKBP12 voor FRB- en rapamycinebinding uitconcurreert. De ankerachtergrondmutaties, tor1-1 en fpr1Δ, hebben geen invloed op meiotische timings of chromosoomsegregatie2.

Om het nut van deze techniek aan te tonen, werd het kinetochore-eiwit Ctf19 op verschillende tijdstippen tijdens meiose uitgeput. Ctf19 is een component van het kinetochore dat overbodig is bij mitose, maar vereist is voor een goede chromosoomsegregatie bij meiose 9,10,11,12,13. Bij meiose wordt het kinetochore afgeworpen in profase I en ctf19 is belangrijk voor kinetochore re-assembly 9,14. Voor dit protocol werden cellen met het NDT80-in-systeem gesynchroniseerd en werd de ankerwegtechniek gebruikt om het doeleiwit Ctf19 uit de kern uit te putten voor en na de afgifte uit profase I en na meiose I-chromosoomsegregatie (figuur 1). Dit protocol kan worden aangepast om andere eiwitten van belang in elk stadium van meiose en mitose uit te putten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van de benodigde materialen

  1. Bereid reagentia voor op de groei en sporulatie van gistcellen.
    OPMERKING: Als ontluikende giststammen ade2- en trp1- zijn, vul dan alle media aan in stap 1.1.1-1.1.3 met een eindconcentratie van 0,01% adenine en 0,01% tryptofaan uit 1% voorraden. Als u media steriliseert door autoclaaf, voeg deze aminozuren dan pas toe nadat de reagentia zijn geautoclaveerd en tot kamertemperatuur zijn afgekoeld.
    1. Bereid voor vegetatieve groei 2x synthetisch compleet + dextrosemedium (2XSC) door 6,7 g giststikstofbase op te lossen zonder aminozuren, 2 g volledige aminozuurmix en 20 g dextrose in 500 ml water. Steriliseer het mengsel door gedurende 20 minuten te autoclaveren bij 121 °C of te filteren door een filter van 0,2 μm.
    2. Bereid voor de eerste stap van sporulatie 2x synthetisch compleet + acetaatmedium (2XSCA) door 6,7 g giststikstofbase op te lossen zonder aminozuren, 2 g volledige aminozuurmix en 20 g kaliumacetaat in 500 ml water. Steriliseer het mengsel door gedurende 20 minuten te autoclaveren bij 121 °C of te filteren door een filter van 0,2 μm.
    3. Bereid voor de laatste stap van sporulatie 1% kaliumacetaat (1% KAc) door 5 g KAc op te lossen in 500 ml water. Steriliseer het mengsel door gedurende 20 minuten te autoclaveren bij 121 °C of te filteren door een filter van 0,2 μm.
  2. Bereid medicijnen en reagentia voor op microscopie, synchronisatie en verankering.
    1. Voor het hechten van cellen aan de coverslip tijdens time-lapse beeldvorming, maak 1 mg / ml concanavaline A (ConA) in 1x PBS. Filter steriliseer met een filter van 0,2 μm en bewaar kleine (~10 μL) aliquots bij -20 °C.
    2. Om het NDT80-in systeem te gebruiken, maakt u 2 ml 1 mM β-oestradiol opgelost in ethanol. Filtersteriliseer met een filter van 0,2 μm en bewaar aliquots (~500 μL) bij -20 °C.
    3. Maak voor het ankersysteem 1 mg/ml rapamycine opgelost in DMSO. Filter steriliseer met een filter van 0,2 μm en bewaar kleine (~10 μL) aliquots bij -20 °C.
      OPMERKING: Bereid kleine aliquots rapamycine voor om meerdere vries-dooicycli van het medicijn te voorkomen.
  3. Genereer giststammen die het NDT80-in-systeem (PGAL1,10-NDT80/PGAL1,10-NDT80; GAL4-ER/ GAL4-ER) en een doeleiwit gelabeld met FRB in de anker weg genetische achtergrond (tor1-1/tor1-1; fpr1Δ/ fpr1Δ; Rpl13A-FKBP12/Rpl13A-FKBP12)4,8. Ctf19-FRB werd gebruikt voor dit onderzoek. Bovendien werd één kopie van histoneiwit Htb2 getagd met mCherry om de meiotische progressie en chromatinesegregatie te kunnen volgen.
  4. Bereid een kamer voor op time-lapse beeldvorming
    1. Begin met het voorbereiden van de kamer 6 h-24 uur voorafgaand aan de beeldvorming (figuur 2). Snijd een kamer van 18 mm x 18 mm uit de pipetpuntdoos met behulp van een verwarmd scalpel of een ander scherp mes.
    2. Gebruik een plastic pipetpunt om een dunne laag siliconenkit rond de onderkant van de kamer te spreiden die zich aan de coverslip hecht. Voeg voldoende kit toe zodat de randen van de kamer volledig bedekt zijn (zie figuur 2).
    3. Bevestig de kamer op een afdekplaat van 24 mm x 50 mm door de kamer voorzichtig, kit-side-down, op de coverslip te plaatsen. Zorg ervoor dat er geen openingen in de kit zitten, zodat de kamer niet lekt.
    4. Verdeel 8-10 μL ConA over de deklip. Plaats ConA op het midden van de coverslip en gebruik een pipetpunt om de ConA in een dunne laag te verspreiden, zodat deze het grootste deel van de coverslip bedekt die door de kamer is omgeven.
      OPMERKING: Plastic kamers kunnen voor onbepaalde tijd worden hergebruikt. Nadat de time-lapse-beeldvorming is voltooid, verwijdert u de kamer van de coverslip met een scheermes, reinigt u de siliconenkit uit de kamer en houdt u de kamers ondergedompeld in 95% ethanol voor toekomstig gebruik.

2. Sporulatie van gistcellen

  1. Voer de volgende stappen uit voor uithongering van gistcellen om het meiotische programma te induceren.
    OPMERKING: Deze stappen zijn voor de sporulatie van de W303-giststam. Andere stammen kunnen andere protocollen vereisen15. Sporulatie-efficiëntie is zeer variabel tussen laboratoriumstammen, waarbij W303 een sporulatie-efficiëntie van ~ 60% 16,17,18 vertoont.
    1. Neem een enkele kolonie van de juiste diploïde giststam van een plaat en ent 2 ml 2XSC en laat 12-24 uur groeien bij 30 °C op een roltrommel tot verzadiging.
    2. Verdun de verzadigde cultuur tot 2XSCA door 80 μL van de cultuur toe te voegen van stap 2.1.1 tot 2 ml 2XSCA. Laat het 12-16 uur groeien bij 30 °C op een roltrommel. Blijf niet langer dan 16 uur in 2XSCA omdat cellen ziek of auto-fluorescerend kunnen worden.
    3. Voer twee wasbeurten uit door de cultuur gedurende 1 minuut bij 800 x g bij kamertemperatuur (25 °C) af te draaien, de vloeistof weg te gooien en de pellet in 2 ml steriel gedestilleerd water te resuspenderen.
    4. Verwijder na de tweede wasbeurt de vloeistof en resuspendeer de pellet in 2 ml 1% KAc en laat deze 8-12 uur groeien bij 25 °C op een roltrommel. Cellen die meiose zijn binnengegaan, zullen arresteren in pachyteen van profase I.
  2. Profase I release systeem
    1. Voeg β-oestradiol direct toe aan de sporulatiecultuur tot een eindconcentratie van 1 μM en vortex de kweekbuis snel. De β-oestradiol zal cellen uit profase I vrijgeven.

3. Uitputting van doeleiwit uit de kern met behulp van de anker weg techniek

  1. Voeg rapamycine toe aan de cellen om het FRB-gelabelde eiwit in een bepaald stadium uit de kern uit te putten.
    1. Om eiwitten uit de kern bij profase I-uitgang uit te putten, voegt u rapamycine toe aan een eindconcentratie van 1 μg / ml aan de sporulatiecultuurbuis op hetzelfde moment als β-oestradioltoevoeging.
    2. Om eiwitten uit de kern in een bepaald stadium van meiose uit te putten, controleert u het celcyclusstadium vanaf 60 minuten na β-oestradioltoevoeging. Pipetteer om de 20 minuten 5 μL cultuur op een afdeklip van 24 mm x 40 mm en bedek de cellen met een afdeklip van 18 mm x 18 mm. Houd culturen draaiend op de roltrommel bij 25 °C tussen de tijdstippen.
    3. Beeld de cellen af met behulp van het A594/mCherry filter en het 60x objectief van een fluorescentiemicroscoop. Stel het percentage transmissie in op 2% en de belichtingstijd op 250 ms. De aanwezigheid van één, twee of vier DNA-massa's geeft het meiotische stadium aan waarin de cellen zich hebben ontwikkeld. Voeg rapamycine toe aan een eindconcentratie van 1 μg / ml in het meiotische stadium van belang.
  2. Laat cellen draaien op de roltrommel bij 25 °C totdat ze klaar zijn voor beeldvorming. Nucleaire uitputting van een doeleiwit treedt op 30-45 minuten na toevoeging van rapamycine 2,8.

4. Time-lapse fluorescentiemicroscopie

  1. Maak een agarpad dat wordt gebruikt om een monolaag van cellen te maken voor beeldvorming (zie stap 4.2).
    1. Snijd de dop en de onderste 1/3 van een 1,5 ml microfugebuis af en gooi deze weg om een cilinder te maken. De cilinder zal dienen als een mal voor de agar pad. Maak twee cilinders om een extra te hebben voor het geval de agar niet goed polymeriseert in de eerste.
    2. Plaats de gesneden microfuge buiscilinder op een schone glazen glijbaan met de bovenkant van de buis ondersteboven op de glijbaan.
    3. Maak 6 ml van een 5% agar-oplossing (gebruik 1% KAc als oplosmiddel) in een bekerglas van 50 ml en zet het in de magnetron totdat de agar volledig is opgelost.
      OPMERKING: De agar kookt gemakkelijk over in de magnetron; let op de agar en start en stop de magnetron wanneer de agar begint te koken en het bekerglas te draaien. Start en stop de magnetron meerdere keren om de agar volledig op te lossen. De agar-oplossing wordt gemaakt boven de hoeveelheid die nodig is om ervoor te zorgen dat de agar volledig oplost.
    4. Snijd de punt van de pipet af om een grotere opening te maken en pipetteer ~ 500 μL gesmolten agar in elke microfuge buiscilinder. Laat het op kamertemperatuur zitten totdat de agar stolt (~10-12 min).
  2. Gistcellen voorbereiden voor beeldvorming
    1. Draai 200 μL van de sporulatiecultuur uit stap 3.2 bij 800 x g gedurende 2 min in microcentrifugebuizen van 1 ml. Verwijder en gooi 180 μL van het supernatant weg. Resuspendeer de pellet in het resterende supernatant door de buis te draaien en te bewegen.
    2. Pipetteer 6 μL van de geconcentreerde cellen op de afdekplaat in het midden van de kamer in stap 1.4.
    3. Houd de cilinder vast met de agarpad gemaakt in stap 4.1 en schuif deze voorzichtig van de glazen schuif. Zorg ervoor dat de agar aan de onderkant volledig plat is en oefen met behulp van de onderkant van een pipetpunt een lichte hoeveelheid druk uit op de microfuge-mal, zodat de agarpad iets boven de grens van de buis wordt geduwd.
    4. Keer de mal zodanig om dat het agarkussen naar beneden gericht is in de richting van de kamer.
    5. Plaats met behulp van een tang voorzichtig het agar-pad (nog steeds in de microfugebuisvorm) bovenop de cellen. Gebruik een pipetpunt om het agarpad 10-20 keer voorzichtig rond de kamer te schuiven om een monolaag van cellen op de coverslip te maken.
    6. Laat het agarkussen 12-15 minuten in de kamer staan. Met deze stap kunnen de cellen zich hechten aan de ConA op de coverslip.
    7. Breng 2 ml sporulatiecultuur over van stap 3.2 naar twee microcentrifugebuizen en draai gedurende 2 minuten op 15.700 x g . Breng het supernatant over in schone microfugebuizen en draai opnieuw op 15.700 x g gedurende 2 min. Breng het supernatant over naar schone microcentrifugebuizen om in de volgende stap te gebruiken.
      OPMERKING: Het is belangrijk om het voorgeconditioneerde KAc-supernatant te gebruiken met de β-oestradiol en rapamycine om een efficiënte sporulatie en voortdurende uitputting van het eiwit van belang te garanderen.
    8. Nadat het agar-pad 12-15 minuten in de kamer heeft gezeten, zweeft u en verwijdert u het agar-pad voordat u het in beeld brengt. Voeg hiervoor 2 ml van het supernatant uit stap 4.2.7 druppelsgewijs toe aan de kamer. Zodra de vloeistof de bovenkant van de kamer heeft bereikt, zal de agarpad hoogstwaarschijnlijk drijven.
      OPMERKING: Als de agarpad niet automatisch drijft, wacht dan 1-2 minuten. Als het agarkussen nog steeds niet drijft, verwijder het dan voorzichtig met een tang. Idealiter zou het agar-pad vanzelf drijven, omdat het verwijderen ervan voorafgaand aan het drijven zou kunnen leiden tot verwijdering van de cellen.
    9. Nadat het agarkussen is gaan drijven, verwijdert u het voorzichtig met een tang en gooit u het weg. Plaats een afdeklip van 24 mm x 50 mm op de bovenkant van de kamer om verdamping tijdens de beeldvorming te voorkomen.
  3. Een film instellen op de microscoop
    OPMERKING: De onderstaande instructies zijn voor een omgekeerde microscoop die is uitgerust met een diahouder die geschikt is voor de 24 mm x 50 mm coverslip (zie materiaaltabel voor microscoop, camera en softwaredetails). Een 60x olie-immersie objectief wordt gebruikt voor beeldacquisitie. Dit protocol moet mogelijk worden gewijzigd bij het gebruik van andere microscopen of andere diahouders. De exacte stappen voor het uitvoeren van stap 4.3.2 tot en met stap 4.3.16 zijn afhankelijk van de gebruikte microscoop en beeldvormingssoftware. Zie rubriek 4.4 voor instructies voor een andere microscoop.
    1. Plaats de coverslip in de schuifhouder. Plak de lijstklei aan de zijkant van de afdekplaat om deze veilig in de schuifhouder te houden.
    2. Open de software voor het verkrijgen van afbeeldingen. Gebruik cursus- en fijnstelknoppen om de cellen scherp te stellen met behulp van DIC of brightfield.
    3. Klik in het hoofdmenu van de beeldacquisitiesoftware op Bestand > Verwerven (3D oplossen). Er verschijnen drie vensters.
    4. Klik in het venster resolve 3D op het erlenmeyer-icoontje . Hiermee wordt een venster geopend met de titel Experiment ontwerpen/uitvoeren, dat de besturingselementen bevat voor het instellen van een experiment om een time-lapse-film in te stellen.
    5. Ga op het tabblad Ontwerp naar het tabblad Secties. Schakel het selectievakje naast Z Sectioning in. Stel de z-stapels als volgt in: Optische sectieafstand = 1 μm, Aantal optische secties = 5, Monsterdikte = 5,0 μm.
    6. Klik op het tabblad Kanalen op het pictogram + zodat er één kanaaloptie verschijnt. Selecteer het juiste kanaal. Voor dit experiment selecteren we A594, dat wordt gebruikt om mCherry in beeld te brengen. Schakel het vakje naast Referentieafbeelding in en stel de Z-positie in op het midden van het voorbeeld in het vervolgkeuzemenu.
    7. Selecteer een waarde in het vervolgkeuzemenu naast %T en Exp. om respectievelijk het percentage transmissie en belichtingstijd in te stellen. Voor dit experiment worden 2% transmissie en 250 ms blootstellingstijd gebruikt in het A594-kanaal, en 10% transmissie en 500 ms blootstellingstijd worden gebruikt voor brightfield.
      OPMERKING: De belichtingstijd en het percentage transmissie variëren met verschillende microscopen. Om overbelichting te voorkomen, gebruikt u het laagste percentage transmissie en de kortst mogelijke blootstellingstijd die een goede visualisatie van het eiwit van belang mogelijk maakt.
    8. Selecteer op het tabblad Time-lapse het selectievakje naast Time-lapse. Voer in de tabel die wordt weergegeven 10 in onder de kolom min in de rij time-lapse en 10 onder de kolom uren in de rij totale tijd. Dit zal een tijdsparcours uitvoeren waarbij elke 10 minuten gedurende 10 uur foto's worden gemaakt.
    9. Schakel het selectievakje naast Focus behouden met ultieme focus in om fasedrift tijdens de film te voorkomen. Selecteer op het tabblad Punten het selectievakje naast Lijst met punten bezoeken.
    10. Klik in het hoofdmenu op View > Point List. Er verschijnt een venster met de naam puntenlijst. Verplaats het werkgebied naar een gebied van de kamer dat een monolaag van cellen toont. Klik op Point Mark in het puntenlijstvenster.
    11. Verplaats het werkgebied om 25-30 punten te selecteren zonder enige overlap om overbelichting van de cellen te voorkomen. Elk veld wordt tijdens elke tijdcursus in beeld gebracht.
    12. Selecteer in het puntenlijstvenster Alles kalibreren om de ultieme focus voor elk punt in te stellen. Voer op het tabblad Ontwerp in het venster Experiment desgin/Uitvoeren het bereik van de puntwaarden in (verkregen uit het puntlijstvenster) in het vak naast Lijst met toegangspunten bezoeken. Sla het bestand op het tabblad Uitvoeren op de juiste bestemming op de computer op. Selecteer in het venster Experiment ontwerpen/uitvoeren de knop Afspelen (groen driehoekpictogram) om de film te starten.
  4. Optionele methode: Een film instellen op een microscoop
    OPMERKING: Deze instructies zijn voor een omgekeerde microscoop uitgerust met een diahouder die plaats biedt aan een 24 mm x 50 mm afdeksel. Zie Materiaaltabel voor specificaties over de gebruikte microscoop, camera en beeldbewerkingssoftware. Een 60x olie-immersie objectief wordt gebruikt voor beeldacquisitie.
    1. Plaats de coverslip in de schuifhouder. Open de software voor het verkrijgen van afbeeldingen. Gebruik cursus- en fijnafstellingsknoppen om cellen scherp te stellen met behulp van DIC of brightfield. Klik met de rechtermuisknop in het geopende venster van de software. Er verschijnt een vervolgkeuzemenu.
    2. Klik op Acquisition Controls > Acquisition. Klik op Application > Define/Run Experiment. Hiermee wordt een venster geopend met het label ND Acquisition.
    3. Schakel in het venster dat wordt geopend het selectievakje naast XY in. Verplaats het werkgebied naar de gewenste locatie en klik op het vakje onder Naam van punt om die locatie als punt te selecteren. Herhaal dit totdat 25-30 punten zijn geselecteerd zonder enige overlap om overbelichting van de cellen te voorkomen. Elk veld wordt tijdens elke tijdcursus in beeld gebracht.
    4. Stel het percentage transmissie in voor elk fluorescerend kanaal. Omdat de stammen Htb2-mCherry produceren, wordt hier het mCherry-filter gebruikt. Navigeer onder het acquisitievenster dat in stap 4.3.3 is geopend naar de knop 555 nm. Stel het percentage transmissie in op 5% door de schuifschaal onder de 555 nm-knop aan te passen totdat deze 5% aangeeft.
    5. Stel de belichtingstijd in voor elk fluorescerend kanaal. Selecteer in het venster Acquisitie de optie 200 ms in het vervolgkeuzemenu Belichting.
      OPMERKING: De belichtingstijd en het percentage transmissie variëren met verschillende microscopen. Om overbelichting te voorkomen, gebruikt u het laagste percentage transmissie en de kortst mogelijke blootstellingstijd die een goede visualisatie van het eiwit van belang mogelijk maakt.
    6. Klik op het vakje naast Z in het venster ND Acquisition . Zet vijf z-stacks van de gistcellen die 1,2 μM uit elkaar liggen.
    7. Klik op het vakje naast λ. Selecteer de juiste kanalen die voor het experiment moeten worden gebruikt. Zorg er voor DIC voor dat Home is geselecteerd in het vervolgkeuzemenu onder Z pos. Zorg er voor mCherry voor dat Alles is geselecteerd in het vervolgkeuzemenu onder Z pos. Dit zorgt ervoor dat slechts één sectie (in het midden van de z-stack) wordt genomen voor DIC.
    8. Schakel het vakje naast Tijd in het venster ND-acquisitie in. Schakel het vakje onder Fase in. Selecteer in het vervolgkeuzemenu onder Interval de optie 10 min. Selecteer onder Duur 10 uur (en). Dit zal de tijdsverloop zodanig doorlopen dat er elke 10 minuten gedurende 10 uur foto's worden gemaakt.

5. Analyse van chromatinesegregatie

  1. Open de Fiji-software. Open één gezichtsveld tegelijk: open voor elk veld de DIC- en mCherry-kanalen.
  2. Neem de maximale intensiteitsprojectie van het mCherry-kanaal om een enkele afbeelding te verkrijgen: klik op Image > Stacks > Z Project, selecteer Max Intensity in het vervolgkeuzemenu.
  3. Voeg de DIC- en mCherry-kanalen samen in één afbeelding: klik op Afbeelding > Kleur > Kanalen samenvoegen.
  4. Volg een enkele cel door meiose. Noteer na de voltooiing van meiose II het aantal DNA-massa's.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om chromatinesegregatie te monitoren, werd histoneiwit Htb2 getagd met mCherry. In profase I verschijnt het chromatine als een enkele Htb2-massa. Nadat homologe chromosomen in de eerste meiotische deling zijn gescheiden, verschijnt het chromatine als twee verschillende massa's (figuur 3A). Nadat de zusterchromatiden zijn gescheiden, verschijnt het chromatine als vier massa's. Als sommige chromosomen zich niet hechten aan spindelmicrotubuli, kunnen extra massa's worden gezien na meiose I of m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol combineert het NDT80-in-systeem om cellen te synchroniseren, de ankerwegtechniek om eiwitten uit de kern uit te putten en fluorescentie time-lapse-microscopie om ontluikende gistcellen tijdens meiose in beeld te brengen. Het NDT80-in systeem is een methode voor meiotische celcyclussynchronisatie die gebruik maakt van een profase I arrest en release 4,8. Hoewel individuele cellen enigszins zullen variëren in de hoeveelheid tijd die w...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken het Light Microscopy Imaging Center aan de Indiana University. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health (GM105755).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
β-estradiolMillipore SigmaE8875Maak 1mM voorraad in 95% EtOH
0.22 uM Threaded Bottle-top FilterMillipore SigmaS2GPT02RE
100% EtOHFisher Scientific22-032-601
10X PBSFisher ScientificBP399500Verdun 1:10 om te gebruiken als oplosmiddel voor ConA
24 mm x 50 mm dekglas No. 1.5VWR North American48393241
25 mm x 75 mm microscoopglazenVWR North American48300-026
Adenine hemisulfate zoutMillipore SigmaA9126Om SC, SCA en 1% Kac aan te vullen
Bacto AgarBD214030
Concanavialin AMllipore SigmaC2010Maak als 1mg/mL in 1X PBS
CoolSNAP HQ2 CCD cameraPhotometricsGebruikt in Sectie 4.3
D-glucoseFisher ScientificD16-10
Difco Yeast Nitrogen Base zonder aminozurenBD291920
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Millipore SigmaD5879
Eclipse Ti2 inverted-objective microscoopNikonGebruikt in Sectie 4.4
FijiNIHDownloaden van https://fiji.sc/
GE Personal DeltaVision MicroscoopApplied PrecisionGebruikt in Sectie 4.3
L-Tryptophan Millipore SigmaT0254Om SC, SCA en 1% Kac aan te vullen
Modeling ClayCrayola 2302880000Om dekglas in houder vast te zetten
NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging SoftwareNikonGebruikt in Sectie 4.4
ORCA-Fustion BT CameraHamamatsuC15440-20UPGebruikt in Sectie 4.4
Plastic pipette tip holderDot ScientificLTS1000-HRSnijd een 4 vierkant x 4 vierkant sectie van het rekgedeelte van dit product. 
Pottassium AcetateFisher ScientificBP264
RapamycinFisher ScientificBP29631Maak 1mg/mL voorraad in DMSO
Silicone SealantAqueon100165001Ook bekend als aquarium lijm.
SoftWorx7.0.0  Imaging SoftwareApplied PrecisionGebruikt in Sectie 4.3
Synthetic Complete Mixture (Kaiser) FormediumDSCK2500
Type N immersion oil NikonMXA22166

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).
  2. Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136(2020).
  3. van Werven, F. J., Amon, A. Regulation of entry into gametogenesis. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).
  4. Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
  5. Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).
  6. Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).
  7. Chu, S., Herskowitz, I. Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80. Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).
  8. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
  9. Borek, W. E., et al. The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly. Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).
  10. Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).
  11. Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore. Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).
  12. Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).
  13. Fernius, J., Marston, A. L. Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3. PLoS Genetics. 5 (9), 1000629(2009).
  14. Meyer, R. E., et al. Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).
  15. Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).
  16. Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast. Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).
  17. Ben-Ari, G., et al. Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast. PLoS Genetics. 2 (11), 195(2006).
  18. Primig, M., et al. The core meiotic transcriptome in budding yeasts. Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).
  19. Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).
  20. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5(2014).
  21. Byers, B., Goetsch, L. Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature. Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).
  22. Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).
  23. Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
  24. Robinett, C., et al. C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).
  25. Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion. Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).
  26. Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis. Cell. 72 (3), 365-378 (1993).
  27. Scherthan, H., et al. Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Uitputting van kernprote nenmeiotische chromosoomsegregatiemeiose in buddinggistAnchor Away techniekfluorescentiemicroscopiechromatine massa analysecelcyclussynchronisatiekinetochoorprote ne Ctf19prote nelokalisatie

Gerelateerde artikelen