Dit artikel beschrijft de diagnostische methoden voor congenitale hartziekten (CHD) met behulp van foetale echocardiografie, obductie en episcopische fluorescentiebeeldopname (EFIC) met behulp van episcopische confocale microscopie (ECM) gevolgd door driedimensionale (3D) reconstructie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een pijplijn om structurele hartafwijkingen in de foetale muis te karakteriseren
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Aangeboren hartziekten (CHD's) zijn belangrijke oorzaken van kindersterfte in de Verenigde Staten. In de jaren 1980 en eerder stierven de meeste patiënten met matige of ernstige CHD vóór de volwassenheid, met de maximale mortaliteit tijdens de eerste levensweek. Opmerkelijke vooruitgang in chirurgische technieken, diagnostische benaderingen en medisch management hebben geleid tot duidelijke verbeteringen in de resultaten. Om tegemoet te komen aan de kritische onderzoeksbehoeften van het begrijpen van aangeboren hartafwijkingen, hebben muizenmodellen een ideaal onderzoeksplatform geboden, omdat ze zeer vergelijkbare hartanatomie hebben als mensen en korte zwangerschapspercentages. De combinatie van genetische manipulatie met high-throughput fenotyperingstools heeft de replicatie en diagnose van structurele hartafwijkingen mogelijk gemaakt om de moleculaire routes achter CHD's verder op te helderen. Het gebruik van niet-invasieve foetale echocardiografie om de cardiale fenotypes in muismodellen te screenen in combinatie met de high fidelity van Episcopic fluorescence image capture (EFIC) met behulp van Episcopische confocale microscopie (ECM) histopathologie met driedimensionale (3D) reconstructies maakt een gedetailleerd inzicht in de anatomie van verschillende aangeboren hartafwijkingen mogelijk. Dit protocol schetst een complete workflow van deze methoden om een nauwkeurige diagnose van muizen aangeboren hartafwijkingen te verkrijgen. Het toepassen van dit fenotyperingsprotocol op modelorganismen zal een nauwkeurige CHD-diagnose mogelijk maken, wat inzicht oplevert in de mechanismen van CHD. Het identificeren van de onderliggende mechanismen van CHD biedt kansen voor potentiële therapieën en interventies.
Inleiding
Aangeboren hartziekten (CHD's) zijn de meest voorkomende neonatale geboorteafwijking 1,2, die ongeveer 0,8% -1,7% van de pasgeborenen treft en resulteert in significante neonatale mortaliteit en morbiditeit3. Een genetische etiologie is sterk geïndiceerd met CHD's 4,5. Genetisch gemodificeerde muismodellen zijn op grote schaal gebruikt om de complexiteit van CHD's en de mechanismen die ze veroorzaken te begrijpen als gevolg van het feit dat de muizen harten met vier kamers en vergelijkbare cardiale ontwikkelings-DNA-sequenties h....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het gebruik van muizen voor deze studies is noodzakelijk omdat muizen harten met vier kamers hebben die menselijke CHD's kunnen nabootsen. Muizen kregen veterinaire zorg en werden ondergebracht in de association for assessment and accreditation of laboratory animal care (AAALAC) -geaccrediteerde dierenverzorgingsfaciliteit van de instelling. Strikte protocollen werden gevolgd om het ongemak, de stress, de pijn en het letsel van de muizen te minimaliseren. Muizen werden geëuthanaseerd met behulp van CO2-gas , wat acceptabel is voor kleine knaagdieren volgens de Richtlijnen van de American Veterinary Medical Association over euthanasie. De studies op muizen i....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De muizenembryo's met significante hemodynamische defecten bleken embryonaal dodelijk te zijn. Een grote verscheidenheid aan CHD's kan worden geïdentificeerd door middel van het hoge output, niet-invasieve foetale echocardiogram met behulp van verschillende weergaven (figuur 1).
Septumdefecten: De meest voorkomende CHD's zijn septumdefecten zoals een ventrikelseptumdefect (VSD), een atrioventriculaire septumdefect (AVSD) en een atriumseptumdefect .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Genetisch gemodificeerde muizen zijn gebruikt om de pathomechanismen van aangeboren hartafwijkingen te begrijpen. De protocollen die we in deze studie bieden, proberen het proces van het beoordelen van muizen foetale hartafwijkingen te stroomlijnen en te standaardiseren. Er zijn echter kritieke stappen om op te merken tijdens het protocol. Muizenembryo's groeien aanzienlijk tijdens elke dag van de dracht en de juiste tijd om een muis te oogsten kan worden bepaald door nauwkeurig een foetaal echocardiogram uit te voeren. .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflicten in dit manuscript.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1,5 mL Eppendorf buisjes (of de voorkeursvial voor weefselopslag) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% gebufferde fosfaatformaline-oplossing | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixatief | ThermoScientific | 28908 | 4% werkconcentratie vers bereid in 1x PBS bij 4 °C |
| 50 mL buisjes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 putjesplaat of 20 mL buisje voor embryoopslag | Falcon | 353046 | |
| Dissectiemicroscoop | Leica | MDG36 | |
| Dissectiepincet (A1 of A2 kwaliteit) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissectieplaat | F.S.T | FB0875713 | Petrischaal met paraffinebasis |
| Inbeddingsvormen | Sakura | 4133 | |
| Extra smalle schaar (10,5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 paar |
| Fiji-toepassing/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fijne punt (0,05 mm x 0,01 mm) Dissectiepincet (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 paar |
| Hete pincet | F.S.T | 11252-00 | Voor oriëntatie van embryo's |
| Industriemarker voor wasblokken | Sharpie | 2003898 | Geformatteerd voor laboratoriumgebruik |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscoopcamera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisitiesoftware | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Grote glazen beker | Fisher Scientific | S111053 | Voor het smelten van paraffine |
| Leica M165 FC binoculaire microscoop (16,5:1 zoomoptiek) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Versie 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast inbedding paraffinewas | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Kleine glazen beker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Kleine, geperforeerde lepel (14,5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Rechte Vannas schaar (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | Een paar |
| Vevo2100 ultrahoge frequentie ultrasone biomicroscoop | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xyleen | Fisher Chemical | UN1307 |
Referenties
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), Baltimore. e20593(2020).
- vander Linde, D., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
