Methodenartikel

Differentiatie en beeldvorming van bruine vetcellen uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier vetweefsel van pasgeboren muizen

2.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64604

⸱

3 februari 2023

 ,  ,  , 
1Department of Nutrition, Diabetes and Metabolism, Pontificia Universidad Católica de Chile

In dit artikel

Samenvatting

Preadipocyten worden geïsoleerd uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier bruin vetweefsel van pasgeboren muizen en gedifferentieerd tot cellen die lipidedruppeltjes accumuleren, moleculaire markers tot expressie brengen en de mitochondriale morfologie van volwassen bruine vetcellen vertonen. Deze cellen worden verder geanalyseerd door middel van immunofluorescentie en transmissie-elektronenmicroscopie.

Samenvatting

Bruin vetweefsel (BAT) komt alleen voor bij zoogdieren en heeft een thermogene functie. Bruine vetcellen worden gekenmerkt door een multiloculair cytoplasma met meerdere lipidedruppeltjes, een centrale kern, een hoog mitochondriaal gehalte en de expressie van ontkoppelingseiwit 1 (UCP1). BAT is voorgesteld als een potentieel therapeutisch doelwit voor obesitas en de daarmee samenhangende stofwisselingsstoornissen vanwege het vermogen om metabolische energie af te voeren als warmte. Om de functie en regulatie van de BAT te onderzoeken, is het kweken van bruine adipocyten onmisbaar. Het huidige protocol optimaliseert weefselverwerking en celdifferentiatie voor het kweken van bruine vetcellen van pasgeboren muizen. Daarnaast worden procedures getoond voor de beeldvorming van gedifferentieerde adipocyten met zowel confocale immunofluorescentie als transmissie-elektronenmicroscopie. In de bruine vetcellen die zijn gedifferentieerd met de hierin beschreven technieken, blijven de belangrijkste bepalende kenmerken van klassieke BAT behouden, waaronder hoge UCP1-niveaus, verhoogde mitochondriale massa en zeer nauw fysiek contact tussen de lipidedruppeltjes en mitochondriën, waardoor deze methode een waardevol hulpmiddel is voor BAT-studies.

Inleiding

Wit en bruin vetweefsel verschillen in hun anatomische locatie, cellulaire oorsprong, functie, morfologie en totale massa. Wit vetweefsel (WAT) is het belangrijkste fysiologische energiereservoir van het lichaam en slaat grote hoeveelheden triacylglycerol (TAG) op in zeer gespecialiseerde cellen die een enkele gigantische lipidedruppel hebben die het grootste deel van hun cellulaire volume in beslag neemt. TAG-lipolyse maakt vrije vetzuren vrij, die in de systemische circulatie terechtkomen om te voldoen aan de energiebehoefte tijdens het vasten of andere toestanden van negatieve energiebalans. Bovendien scheidt de WAT eiwit- en lipideproducten af, respectievelijk adipokines en lipokines genaamd, die metabole, immuun- en reproductieve regulerende functies hebben, waardoor de WAT het grootste endocriene weefsel inhet lichaam is.

Bruin vetweefsel (BAT) is een veel kleiner orgaan waarvan de belangrijkste fysiologische functie niet-rillende thermogenese is om onderkoeling te voorkomen. Bij muizen en pasgeboren mensen is BAT een goed gedefinieerd orgaan dat zich in de interscapulaire ruimte bevindt. Volwassen mensen missen interscapulaire BAT (iBAT); niettemin ontwikkelen ze clusters van bruine adipocytachtige cellen die zijn geïntegreerd in depots die anders voornamelijk uit WAT bestaan. Deze "bruin-in-witte" (brite) adipocyten delen morfologische en moleculaire kenmerken met klassieke iBAT-adipocyten, maar ze hebben een andere cellulaire oorsprong 3,4.

In tegenstelling tot witte vetcellen hebben bruine vetcellen meerdere kleine lipidedruppeltjes en overvloedige mitochondriën5. Ontkoppelingseiwit 1 (UCP1, ook bekend als thermogenine) wordt op unieke wijze tot expressie gebracht door bruine en brite adipocyten en bemiddelt protonlekkage in het binnenste mitochondriale membraan (IMM), waardoor elektronentransport wordt losgekoppeld van ATP-synthese en warmte wordt gegenereerd. Niet-rillende thermogenese in BAT wordt geactiveerd door noradrenaline (NE), dat wordt vrijgegeven uit de sympathische terminals in de BAT als reactie op koudestimulatie6. NE bindt zich aan bèta-adrenoceptoren (meestal bèta 3) op het oppervlak van bruine adipocyten en activeert een intracellulaire cAMP-gemedieerde signaalcascade. Dit resulteert in TAG-lipolyse, de bèta-oxidatie van mitochondriale vetzuren en warmteontwikkeling bij activering van UCP13. De nauwe functionele relatie tussen lipidedruppels en mitochondriën in bruine adipocyten heeft structurele parallellen, zoals de interactie tussen deze organellen in gebieden die groot zijn en zeer nauw fysiek contact hebben 7,8.

iBAT heeft een overvloed aan bloedvaten en sympathische terminals9. Deze structuren, samen met de preadipocyten, immuuncellen, fibroblasten en extracellulaire matrixmoleculen, vormen de vetstromale vasculaire fractie (SVF)10. Van veel protocollen is gemeld dat ze rijpe adipocyten genereren uit preadipocyten 11,12,13,14,15 (aanvullende tabel 1); Niettemin vertonen ze extreme variaties in weefselverwerking en de samenstelling van de differentiatiecultuurmedia. Het hierin beschreven protocol maakt de efficiënte en reproduceerbare differentiatie mogelijk van bruine adipocyten die (1) de belangrijkste adipogene transcriptiefactoren peroxisoomproliferator-geactiveerde receptor gamma (PPARγ) en CCAAT/enhancer-bindend eiwit alfa (C/EBPα) tot expressie brengen, (2) de rijpe adipocytmarkers perilipine1 (PLIN1) en clusterdeterminant 36 (CD36) tot expressie brengen, (3) overvloedige lipidedruppeltjes accumuleren, (4) een hoge mitochondriale massa hebben en een hoge overvloed aan OXPHOS-complexen, (5) thermogeen potentieel hebben, zoals bepaald door hoge niveaus van UCP1, en (6) mitochondriale morfologische veranderingen hebben die verband houden met het fenotype van rijpe bruine adipocyten. Deze methodologie wordt gebruikt voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan gegeneraliseerde lipodystrofie 15,16,17.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Pontificia Universidad Católica de Chile. P0.5 pasgeboren muizen van beide geslachten, afgeleid van een gemengde achtergrond van C57BL/6J en 129J stammen, werden gebruikt voor deze studie.

1. Weefselextractie

  1. Reinig en desinfecteer de werkbank met een 70% ethanoloplossing en gebruik steriel chirurgisch materiaal.
  2. Euthanaseer P0.5 pasgeboren pups door onthoofding met een chirurgische schaar volgens een institutioneel goedgekeurd protocol.
  3. Plaats de muis in buikligging (naar beneden gericht) en maak met een scherpe schaar een incisie van 1 cm lang in de huid ter hoogte van de rug van het dier. Verwijder de schil voorzichtig.
    OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang, want als de huid niet goed wordt verwijderd, kan deze de iBAT scheuren en beschadigen en de optimale voorbereiding van de SVF verhinderen.
  4. Maak de iBAT operatief los van het karkas met behulp van een kleine schaar.
    OPMERKING: De iBAT wordt gevisualiseerd als twee vetlobben die onafhankelijk van elkaar kunnen worden verwijderd.
  5. Oogst beide iBAT-lobben door een tang met gebogen punt te gebruiken om de lobben onafhankelijk van elkaar te verwijderen.
  6. Plaats de twee lobben in een plastic buis met 1,5 ml steriele PBS op kamertemperatuur. Bewaar de weefsels in hun individuele buisjes totdat de weefselextractie is voltooid voor alle benodigde pups.

2. Vertering van weefsel

  1. Aliquot 300 μL collagenase type II digestiebuffer (0,2% type II collagenase in buffer [25 mM KHCO3, 1,2 mM MgSO4, 120 mM NaCl, 5 mM glucose, 12 mM KH2PO4, 4,8 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 2,5% BSA en 1% penicilline/streptomycine, bij pH 7,4]) (Tabel 1) in buisjes van 1,5 ml in een bioveiligheidskast.
    OPMERKING: Bereid voldoende buisjes voor voor het aantal afzonderlijke weefsels dat moet worden geëxtraheerd. In de huidige studie werden zeven buisjes gebruikt, wat overeenkomt met een nest van zeven pups.
  2. Ga naar de bank en plaats de iBAT-lobben in collagenase type II-verteringsbuffer om de extracellulaire matrix af te breken.
  3. Incubeer de iBAT-weefsels gedurende 45 minuten bij 37 °C met continu zacht schudden bij 800 tpm (figuur 1).

3. Verwerking van weefsel

OPMERKING: Voer na de vertering alle volgende stappen uit in een klasse II laminaire flow weefselkweekkap.

  1. Bereid twee sets plastic buisjes van 1,5 ml voor en label ze voor elk afzonderlijk monster.
  2. Verstoor de weefselsuspensie in collagenase type II digestiebuffer mechanisch door op en neer te pipetteren met behulp van een P1.000 micropipet en gefilterde tips. Gebruik voor elk monster een nieuwe tip.
    OPMERKING: Dit is een cruciale stap. Zorg ervoor dat het weefsel mechanisch wordt gedesaggregeerd met de punt en pipet op en neer totdat de macroscopische homogenisatie is voltooid.
  3. Haal de gedesaggregeerde weefsels door individuele celzeven van 100 μm (zie de materiaaltabel) in nieuwe buisjes van 1,5 ml.
  4. Voeg 500 μL ACK-buffer (zie de materiaaltabel) toe aan de gefilterde weefselmonsters, keer de buisjes 4-5 keer om en incubeer gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Overschrijd de incubatietijd niet, omdat dit de cellen van belang kan beschadigen.
  5. Centrifugeer de weefselmonsters bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Gooi het supernatans weg door de buis om te keren en resuspendeer de pellet in 1 ml kweekmedium (DMEM-F12 met 10% FBS, 1% antibiotisch antimycoticum, pH 7,2) (zie de materiaaltabel).
  7. Leid de suspensies door een celzeef van 40 μm in nieuwe buisjes van 1,5 ml met behulp van een P1.000-micropipet en gefilterde tips.
  8. Centrifugeer de monsters bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: De pellet komt overeen met de pre-adipocyt-bevattende SVF.
  9. Gooi het supernatans weg door de buis om te keren en reponseer de pellet opnieuw in 1 ml kweekmedium door te pipetteren.
  10. Bereid voor elk monster een buisje van 15 ml voor door 5 ml kweekmedium toe te voegen.
  11. Voeg elke geresuspendeerde pellet toe aan de overeenkomstige tube van 15 ml met 5 ml kweekmedium. Keer de buis 4-5 keer om om de celinhoud te mengen.
  12. Zaai elk monster in zes putjes van een kweekplaat met 24 putjes door 1 ml van de suspensie aan elk putje toe te voegen (figuur 1).

4. Stromale vasculaire fractie (SVF) cultuur

  1. Verander het kweekmedium om de dag totdat de cellen 100% samenvloeiing bereiken.
    OPMERKING: Tijdens deze periode worden niet-plastische aanhangende cellen verwijderd, wat resulteert in een primaire cultuur verrijkt met een preadipocyt-bevattende SVF.
  2. Wanneer de cellen 100% samenvloeiend zijn, verwijdert u het kweekmedium en wast u de cellen met 800 μL steriele PBS.
  3. Voeg 150 μL 0,25% trypsine-EDTA (zie de materiaaltabel) toe aan elk putje en plaats de kweekplaat gedurende 3 minuten in de incubator voor het losmaken van de cellen.
    OPMERKING: Controleer of de cellen zijn losgemaakt met behulp van een lichtmicroscoop met fasecontrast.
  4. Inactiveer de trypsine door 850 μL kweekmedium aan elk putje toe te voegen.
  5. Verzamel de cellen van de zes putjes die in stap 3.12 zijn gezaaid en breng ze over in een buisje van 15 ml.
  6. Maak het totale volume op 12 ml door 6 ml kweekmedium toe te voegen. Keer de tube 4-5 keer om om de inhoud te mengen.
  7. Zaai 1 ml van het monster in elk putje van een plaat met 12 putjes. Verander het kweekmedium om de dag totdat de cellen samenvloeien.
  8. Wanneer de cellen 100% samenvloeiend zijn, maak ze dan los met 150 μL 0,25% trypsine-EDTA volgens dezelfde incubatieomstandigheden als in stap 4.3, en zaai ze volgens de oppervlakte van het putje dat nodig is voor het experiment.
  9. Voer beeldvorming met hoge resolutie uit na het fixeren van de cellen na stap 8.
    OPMERKING: Een dichtheid van 35.000 cellen/cm² wordt aanbevolen voor verdere experimenten (eiwit- en totale RNA-extractie, 330.000 cellen [één putje van een plaat met 6 putjes]; immunofluorescentie [IF], 10.500 cellen [één putje van een plaat met 96 putjes]).

5. Apopogene differentiatie

  1. Incubeer de cellen met inductiemedium (DMEM-F12 met 10% FBS, 1% antibiotisch antimycoticum, pH 7,2, aangevuld met 500 nM dexamethason, 125 nM indomethacine, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine [IBMX], 5 μM rosiglitazon, 1 nM T3 en 20 nM insuline) (Tabel 1) gedurende 72 uur (dag 0 tot dag 2) (Figuur 2).
    LET OP: Het kweekmedium moet om de dag worden vervangen; De eerste mediumverandering moet dus plaatsvinden op dag 2 na de eerste inductie.
  2. Schakel over op onderhoudsmedium (DMEM-F12 met 10% FBS, 1% antibioticum antimycoticum, pH 7,2, aangevuld met 5 μM rosiglitazon, 1 nM T3 en 20 nM insuline) (Tabel 1) op dag 3 en houd dit onderhoudsmedium aan tot dag 7 (Figuur 2).
    OPMERKING: Het onderhoudsmedium moet op dag 5 en dag 7 worden vervangen. Kleine lipidedruppeltjes kunnen vanaf dag 3 van de differentiatie worden gevisualiseerd door middel van fasecontrastmicroscopie. Grote lipidedruppels zijn zichtbaar op dag 7 van de differentiatie. Differentiatieprocedures langer dan 7 dagen resulteren in celverlies door loslating, waarschijnlijk als gevolg van het hoge drijfvermogen van met lipiden beladen cellen.

6. Cellulair homogenaat preparaat

  1. Verwijder het kweekmedium op dag 0 en dag 7 van de differentiatie en was de cellen 3 keer met steriel PBS.
  2. Voeg na de laatste reiniging 1,3 ml steriele PBS toe aan elk putje.
    OPMERKING: Houd de cellen in ijs tot het reinigen van de laatste plaat.
  3. Oogst de cellen mechanisch uit een putje van een plaat met 6 putjes (~330.000 cellen) met een celschraper en doe de cellulaire suspensie in een buisje van 1,5 ml.
  4. Centrifugeer de monsters bij 2.800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  5. Verwijder de PBS met een micropipet en houd de buisjes op ijs.
  6. Resuspendeer de cellulaire pellet in de Ripa-buffer met protease- en fosfataseremmers (zie de materiaaltabel) en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
    OPMERKING: Om de cellulaire pellet te lysoleren, is 70-80 μL voldoende.
  7. Centrifugeer de monsters bij 21.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
  8. Verwijder het supernatans voorzichtig in een buisje van 1,5 ml en gooi de pellet weg.
    OPMERKING: Het supernatans vertegenwoordigt het cellulaire homogenaat.
  9. Bepaal de eiwitconcentratie van het cellulaire homogenaat met behulp van bicinchoninezuur (BCA) voor de colorimetrische detectie en kwantificering van het totale eiwit18,19.

7. Westelijke blotting

  1. Bereid 30 μg van het cellulaire homogenaat (uit stap 6.8) en voeg de in de handel verkrijgbare SDS-PAGE-monsterlaadbuffer toe (zie de materiaaltabel).
  2. Los op in polyacrylamidegelelektroforese-SDS20 (PAGE-SDS) volgens het molecuulgewicht van elk eiwit.
    OPMERKING: Gebruik 10% PAGE-SDS voor PPARγ, C/EBPα, PLIN1, CD36 en UCP1, 12% PAGE-SDS voor OXPHOS en 15% PAGE-SDS voor TOM20 (zie de materiaaltabel).
  3. Breng de eiwitten elektrolytisch over op het PVDF-membraan (zie de materiaaltabel) bij 350 mA gedurende 2 uur.
    NOTITIE: De ijscontainer moet na 1 uur worden vervangen. Houd tijdens het hele proces de kamer op ijs.
  4. Blokkeer de membranen met 5% BSA of vetvrije melk in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) 0,1% Tween 20 (TBS-T) gedurende 2 uur volgens de aanbevelingen uit de datasheets van de antilichamen.
  5. Incubeer met de primaire antilichamen (de antilichamen die in dit onderzoek zijn gebruikt, worden gedetailleerd beschreven in de materiaaltabel) 's nachts bij 4 °C.
    OPMERKING: Alle antilichamen die in dit onderzoek werden gebruikt, werden verdund tot 1:1.000 in een blokkerende oplossing.
  6. Was de membranen 3 keer met 0,1% TBS-T en incubeer ze met mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd secundair antilichaam (zie de materiaaltabel) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
  7. Was de membranen 3 keer met 0,1%. TBS-T. Voer een laatste wasbeurt uit met 1x TBS. Bewaar de membranen in 1x TBS tot visualisatie. Bewaren voor maximaal 1 uur wordt aanbevolen.
  8. Visualiseer de membranen door chemiluminescentie20 of een andere voorkeursmethode.

8. Beeldvorming met hoge resolutie

  1. Voer de immunofluorescentietest uit volgens de onderstaande stappen.
    1. Zaai en differentieer de primaire culturen van bruine preadipocyten van P0.5 pasgeboren muizen (volgens stap 4.8) in platen met 96 putjes en een optische bodem (zie de Tabel met materialen).
    2. Fixeer de cellen op dag 0 en dag 7 van differentiatie met 4% PFA gedurende 20 minuten en was 3 keer met steriele PBS.
    3. Permeabiliseer de cellen met 0,1% Triton X-100 gedurende 15 minuten en blokkeer ze met 3% visgelatine (zie de materiaaltabel) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    4. 3 maal wassen met steriel PBS en incuberen met PLIN1-antilichaam (1:400, zie materiaaltabel) in 1% BSA/PBS 's nachts bij 4 °C in een vochtige kamer.
    5. 3 keer wassen met steriel PBS en incuberen met fluorofoorgeconjugeerd secundair antilichaam bij 1:1.000 (1% BSA/PBS) (zie de materiaaltabel) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    6. Kleur de kernen met 1 μg/ml Hoechst 33342 en de lipidedruppels met 1 μg/ml BODIPY gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: De fluorescentiebeelden zijn verkregen met behulp van een celbeeldvormingssysteem (zie de tabel met materialen). In totaal werden 9 of 16 foto's per put gemaakt met twee tot drie kanalen met een vergroting van 20x.
  2. Voer transmissie-elektronenmicroscopie uit volgens de onderstaande stappen.
    1. Kweek en differentieer de bruine preadipocyten in celkweekschaaltjes van 35 mm x 10 mm.
    2. Verwijder op dag 0 en dag 7 van de differentiatie het medium en fixeer de cellen gedurende 1 uur met 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer, pH 7,0 (zie de materiaaltabel).
    3. Was de cellen 3 keer met 0,05 M natriumkakodylaatbuffer gedurende 10 minuten en behandel ze gedurende 15 minuten met 1% waterig osmiumtetroxide (zie de materiaaltabel).
    4. Was de cellen 3 keer met bi-gedestilleerd water gedurende 5 minuten en behandel ze gedurende 15 minuten met 1% waterig uranylacetaat (zie de materiaaltabel).
    5. Dehydrateer de cellen met een ethanolgradiënt van 30%, 50%, 70%, 95% en 100% gedurende 5 minuten per keer.
    6. Veranker de cellen vooraf in 1:1 epon/ethanol gedurende 30 minuten en vervolgens gedurende 1 uur in epon (zie de materiaaltabel).
      OPMERKING: De opname van cellen wordt direct in de schaal uitgevoerd door vers epon toe te voegen om de gehele monolaag van de celcultuur te bedekken. Laat de epon 24 uur polymeriseren in een oven op 60 °C.
    7. Dompel de celkweekschaal 2 minuten onder in vloeibare stikstof en breek hem vervolgens met een tang om de plastic insluiting los te maken.
    8. Lijm de insluitingssegmenten met cellen op een blok hars om fijne sneden (80 nm) evenwijdig aan het oppervlak te verkrijgen in een ultramicrotoom (zie de tabel met materialen).
    9. Kleur de sneden met 1% waterig uranylacetaat gedurende 4 minuten en loodcitraat gedurende 5 minuten, volgens Reynolds et al.21.
    10. Visualiseer de roosters in een elektronenmicroscoop (zie de Tabel met materialen).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Adipogenese wordt gereguleerd door een netwerk van transcriptiefactoren die verantwoordelijk zijn voor zowel de expressie van belangrijke eiwitten die de vorming en het functioneren van bruine adipocyten induceren22, waaronder klassieke adipogene regulatoren zoals PPARγ en C/EBPα 23,24,25, evenals markers van rijpe adipocyten 26,27. Door het teste...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het huidige protocol is een eenvoudige en reproduceerbare differentiatieprocedure in twee fasen (figuur 2) voor het genereren van cellen met de moleculaire en morfologische kenmerken van rijpe bruine adipocyten. Het chirurgisch oogsten van de iBAT is de eerste cruciale stap, omdat weefselscheuren de levensvatbaarheid van het uitgangsmateriaal ernstig beperkt. Weefselverwerking is ook van cruciaal belang omdat een homogene celsuspensie die vrij is van puin de hoeveelheid SVF die kan worden ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Financiering werd verstrekt door FONDECYT (1181214 en 1221146) en Anillos (ACT210039) aan VC en doctoraatsbeurzen ANID 21171743 aan AMF en ANID 21150665 aan FS. We danken Alejandro Munizaga voor zijn hulp bij de verwerking van de monsters en technisch advies voor de transmissie-elektronenmicroscopie. De illustraties zijn gemaakt met behulp van BioRender.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10x Tris/Glycine BufferBioRad1610734
16% Paraformaldehyde Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences15710
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture DishFalcon353001
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)Calbiochem410957
40% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1BioRad1610148
6-well plate SPL Life Science -
96 well optical black w/lid cell culture sterileThermo Scientific165305
AccuRuler RGB Plus Pre-stained Protein Ladder Maestrogen02102-250
ACK lysing buffer GibcoA10492-01
Ammonium Persulfate BioRad1610700
Antibiotic-antimycoticGibco 15240062
Anti-mouse IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling7076
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody  Cell Signaling7074
Blotting-grade blocker BioRad170-6404
BODIPY 493/503 InvitrogenD3922
BSASigmaA1470
C/EBPα antibodyCell Signaling2295
CaCl2Calbiochem 208291
CD36 antibodyInvitrogenPA1-16813
Cell Strainer 100 µm, nylonFalcon352360
Cell Strainer 40 µm, nylonFalcon352340
Collagenase type IIGibco17101-015
Cytation 5 Cell Imaging Multimode ReaderBiotek
Dexamethasone SigmaD4902
DMEM/F-12, powderGibco12500062
EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)Electron Microscopy Sciences14120
Ethanol absoluteMerck 100983 
Fetal bovine serum Gibco16000-044
Gelatin from cold water fish skinSigmaG7041
GlucoseGibco 15023-021
Glutaraldehyde 25% Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences16210
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11012
Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X Thermo Scientific78427
Halt Protease Inhibitor Cocktail 100X Thermo Scientific78429
Hoechst 33258InvitrogenH1398
Immun-Blot PVDF Membrane BioRad1620177
Indomethacin Sigma I7378 
Insulin SigmaI3536
KClCalbiochem 529552
KH2PO4Calbiochem529568
KHCO3Sigma60339
Lane Marker Reducing Sample Buffer Thermo Scientific39000
MgSO4SigmaM2643
MilliQ water sterile --
Mitoprofile Total OXPHOS Rodent WB antibody CocktailAbcam MS604
NaClMerck 1064041000
OmniPur 10x PBS Liquid ConcentrateCalbiochem6505-OP
Osmium Tetroxide Electron Microscopy Sciences19100
Perilipin 1 antibodyCell Signaling9349
PPARγ (81B8) antibodyCell Signaling2443
RIPA buffer lysis Thermo Scientific89901
RosiglitazoneMerck557366
Sodium bicarbonate SigmaS5761
Sodium CacpdylateElectron Microscopy Sciences12300
Sodium Dodecyl Sulfate BioRad1610301
T3SigmaT6397
Talos F200C G2Thermo Scientific
TEMED BioRad1610800
TOM20 antibodyCell Signaling42406
Tris Buffered Saline (TBS-10X)Cell Signaling12498
Triton X-100 Sigma93443
Trypsin-EDTA (0,25%)Gibco25200056
Tween 20, Molecular Biology GradePromega H5152
UCP1 antibodyCell Signaling14670
Ultracut RLeica 
Uranyl AcetateElectron Microscopy Sciences22400
Westar Sun CyanagenXLS063
Westar Supernova CyanagenXLS3

Referenties

  1. Luo, L., Liu, M. Adipose tissue in control of metabolism. Journal of Endocrinology. 231 (3), 77-99 (2016).
  2. Gaspar, R. C., Pauli, J. R., Shulman, G. I., Muñoz, V. R. An update on brown adipose tissue biology: A discussion of recent findings. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 320 (3), 488-495 (2021).
  3. Richard, D., Picard, F. Brown fat biology and thermogenesis. Frontiers in Bioscience. 16, 1233-1260 (2011).
  4. Rosenwald, M., Wolfrum, C. The origin and definition of brite versus white and classical brown adipocytes. Adipocyte. 3 (1), 4-9 (2014).
  5. Smorlesi, A., Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. The adipose organ: White-brown adipocyte plasticity and metabolic inflammation. Obesity Reviews. 13, Suppl 2 83-96 (2012).
  6. Townsend, K., Tseng, Y. -H. Brown adipose tissue: Recent insights into development, metabolic function and therapeutic potential. Adipocyte. 1 (1), 13-24 (2012).
  7. Benador, I. Y., et al. Mitochondria bound to lipid droplets have unique bioenergetics, composition, and dynamics that support lipid droplet expansion. Cell Metabolism. 27 (4), 869-885 (2018).
  8. Benador, I. Y., Veliova, M., Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondria bound to lipid droplets: Where mitochondrial dynamics regulate lipid storage and utilization. Cell Metabolism. 29 (4), 827-835 (2019).
  9. Lee, P., Swarbrick, M. M., Ho, K. K. Brown adipose tissue in adult humans: A metabolic renaissance. Endocrine Reviews. 34 (3), 413-438 (2013).
  10. Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
  11. Klein, J., et al. Beta(3)-adrenergic stimulation differentially inhibits insulin signaling and decreases insulin-induced glucose uptake in brown adipocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (3), 34795-34802 (1999).
  12. Gaom, W., Kong, X., Yang, Q. Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).
  13. Rocha, A. L., Guerra, B. A., Boucher, J., Mori, M. A. A Method to induce brown/beige adipocyte differentiation from murine preadipocytes. Bio-protocol. 11 (24), 4265(2021).
  14. Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005(2021).
  15. Tapia, P. J., et al. Absence of AGPAT2 impairs brown adipogenesis, increases IFN stimulated gene expression and alters mitochondrial morphology. Metabolism. 111, 154341(2020).
  16. González-Hódar, L., et al. Decreased caveolae in AGPAT2 lacking adipocytes is independent of changes in cholesterol or sphingolipid levels: A whole cell and plasma membrane lipidomic analysis of adipogenesis. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (9), 166167(2021).
  17. Fernández-Galilea, M., Tapia, P., Cautivo, K., Morselli, E., Cortés, V. A. AGPAT2 deficiency impairs adipogenic differentiation in primary cultured preadipocytes in a non-autophagy or apoptosis dependent mechanism. Biochemical and Biophysical Research Communications. 467 (1), 39-45 (2015).
  18. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , Humana Press. Totowa, NJ. 11-15 (2009).
  19. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  20. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Western blotting. Methods. 38 (4), 283-293 (2006).
  21. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
  22. Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).
  23. Ambele, M. A., Dhanraj, P., Giles, R., Pepper, M. S. Adipogenesis: A complex interplay of multiple molecular determinants and pathways. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 4283(2020).
  24. Lefterova, M. I., et al. PPARγ and C/EBP factors orchestrate adipocyte biology via adjacent binding on a genome-wide scale. Genes & Development. 22 (21), 2941-2952 (2008).
  25. Ntambi, J. M., Young-Cheul, K. Adipocyte differentiation and gene expression. The Journal of Nutrition. 130 (12), (2000).
  26. Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids in Health and Disease. 16, 83(2017).
  27. Christiaens, V., Van Hul, M., Lijnen, H. R., Scroyen, I. CD36 promotes adipocyte differentiation and adipogenesis. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1820 (7), 949-956 (2012).
  28. Carobbio, S., Rosen, B., Vidal-Puig, A. Adipogenesis: New insights into brown adipose tissue differentiation. Journal of Molecular Endocrinology. 51 (3), 75-85 (2013).
  29. Ricquier, D. Uncoupling protein 1 of brown adipocytes, the only uncoupler: A historical perspective. Frontiers in Endocrinology. 2, 85-91 (2011).
  30. Cui, L., Mirza, A. H., Zhang, S., Liang, B., Liu, P. Lipid droplets and mitochondria are anchored during brown adipocyte differentiation. Protein & Cell. 10 (12), 921-926 (2019).
  31. Hao, L., et al. Indomethacin enhances brown fat activity. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 365 (3), 467-475 (2018).
  32. Lehmann, J. M., Lenhard, J. M., Oliver, B. B., Ringold, G. M., Kliewer, S. A. Peroxisome proliferator-activated receptors alpha and gamma are activated by indomethacin and other non-steroidal anti-inflammatory drugs. Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3406-3410 (1997).
  33. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  34. Wilson-Fritch, L., et al. Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone. The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1281-1289 (2004).
  35. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: Function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
  36. Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. PPARgamma agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein. Cell Metabolism. 15 (3), 395-404 (2012).
  37. Merlin, J., et al. Rosiglitazone and a β3-adrenoceptor agonist are both required for functional browning of white adipocytes in culture. Frontiers in Endocrinology. 9, 249(2018).
  38. Fayyad, A. M., et al. Rosiglitazone enhances browning adipocytes in association with MAPK and PI3-K pathways during the differentiation of telomerase-transformed mesenchymal stromal cells into adipocytes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1618-1633 (2019).
  39. Zennaro, M. -C., et al. Hibernoma development in transgenic mice identifies brown adipose tissue as a novel target of aldosterone action. The Journal of Clinical Investigation. 101 (6), 1254-1260 (1998).
  40. Klaus, S., et al. Characterization of the novel brown adipocyte cell line HIB 1B. Adrenergic pathways involved in regulation of uncoupling protein gene expression. Journal of Cell Science. 107 (1), 313-319 (1994).
  41. Guennoun, A., et al. Comprehensive molecular characterization of human adipocytes reveals a transient brown phenotype. Journal of Translational Medicine. 13, 135(2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Bruin vetweefseladipocytdifferentiatieconfocale immunofluorescentietransmissie elektronenmicroscopiemitochondri le functieUCP1 expressielipidedruppels

Gerelateerde artikelen