Toepassing van flowvermimetrie voor kwantificering en analyse van het darmmicrobioom van Caenorhabditis elegans

Summary

Caenorhabditis elegans is een krachtig model om de moleculaire determinanten te onderzoeken die de interacties tussen gastheer en microbioom aansturen. We presenteren een pijplijn met hoge doorvoer die de niveaus van darmmicrobioomkolonisatie bij één dier profileert, samen met belangrijke aspecten van de fysiologie van C. elegans.

Abstract

De samenstelling van het darmmicrobioom kan een dramatische invloed hebben op de fysiologie van de gastheer tijdens de ontwikkeling en het leven van het dier. Het meten van veranderingen in de samenstelling van het microbioom is cruciaal bij het identificeren van de functionele relaties tussen deze fysiologische veranderingen. Caenorhabditis elegans is naar voren gekomen als een krachtig gastheersysteem om de moleculaire drijfveren van gastheer-microbioominteracties te onderzoeken. Met zijn transparante lichaamsplan en fluorescerend gelabelde natuurlijke microben kunnen de relatieve niveaus van microben in het darmmicrobioom van een individueel C. elegans-dier gemakkelijk worden gekwantificeerd met behulp van een grote deeltjessorteerder. Hier beschrijven we de procedures voor het experimenteel opzetten van een microbioom, het verzamelen en analyseren van C. elegans-populaties in de gewenste levensfase, de werking en het onderhoud van de sorteerder, en statistische analyses van de resulterende datasets. We bespreken ook overwegingen voor het optimaliseren van sorteerinstellingen op basis van de microben die van belang zijn, de ontwikkeling van effectieve poortstrategieën voor de levensfasen van C. elegans en hoe sorteermogelijkheden kunnen worden gebruikt om dierpopulaties te verrijken op basis van de samenstelling van het darmmicrobioom. Voorbeelden van mogelijke toepassingen zullen worden gepresenteerd als onderdeel van het protocol, waaronder het potentieel voor schaalbaarheid naar toepassingen met een hoge doorvoer.

Introduction

De evolutie van dieren staat onder constante microbiële invloed¹. Van diverse microben in de omgeving verwerven dierlijke gastheren specifieke partners² die de mogelijkheden van de gastheer uitbreiden en zijn fysiologie en vatbaarheid voor ziekten stimuleren³. Metagenomische analyses van het darmmicrobioom brachten bijvoorbeeld verrijkte metabole klassen van microbiële genen aan het licht die een grotere energieoogst en -opslag kunnen opleveren bij zwaarlijvige muizen⁴, waarvan er vele ook worden aangetroffen in het menselijke darmmicrobioom

Protocol

1. Bereiding van het microbioommengsel

1. Stamp of streep bacteriën uit een glycerol-diepvriesbouillon op een lysogene bouillon (LB)-plaat, of een geschikt groeimedium, en kweek 's nachts bij een optimale temperatuur op basis van bacteriestammen die van belang zijn (meestal 25 °C voor natuurlijke microben van C. elegans ).
2. Gebruik van de LB-plaat een enkele kolonie van elk bacterie-isolaat (bijv. 12 bacteriën van de CeMbio-collectie) om 800 μL LB-medium te inoculeren in afzonderlijke putjes van een 1 ml deepwell-plaat. Incubeer een nacht op de optimale temperatuur met schudden op 250 tpm.
   OPMERKING: Dit protocol is geoptim....

Results

Definiëren van populatiepoorten voor volwassen dieren en larven
Hier werden gesynchroniseerde C. elegans L1's gekweekt op een NGM-plaat bezaaid met E. coli OP50 (Eco), een standaard laboratoriumdieet. C. elegans-populaties werden verzameld voor LPS-analyse na 96 uur of 120 uur groei bij 20 °C (figuur 2A). Een dot plot van uitsterven (EXT, een proxy van lichaamsdichtheid) versus time-of-flight (TOF, een proxy van lichaamslengte) creëert twee visu.......

Discussion

Flowvermimetrie is gebruikt om C. elegans-genen en -routes tegen pathogene kolonisatie en toxiciteit in verschillende onderzoeken te karakteriseren^21,22. Hier wordt een 'high throughput alife' benadering gepresenteerd die C. elegans gebruikt om te onderzoeken hoe darmmicrobiomen hun gastheerfysiologie moduleren. Vergeleken met bestaande methoden die gebruik maken van kolonievormende eenheden (CFU) of 16S rRNA-ampliconsequencing 9,16,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical bottom centrifuge tubes	VWR	10026-076
96 deep-well plates (1 mL)	Axygen	P-DW-11-C
96 deep-well plates (2 mL)	Axygen	P-DW-20-C
96-well Costar plate	Corning	3694
Agar	Millipore Sigma		Standard bacteriology agar is also sufficient.
Aspirating manifold	V&P scientific	VP1171A
Bleach	Clorox
Bleach solution			Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v)
Cell Imaging Multimode Reader	Biotek	Cytation 5	Bacterial OD measurement
Centrifuge	Thermo scientific	Sorvall Legend XTR	For 96 well plate and conical tubes
Fluorescent Microscope	Nikon	TiE
ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data.	R package	Version 3.3.2
Large Particle Autosampler	Union Biometrica	LP Sampler
Large Particle Sorter	Union Biometrica	COPAS Biosorter
Levamisole	Fisher	AC187870100
Lysogeny Broth (LB)	RPI	L24066	Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient.
M9 solution			22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Nematode Growth Medium	RPI	N81800-1000.0	1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving.
RStudio	GNU	Version 1.3.1093
Sodium hypochlorite	Sigma-Aldrich		5M NaOH
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745
Sterile 10 cm diameter petri dishes	Corning	351029
Sterile 12-well plates	VWR	10062-894
Sterile 24-well plates	VWR	10062-896
Sterile 6 cm diameter petri dishes	Corning	351007
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787