Method Article

Toepassing van flowvermimetrie voor kwantificering en analyse van het darmmicrobioom van Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/64605

⸱

March 31st, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research and Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Development, Disease Models and Therapeutics Program, Graduate School of Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans is een krachtig model om de moleculaire determinanten te onderzoeken die de interacties tussen gastheer en microbioom aansturen. We presenteren een pijplijn met hoge doorvoer die de niveaus van darmmicrobioomkolonisatie bij één dier profileert, samen met belangrijke aspecten van de fysiologie van C. elegans.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De samenstelling van het darmmicrobioom kan een dramatische invloed hebben op de fysiologie van de gastheer tijdens de ontwikkeling en het leven van het dier. Het meten van veranderingen in de samenstelling van het microbioom is cruciaal bij het identificeren van de functionele relaties tussen deze fysiologische veranderingen. Caenorhabditis elegans is naar voren gekomen als een krachtig gastheersysteem om de moleculaire drijfveren van gastheer-microbioominteracties te onderzoeken. Met zijn transparante lichaamsplan en fluorescerend gelabelde natuurlijke microben kunnen de relatieve niveaus van microben in het darmmicrobioom van een individueel C. elegans-dier gemakkelijk worden gekwantificeerd met behulp van een grote deeltjessorteerder. Hier beschrijven we de procedures voor het experimenteel opzetten van een microbioom, het verzamelen en analyseren van C. elegans-populaties in de gewenste levensfase, de werking en het onderhoud van de sorteerder, en statistische analyses van de resulterende datasets. We bespreken ook overwegingen voor het optimaliseren van sorteerinstellingen op basis van de microben die van belang zijn, de ontwikkeling van effectieve poortstrategieën voor de levensfasen van C. elegans en hoe sorteermogelijkheden kunnen worden gebruikt om dierpopulaties te verrijken op basis van de samenstelling van het darmmicrobioom. Voorbeelden van mogelijke toepassingen zullen worden gepresenteerd als onderdeel van het protocol, waaronder het potentieel voor schaalbaarheid naar toepassingen met een hoge doorvoer.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De evolutie van dieren staat onder constante microbiële invloed1. Van diverse microben in de omgeving verwerven dierlijke gastheren specifieke partners2 die de mogelijkheden van de gastheer uitbreiden en zijn fysiologie en vatbaarheid voor ziekten stimuleren3. Metagenomische analyses van het darmmicrobioom brachten bijvoorbeeld verrijkte metabole klassen van microbiële genen aan het licht die een grotere energieoogst en -opslag kunnen opleveren bij zwaarlijvige muizen4, waarvan er vele ook worden aangetroffen in het menselijke darmmicrobioom5. Er is nog steeds een grote behoefte om causale verbanden vast te stellen en de moleculaire determinanten van de impact van het microbioom vast te stellen, hoewel de vooruitgang wordt belemmerd door de complexiteit van het microbioom en de traceerbaarheid van gastheersystemen voor grootschalige screening.

Het modelorganisme C. elegans biedt een platform om het moleculaire begrip van verbanden tussen microbioom en gastheerfysiologie te bevorderen. C. elegans bezit 20 darmcellen met een slijmvlieslaag en villistructuren. Deze cellen zijn uitgerust met overvloedige chemoreceptorgenen die microbiële producten detecteren en antimicrobiële moleculen produceren die mogelijk hun darmkolonisatoren reguleren 6,7. Deze geconserveerde biologie van C. elegans heeft geleid tot een enorm aantal ontdekkingen in gastheersignalering die darmmicroben reguleren, waaronder insulinesignalering, TGF-bèta en MAP-kinase 8,9,10.

C. elegans gebruiken microben als zowel hun dieet voor groei tijdens de ontwikkeling als het microbioom als volwassenen. Naarmate ouder worden, kunnen sommige microben zich te veel ophopen in het darmlumen en verschuift de relatie tussen gastheer en microbe van symbiose naar pathogenese11. In hun natuurlijke habitat komt C. elegans een breed scala aan bacteriesoorten tegen12,13. Sequencing van 16S rDNA van representatieve monsters verzameld in natuurlijke habitats (rot fruit, plantenstengel en dierlijke vectoren) onthulde dat het natuurlijke microbioom van C. elegans wordt gedomineerd door vier bacteriële phyla: Proteobacteriën, Bacteroidetes, Firmicutes en Actinobacteriën. Binnen deze divisies ligt een grote variatie in de diversiteit en rijkdom van bacteriën op basis van de habitat12,13,14,15. Er zijn verschillende gedefinieerde gemeenschappen opgericht, waaronder de 63-leden (BIGbiome)16 en 12-leden (CeMbio) collecties die de belangrijkste microbioomgeslachten vertegenwoordigen die zijn gecreëerd voor de C. elegans-onderzoeksgemeenschap 17. Zowel microbiomen als samenstellende stammen kunnen een diverse invloed hebben op de fysiologie van C. elegans, zoals lichaamsgrootte, groeisnelheid en stressreacties9,16,17. Deze studies bieden middelen en voorbeelden om C. elegans vast te stellen als een model voor microbioomonderzoek.

Hier wordt een op grote deeltjessorteerder (LPS) gebaseerde workflow (Figuur 1) gepresenteerd die gebruik maakt van het C. elegans-systeem om tegelijkertijd de samenstelling van het microbioom en basismetingen van de fysiologie van de gastheer op populatieschaal te meten. Aan de microbiële kant is de workflow aanpasbaar om een gedefinieerd microbioom of enkele microben samen te stellen om de robuustheid en plasticiteit van de gemeenschap te testen met toenemende microbiële interacties. Aan de kant van de gastheer maakt de workflow high-throughput-assays mogelijk om kolonisatieniveaus van fluorescerende microben in het microbioom te meten en de fysiologische uitlezing van de gastheer in termen van ontwikkeling, lichaamsgrootte en reproductie. Alles bij elkaar maakt het microbioommodel van C. elegans high-throughput screens mogelijk om de metabole en genetische determinanten te lokaliseren die de fysiologie van de gastheer moduleren.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van het microbioommengsel

  1. Stamp of streep bacteriën uit een glycerol-diepvriesbouillon op een lysogene bouillon (LB)-plaat, of een geschikt groeimedium, en kweek 's nachts bij een optimale temperatuur op basis van bacteriestammen die van belang zijn (meestal 25 °C voor natuurlijke microben van C. elegans ).
  2. Gebruik van de LB-plaat een enkele kolonie van elk bacterie-isolaat (bijv. 12 bacteriën van de CeMbio-collectie) om 800 μL LB-medium te inoculeren in afzonderlijke putjes van een 1 ml deepwell-plaat. Incubeer een nacht op de optimale temperatuur met schudden op 250 tpm.
    OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor gebruik met gedefinieerde natuurlijke microbiomen (bijv. CeMbio), maar kan eenvoudig worden aangepast voor individuele microben door groei onder geschikte omstandigheden of andere kweekvaten (buisjes).
  3. Beoordeel de groei van elke microbe door middel van spectrofotometrie. Breng een aliquot van 20 μl over op 80 μl LB en voeg de oplossing toe aan een doorzichtige plaat met 96 putjes met platte bodem. Meet de OD600 op een plaatlezer.
  4. Centrifugeer na een nacht groei de deepwell-kweekplaat gedurende 10 minuten bij 4.000 x g om bacteriën te pelleteren en verwijder het supernatans door aspiratie met behulp van een 96-wells aspiratiespruitstuk of meerkanaalspipet.
  5. Gebruik OD 600-waarden om de concentratie van elke microbe te normaliseren tot een uiteindelijke OD600 van 1,0 met behulp van steriel M9-medium.
  6. Als u microben combineert, bepaal dan de hoeveelheid bacteriecultuur die nodig is voor het experiment en creëer een microbioom-mastermix door gelijke volumes van elke bacteriestam te combineren in een buis van voldoende grootte (bijv. 5 ml of 15 ml buisjes).
  7. Spot 30-50 μL van de microben met een uiteindelijke OD600 van 1,0 op het midden van elk nematodengroeimedium (NGM) agar-bevattende plaat of putje18. Laat het gezaaide microbioom 's nachts groeien bij een optimale temperatuur (hier 25 °C).
    NOTITIE: Bereid NGM-agarplaten van tevoren voor volgens de instructies in het wormboek of met behulp van voorgemengd NGM-poeder18. Er wordt bijvoorbeeld 3 ml NGM toegevoegd voor platen met 12 putjes en 1,5 ml voor platen met 24 putjes.

2. Voorbereiding van gesynchroniseerde C. elegans voor groei op het microbioom

  1. Kweek ongeveer 100 wormen op NGM-platen (6 cm diameter) bezaaid met Escherichia coli OP50, totdat de wormen de volwassen leeftijd bereiken. Voor de doeleinden van dit protocol werd de C. elegans N2-stam gebruikt, hoewel het protocol gemakkelijk kan worden aangepast aan andere nematodenstammen.
  2. Voeg 6 ml M9-buffer toe (plus 0,01% triton X-100; M9-TX) op de plaat, pipetteren op en neer om ongeveer 100 drachtige volwassen wormen in een conische buis van 15 ml te spoelen.
  3. Bereid vers gemaakte bleekoplossing door twee delen bleekmiddel te mengen met een deel 5 M NaOH.
  4. Centrifugeer de wormen gedurende 30 seconden op 3.000 x g om de wormen te pelleteren. Zuig aan om het volume terug te brengen tot 4 ml en voeg vervolgens 2 ml bleekoplossing toe.
  5. Sluit het deksel goed en schud de buis. Bewaak de volwassen wormen in de oplossing onder een stereomicroscoop met een vergroting van 10x. Wanneer volwassen lichamen uit elkaar beginnen te vallen, meestal na 3,5 minuut, stop dan met schudden en centrifugeer gedurende 30 seconden op 3.000 x g .
  6. Zuig op tot een minimaal volume met een pipet. Resuspendeer, centrifugeer en zuig vier keer op in M9-TX om het bleekmiddel uit te wassen.
  7. Resuspendeer in 4-6 ml M9-TX en plaats de buis een nacht op een rotator, zodat de eieren kunnen uitkomen en synchroniseren in de L1-fase.
  8. Neem de volgende dag 10 μL L1-wormen in M9-TX uit de buis en laat ze op een schone petrischaal vallen. Tel het aantal levende L1-wormen onder een stereomicroscoop met een totale vergroting van 20x.
  9. Op basis van de L1-dichtheid pipetteert u het juiste volume om ~50 gesynchroniseerde L1-larven op de rand van de met microbioom gezaaide NGM-platen te laten vallen en te incuberen bij 20 °C. Laat wormen groeien tot de gewenste leeftijd (dag 2 of dag 3 van de volwassenheid).

3. Verzamelen van wormpopulatie voor darmmicrobioomanalyses

  1. Was de wormen van het bacteriële gazon met 1-2 ml M9-TX op een gesteriliseerde 2 ml 96-well diepe plaat.
    NOTITIE: Voor microbiële stammen die significante biofilms creëren, schudt u de plaat gedurende 5 minuten met vloeistof om microbieel afval te breken.
  2. Centrifugeer de deepwell-plaat gedurende 1 minuut op 300 x g om de wormen te pelleteren en verwijder vervolgens de vloeistof met behulp van een aanzuigspruitstuk.
    OPMERKING: Gebruikers kunnen een meerkanaalspipet gebruiken om de vloeistof handmatig te verwijderen als er geen aanzuigspruitstuk beschikbaar is. Zorg ervoor dat de pipetpunten de bodem van de putjes niet raken om verlies van wormmonsters te voorkomen.
  3. Voeg 1,8 ml M9-TX toe aan elk putje van de deepwell-plaat met behulp van een meerkanaalspipet van 1,2 ml. Meng door een paar keer op en neer te pipetteren en centrifugeer gedurende 1 minuut op 300 x g . Herhaal deze stap vier keer om bacteriën in de vloeistof te verwijderen.
  4. Breng na de laatste wasbeurt het volume in elk putje op 100 μL met behulp van het aanzuigspruitstuk.
    OPMERKING: Om volwassenen van de larven te scheiden met behulp van de zwaartekracht, laat u de plaat 30-60 s op de bank staan, zodat volwassen wormen naar de bodem van de put kunnen zinken. Zuig vervolgens de plaat op om larven uit de suspensie te verwijderen.
  5. Voeg 100 μL 10 mM levamisol in M9-TX toe aan elk putje en laat de wormen 5 minuten verlammen. Voeg na de behandeling met levamisol 4% van de bleekoplossing beschreven in stap 2.3 toe aan elk putje gedurende 2 minuten om bacteriële klonten te verminderen, indien nodig. Was tweemaal met M9-TX na de bleekbehandeling en zuig na de tweede wasbeurt op tot een eindvolume van 100 μL.
  6. Breng de wormen over naar een vlakke bodem met 96 putjes die 150 μL 10 mM levamisol in M9-TX bevat. Houd de wormdichtheid op 50-100 per put en splits de wormen in meerdere putten als de populatie te druk is.

4. Instellen van de grote deeltjessorteerder en autosampler

  1. Schakel de luchtcompressor, de computer en het LPS-instrument in. Controleer en leeg de afvaltank. Voeg vervolgens 500 ml bleekmiddel toe aan de lege afvaltank. Controleer en vul de schede en watertanks bij als het volume laag is. Zorg ervoor dat de 250 μm fluidic and optical core assembly (FOCA) op zijn plaats zit.
  2. Voer de controledeeltjes uit voor kwaliteitscontrole. Open de LPS-instrumentsoftware. Vink in het softwarevenster Lasers inschakelen aan om de lasers van 488 nm en 561 nm in te schakelen.
    OPMERKING: Het is mogelijk om stap 4.2-4.5 over te slaan als de controledeeltjes in de afgelopen 2 weken zijn uitgevoerd en de FOCA in die tijd niet is gewijzigd.
  3. Selecteer Deeltjes instellen > beheersen. Selecteer Nee in de prompt om naar de standaardinstellingen te gaan. Draai de controledeeltjes (10 ml dH, 2O en 10 ml controledeeltjes in een conische buis van 50 ml) voor elk gebruik en laad ze op de monsterpoort.
  4. Als u klaar bent, klikt u op Acquireren om 500 gebeurtenissen op te nemen. Zorg ervoor dat de gebeurtenissnelheid tussen de 15 en 30 gebeurtenissen/s ligt.
    NOTITIE: Als de gebeurtenissnelheid niet 15-30 gebeurtenissen/s is, moet contact worden opgenomen met een technicus om de machine-instellingen aan te passen.
  5. Onderzoek de variatiecoëfficiënt (CV) voor alle parameters. Als CV 15% <, is de kwaliteitscontrole geslaagd en kan de LPS-software worden afgesloten. Als CV 15% >, voer dan opnieuw uit en pas micrometers aan met vers gemaakte controledeeltjes om de laser uit te lijnen met de stroomcel.
  6. Sluit de autosampler aan en zet hem aan. Open de software van het autosampler-instrument. Dit opent de autosampler en de LPS-software. Ga in het LPS-softwarevenster naar Bestand > nieuw experiment en vervolgens naar Bestand > nieuw voorbeeld. Vink Lasers inschakelen aan om lasers van 488 nm en 561 nm in te schakelen als dit nog niet is gedaan.
  7. Maak sjablonen voor acquisitiepuntplots met behulp van vluchttijd (TOF), extinctie (EXT) en fluorescerende kanalen in het LPS-softwarevenster. Een goed startmaximum om alle wormen te vangen is 8.000 voor TOF en EXT. Fluorescentieschalen variëren op basis van elke microbe. Neem controlewormmonsters op die zijn gekweekt op niet-fluorescerende microbe (bijv. OP50) en elke fluorescerende microbe alleen (als microben worden gemengd) als controles bij elk experiment.
    1. Klik met de rechtermuisknop in de hoofdtekst van een grafiek om de schaal te wijzigen. Gebruik controledieren zoals volwassen dag 1 of gesynchroniseerde L1's (of populatie van belang) om te helpen bij de selectie van TOF en EXT gating.
  8. Selecteer in het autosampler-venster de optie Prime. Ga naar Bestand > Open Script om het juiste ingebouwde script te selecteren en klik vervolgens op OK.
    1. Selecteer het script met Acquire, alleen voor analyse. Als u wilt sorteren, selecteert u het script met Dispense. Voor acquisitie van platen met 96 putjes, selecteert u het script met 96 putjes; Voor het verkrijgen van platen met 384 putjes, selecteert u het script met 384 wells. Voor het monstervolume (40 of 100 μL) selecteert u het script met het bijbehorende volume.
  9. Ga naar Plate Template in het autosampler-softwaremenu om de gewenste putjes voor analyse te selecteren. Laad de controlemonsters. Nadat de plaat op de autosampler-tafel is geladen en vastgezet, drukt u op Run Plate in het autosampler-venster. Sla het bestand op wanneer daarom wordt gevraagd.
    NOTITIE: Controlemonsters en instellingen kunnen worden gedaan met een conische buis van 50 ml op de LPS-monsterpoort voordat de LP-sampler wordt bevestigd.
  10. Wanneer de acquisitie is voltooid, klikt u op de knop Gegevens opslaan op het bovenste lint in het LPS-softwarevenster en slaat u de gegevens opnieuw op.

5. Analyse van de kenmerken van C. elegans en het niveau van het darmmicrobioom per dier

  1. Ruwe gegevens worden opgeslagen in drie bestandstypen: .lmd, .bxr3, .txt. Laad het tekstbestand met het label .txt bestand in het R-programma voor analyse. Voer de onderstaande stappen in V19 uit.
  2. Gebruik het pakket tidyverse20 als raamwerk voor de analyse.
  3. Met behulp van de ggplot-functie (inbegrepen in tidyverse) worden de LPS-gegevens geplot met behulp van de TOF-waarden als x-as en EXT-waarden als y-as. Een normale grafiek toont twee wolken van stippen. Zorg ervoor dat men zich dicht bij de oorsprong en de x-as bevindt, wat wijst op kleinere deeltjes zoals larven en klein puin en de tweede groep deeltjes bevindt zich rechtsboven in de grafiek en vertegenwoordigt volwassen nematoden.
  4. Gebruik deze groepering als richtlijn en kies geschikte TOF- en EXT-afkapwaarden. Gating kan variëren per C. elegans-stam op verschillende microben op basis van veranderingen in de fysiologie (bijv. donkere versus heldere dieren of veranderingen in het vervoer van eieren kunnen de EXT-coëfficiënten veranderen).
  5. Gebruik de functiesubset om volwassenen en larven te scheiden door TOF- en EXT-gating. Gebruik in het voorbeeld hier TOF > 1.200 en EXT > 1.000 instellingen om volwassen dieren te poorten.
  6. Analyseer de resulterende datasets op statistische verschillen; gebruik de t-toets functie in R voor dit experiment.
    1. Om de impact van het microbioom op de grootte en optische dichtheid van C. elegans te bepalen, vergelijkt u respectievelijk de TOF- en EXT-waarden tussen de omstandigheden. TOF is een proxy voor de grootte van de worm en kan veranderingen in de groeisnelheid van de dieren op specifieke tijdstippen aangeven. EXT-veranderingen zijn het grootst tussen het einde van de ontwikkeling en de volwassenheid vanwege het licht dat door eieren wordt verstrooid en kunnen worden gebruikt om veranderingen in de timing van die overgang en vruchtbaarheid te beoordelen. Beoordeel het aandeel en de verdeling van de nakomelingen als ze tijdens de analyses zijn behouden.
    2. Om veranderingen in de kolonisatieniveaus van het darmmicrobioom te bepalen, normaliseert u eerst de fluorescentiewaarden (bijv. rode of groene kolommen) door te delen met individuele TOF-waarden voor elk dier. Naarmate wormen groter worden en volwassen worden, wordt het volume van hun darmen ook groter. Normalisatie helpt bij het verminderen van artefacten door verschillen in de verdeling van de grootte van steekproefdieren. Gebruik genormaliseerde dieren om veranderingen in de kolonisatie van het darmmicrobioom onder verschillende omstandigheden te beoordelen.
      OPMERKING: Een voorbeeld van ruwe gegevens en bijbehorende R-scripts zijn te vinden in het aanvullende bestand 1 JOVE_worm_microbiome.txt en het aanvullende bestand 2 JOVE_worm_microbiome.r. Zie figuur 2 en figuur 3 voor een representatief voorbeeld van deze analyses van de gastheer en het microbioom met behulp van twee fluorescerende bacteriën.

6. Sorteren van C. elegans-dieren op basis van darmmicrobioomkenmerken

  1. Verzamel een C. elegans-populatie die is gekweekt op fluorescerend gelabelde microben (bijv. RFP) zoals beschreven in stap 3. Wormen moeten in kegelvormige buisjes van 50 ml worden geplaatst met minimaal 5 ml monster. Streef naar ongeveer 2.000 wormen/ml, inclusief alle volwassen dieren en nakomelingen.
    OPMERKING: Dit kan ook worden gedaan in een vlakke bodem met 96 putjes met behulp van de LP-sampler. Houd de wormdichtheid op 50-100 per putje.
    1. Als de LP-sampler is gebruikt, schakelt u de LP-sampler uit en koppelt u deze los. Sluit de monster- en spoellijnen opnieuw aan op de LPS voordat u gaat sorteren.
  2. Open de LPS-software, ga naar Bestand > nieuw experiment en vervolgens naar Bestand > nieuw voorbeeld. Maak een dot plot met TOF op de x-as en Extinction op de y-as. Maak nog een puntplot met TOF op de x-as en rood op de y-as. Gebruik dezelfde asschaal en laserinstellingen als voorheen. Vink Lasers inschakelen aan om lasers van 488 nm en 561 nm in te schakelen
    OPMERKING: Als deze plots eerder zijn gemaakt, gaat u naar Bestand > Experiment openen en Bestand > Steekproef openen om grafieken te laden.
    1. Plaats het controlemonsterbuisje op de monsterpoort. Klik in het dialoogvenster Verkrijgen/afgeven op Verkrijgen. Sla het bestand op wanneer daarom wordt gevraagd. Nadat er voldoende wormen zijn gemeten om populaties te onderscheiden, klikt u op Afbreken.
      NOTITIE: Het debiet moet ongeveer 15-30 gebeurtenissen/s zijn. Als dit niet het geval is, pas dan de wormconcentraties aan om ervoor te zorgen dat individuele dieren per druppel worden geanalyseerd of gesorteerd. Bij LPS passeren wormen het pad van de laser in verschillende posities (recht versus gekruld of gebogen). Ze kunnen een verschillende hoeveelheid tijd nodig hebben om de laser en detector te passeren, afhankelijk van hun posities.
    2. Teken in de TOF vs Extinction dot plot een poort rond de volwassen populatie. In de TOF vs Red dot plot teken je poorten rond de gebieden met hoge en lage rode waarden als interessegebieden voor volwassen wormen met verschillende niveaus van microbioomkolonisatie. Ga naar View > Gating Hierarchy en zorg ervoor dat de fluorescerende poorten worden vermeld onder de poort voor volwassen bevolking. Nadat de instellingen zijn geoptimaliseerd, gaat u naar Bestand > Experiment opslaan en Bestand > Voorbeeld opslaan.
      OPMERKING: Selecteer in het voorbeeld hier dieren op basis van TOF/EXT-poorten voor volwassenen en sorteer in pools die een hoge of lage kolonisatie vertonen met rode fluorescerende eiwitexpressiebacteriën. Elke combinatie van parameters die door de LPS wordt gemeten, kan echter worden gebruikt om de populatie(s) van belang te identificeren.
  3. Controleer voor het sorteren of de juiste opvangapparatuur is geladen. Als u de plaat met 96 putjes op het opvangapparaat wilt plaatsen, selecteert u Laadplaat A > Verplaatsen onder de sectie Fase verplaatsen in het dialoogvenster Verkrijgen/doseren om de verzamelfase naar een positie te laten gaan die is voorbereid voor het laden van een plaat met 96 putjes.
  4. Voor bulksortering selecteert u de juiste buismaat en klikt u op Verplaatsen om een conische buis van 15 ml of 50 ml te laden. Kies in de sectie Sorteren van het dialoogvenster Verkrijgen/afgeven de sorteerpoort in de vervolgkeuzelijst met de gemaakte regio's. Voer het aantal objecten uit het gedefinieerde gebied in dat moet worden afgegeven aan een opvangbuis direct onder het mondstuk van de stroomcel. Klik op de knop Bulksortering onder het dialoogvenster Verkrijgen/afgeven.
  5. Voor het doseren op een plaat met 96 putjes gaat u naar Platen > instellen > gekalibreerde platen > plaat met 96 putjes. Ga vervolgens naar View > Plate Template, selecteer de putten waarnaar de wormen zullen worden gesorteerd, voer het aantal objecten in dat in elke put moet worden gesorteerd en selecteer de omheinde gebieden van belang. Als er meer dan één omheind gebied op hetzelfde bord wordt gesorteerd, vink dan het vakje Gate Each Well aan. Klik op OK om de wijzigingen op te slaan.
  6. Nadat de sorteernummers en locaties zijn toegewezen, klikt u op de knoppen Plaat vullen in het dialoogvenster Verkrijgen/doseren om de dosering op een plaat met 96 putjes te starten.
    1. Voordat u de volledige plaat met 96 putjes vult, voert u een testsortering uit van een subset van dieren of controles in een plaat met 96 putjes en analyseert u deze met behulp van een stereomicroscoop om er zeker van te zijn dat de juiste aantallen en gewenste dierpopulaties zijn gesorteerd. Zodra de nauwkeurige sortering is bevestigd, herhaalt u stap 6.3-6.6 voor experimentele monsters. Klik op de knop Gegevens opslaan op het bovenste lint in het LPS-softwarevenster om gegevens opnieuw op te slaan.
      OPMERKING: Alle metingen (EXT, TOF, RFP, GFP, enz.) kunnen ook worden verzameld voor gesorteerde dieren en worden vergeleken met dieren die niet zijn gesorteerd. Hierdoor kunnen analyse- en sorteermodi desgewenst tegelijkertijd worden uitgevoerd.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Definiëren van populatiepoorten voor volwassen dieren en larven
Hier werden gesynchroniseerde C. elegans L1's gekweekt op een NGM-plaat bezaaid met E. coli OP50 (Eco), een standaard laboratoriumdieet. C. elegans-populaties werden verzameld voor LPS-analyse na 96 uur of 120 uur groei bij 20 °C (figuur 2A). Een dot plot van uitsterven (EXT, een proxy van lichaamsdichtheid) versus time-of-flight (TOF, een proxy van lichaamslengte) creëert twee visu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Flowvermimetrie is gebruikt om C. elegans-genen en -routes tegen pathogene kolonisatie en toxiciteit in verschillende onderzoeken te karakteriseren21,22. Hier wordt een 'high throughput alife' benadering gepresenteerd die C. elegans gebruikt om te onderzoeken hoe darmmicrobiomen hun gastheerfysiologie moduleren. Vergeleken met bestaande methoden die gebruik maken van kolonievormende eenheden (CFU) of 16S rRNA-ampliconsequencing 9,16,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies DP2DK116645 (aan BSS), Dunn Foundation pilot award en NASA-subsidie 80NSSC22K0250 (aan BSS). Dit project werd ook ondersteund door de Cytometry and Cell Sorting Core van het Baylor College of Medicine met financiering van de CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), de NIH (S10 OD025251, CA125123 en RR024574), en de hulp van Joel M. Sederstrom, plus een instrumentatiesubsidie voor de LPS NIH-subsidie (S10 OD025251). Sommige stammen werden geleverd door de CGC, die wordt gefinancierd door het NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL conical bottom centrifuge tubesVWR10026-076
96 deep-well plates (1 mL)AxygenP-DW-11-C
96 deep-well plates (2 mL)AxygenP-DW-20-C
96-well Costar plateCorning3694
AgarMillipore SigmaStandaard bacteriologie agar is ook voldoende.
Aspirating manifoldV&P scientificVP1171A
BleachClorox
Bleach solution Meng bleekmiddel met 5M Natriumhypochloriet 2:1 (v/v)
Cell Imaging Multimode ReaderBiotekCytation 5Bacteriële OD-meting
CentrifugeThermo scientific Sorvall Legend XTRVoor 96-well plate en conische buizen
Fluorescent MicroscopeNikonTiE
ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data.R packageVersion 3.3.2
Large Particle AutosamplerUnion BiometricaLP Sampler
Large Particle SorterUnion BiometricaCOPAS Biosorter
LevamisoleFisherAC187870100
Lysogeny Broth (LB)RPIL24066Standaard LB thuisgemaakte recepten met behulp van Bacto-tryptone, gistextract en NaCl zijn ook voldoende.
M9 solution 22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Nematode Growth MediumRPIN81800-1000.01 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 toegevoegd na autoclaving.
RStudioGNUVersion 1.3.1093
Sodium hypochloriteSigma-Aldrich5M NaOH
Stereo MicroscopeNikonSMZ745
Sterile 10 cm diameter petri dishesCorning351029
Sterile 12-well platesVWR10062-894
Sterile 24-well platesVWR10062-896
Sterile 6 cm diameter petri dishesCorning351007
Triton X-100Sigma-AldrichT8787

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).
  2. Seedorf, H., et al. Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut. Cell. 159 (2), 253-266 (2014).
  3. Bäckhed, F., et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).
  4. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
  5. Gill, S. R., et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science. 312 (5778), New York, N.Y. 1355-1359 (2006).
  6. Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).
  7. Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).
  8. Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  9. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
  10. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921(2003).
  11. Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).
  12. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  13. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38(2016).
  14. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  15. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485(2017).
  16. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  17. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3. 10 (9), Bethesda, Md. 3025-3039 (2020).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
  19. R Core. Team R: A language and environment for statistical computing. R Core. , (2018).
  20. Wickham, H., et al. tidyverse. , (2019).
  21. Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (137), e58068(2018).
  22. Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments. (85), e51090(2014).
  23. Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiology. 12 (1), 49(2012).
  24. Zhang, F., et al. High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome. Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).
  25. Wiles, T. J., et al. Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages. mBio. 9 (5), 01877(2018).
  26. Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ. Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).
  27. Leonard, S. P., et al. Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
  28. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).
  29. Mok, C. A., et al. MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes. Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow VermimetryGut MicrobiomeCaenorhabditis ElegansMicrobiome QuantificationLarge Particle SorterFluorescent MicrobesGating StrategiesHigh Throughput AnalysisMicrobiome ColonizationHost Microbe Interactions

Related Articles