Eencellige analyse van de expressie van Pseudomonas syringae-genen in het plantenweefsel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft een methode die eencellige genexpressieanalyse mogelijk maakt op Pseudomonas syringae-populaties die in de apoplast van de plant worden gekweekt.

Samenvatting

Een overvloed aan pathogene micro-organismen vallen voortdurend planten aan. Het Pseudomonas syringae-soortencomplex omvat Gram-negatieve plantpathogene bacteriën van bijzonder belang voor een groot aantal gastheren. P. syringae komt de plant binnen vanaf het bladoppervlak en vermenigvuldigt zich snel binnen de apoplast en vormt microkolonies die de intercellulaire ruimte bezetten. De constitutieve expressie van fluorescerende eiwitten door de bacteriën maakt visualisatie van de microkolonies mogelijk en monitoring van de ontwikkeling van de infectie op microscopisch niveau. Recente ontwikkelingen in eencellige analyse hebben de grote complexiteit aangetoond die wordt bereikt door klonale isogene bacteriële populaties. Deze complexiteit, fenotypische heterogeniteit genoemd, is het gevolg van cel-tot-cel verschillen in genexpressie (niet gekoppeld aan genetische verschillen) tussen de bacteriële gemeenschap. Om de expressie van individuele loci op eencellig niveau te analyseren, zijn transcriptionele fusies met fluorescerende eiwitten op grote schaal gebruikt. Onder stressomstandigheden, zoals die optreden tijdens de kolonisatie van de apoplast van de plant, differentieert P. syringae in verschillende subpopulaties op basis van de heterogene expressie van belangrijke virulentiegenen (d.w.z. het Hrp type III-secretiesysteem). Eencellige analyse van een bepaalde P. syringae-populatie hersteld uit plantenweefsel is echter een uitdaging vanwege het cellulaire puin dat vrijkomt tijdens de mechanische verstoring die inherent is aan de inentings- en bacteriële extractieprocessen. Het huidige rapport beschrijft een methode die is ontwikkeld om de expressie van P. syringae-genen van belang op eencellig niveau te volgen tijdens de kolonisatie van Arabidopsis en bonenplanten. De bereiding van de planten en de bacteriële suspensies die worden gebruikt voor inenting met behulp van een vacuümkamer worden beschreven. Het herstel van endofytische bacteriën uit geïnfecteerde bladeren door apoplastische vloeistofextractie wordt hier ook uitgelegd. Zowel de bacteriële inentings- als de bacteriële extractiemethoden zijn empirisch geoptimaliseerd om schade aan planten en bacteriële cellen te minimaliseren, wat resulteert in bacteriële preparaten die optimaal zijn voor microscopie en flowcytometrie-analyse.

Inleiding

Pathogene bacteriën vertonen verschillen in verschillende fenotypen, wat aanleiding geeft tot de vorming van subpopulaties binnen genetisch identieke populaties. Dit fenomeen staat bekend als fenotypische heterogeniteit en is voorgesteld als een aanpassingsstrategie tijdens interacties tussen bacteriën^{en gastheer 1}. Recente ontwikkelingen in de optische resolutie van confocale microscopen, flowcytometrie en microfluïdica, gecombineerd met fluorescerende eiwitten, hebben eencellige analyses van bacteriële populaties bevorderd².

De Gram-negatieve Pseudomonas syringae is een archetypische plantpathogene bacterie vanwege zowel zijn academische als economische belang³. De levenscyclus van P. syringae is gekoppeld aan de watercyclus⁴. P. syringae komt de intercellulaire ruimtes tussen de mesofylcellen, de apoplast van het plantenblad, binnen via natuurlijke openingen zoals huidmondjes of wonden⁵. Eenmaal in de apoplast vertrouwt P. syringae op het type III-secretiesysteem (T3SS) en de type III-getransloceerde effectoren (T3E) om de immuniteit van planten te onderdrukken en de cellulaire functies van planten te manipuleren ten behoeve van de ziekteverwekker⁶. De expressie van T3SS en T3E is afhankelijk van de hoofdregulator HrpL, een alternatieve sigmafactor die zich bindt aan de hrp-boxmotieven in het promotorgebied van de^{doelgenen 7}.

Door chromosoom-gelokaliseerde transcriptionele fusies te genereren naar fluorescerende eiwitgenen stroomafwaarts van het gen van belang, kan men genexpressie volgen op basis van de fluorescentieniveaus die worden uitgezonden op het niveau van één cel⁸. Met behulp van deze methode is vastgesteld dat de expressie van hrpL heterogeen is, zowel binnen bacterieculturen die in het laboratorium worden gekweekt als binnen bacteriepopulaties die zijn hersteld uit de plant apoplast ^8,9. Hoewel genexpressieanalyse op eencellig niveau meestal wordt uitgevoerd in bacterieculturen die in laboratoriummedia worden gekweekt, kunnen dergelijke analyses ook worden uitgevoerd op bacteriepopulaties die in de plant groeien, waardoor waardevolle informatie wordt verkregen over de vorming van subpopulaties in de natuurlijke context. Een mogelijke beperking voor de analyse van bacteriële populaties die uit de plant worden geëxtraheerd, is dat klassieke inentingsmethoden door infiltratie van de spuitdruk in de apoplast, gevolgd door bacteriële extractie door maceratie van het bladweefsel, meestal een grote hoeveelheid cellulair plantenresten genereren die de stroomafwaartse analyse verstoort¹⁰. Het meeste cellulaire puin bestaat uit autofluorescerende fragmenten van chloroplasten die overlappen met GFP-fluorescentie, wat resulteert in misleidende resultaten.

Het huidige protocol beschrijft het proces van het analyseren van heterogeniteit van eencellige genexpressie in twee modelpathosystemen: die gevormd door de P. syringae pv. tomatenstam DC3000 en Arabidopsis thaliana (Col-0), en de andere door de P. syringae pv. phaseolicola stam 1448A en bonenplanten (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). Een inentingsmethode wordt voorgesteld op basis van vacuüminfiltratie met behulp van een vacuümkamer en een pomp, wat resulteert in een snelle en schadevrije methode om hele bladeren te infiltreren. Bovendien wordt, als een verbetering van conventionele protocollen, een zachtere methode gebruikt om de bacteriële populatie uit de apoplast te extraheren die weefselverstoring aanzienlijk vermindert, gebaseerd op de extractie van apoplastische vloeistof door cycli van positieve en negatieve druk toe te passen met behulp van een kleine hoeveelheid volume in een spuit.

Protocol

1. Plantvoorbereiding

1. Bereid Arabidopsis Col-0 planten voor volgens de onderstaande stappen.
   1. Vul een pot met een diameter van 10 cm met een 1:3 vermiculiet-plantensubstraatmengsel (zie materiaaltabel), eerder bewaterd, en bedek de pot met een metalen gaas van 15 cm x 15 cm met gaten van 1,6 mm x 1,6 mm. Pas het metalen gaas aan op de natte grond met behulp van een elastiekje (figuur 1A).
   2. Zaai met een natte tandenstoker Arabidopsis-zaden in de gaten van het metalen gaas. Plaats drie tot vier zaden op verre plaatsen in de pot (figuur 1B, C).
   3. Bedek de potten met een plastic koepel om een hoge relatieve luchtvochtigheid te behouden en incuber ze gedurende 72 uur bij 4 °C voor stratificatie.
      OPMERKING: Stratificatie (incubatie bij hoge luchtvochtigheid en lage temperatuur, zoals beschreven) verbetert de kiemsnelheid en synchronisatie van de zaden.
   4. Breng de potten over naar een plantengroeikamer onder omstandigheden van korte dagen (8 uur licht/16 uur donker bij 21 °C, lichtintensiteit: 100 μmol·m−²·s⁻¹, relatieve vochtigheid: 70%).
   5. Gebruik na het ontkiemen van het zaad (8-10 dagen) het pincet om de meeste zaailingen te verwijderen en houd één zaailing in elk van de posities van de pot (zes zaailingen / pot) (figuur 1D). Verwijder de plastic koepel om de potten bloot te leggen.
      OPMERKING: De planten zijn 4-5 weken na ontkieming klaar voor gebruik.
2. Bereid Phaseolus vulgaris bonen (cultivar Canadian Wonder) planten.
   1. Bedek de bodem van een petrischaaltje met een nat stuk handdoekpapier en leg de bonenpitten erop. Sluit de petrischaal af met chirurgische tape en incubeer gedurende 3-4 dagen bij 28 °C (figuur 2A).
   2. Breng de gekiemde zaden over in een pot met een diameter van 10 cm gevuld met natte 1:3 vermiculiet-plant substraatmix.
   3. Incubeer in een plantengroeikamer onder langdurige omgevingen (16 uur licht/8 uur donker bij 23 °C, lichtintensiteit: 100 μmol·m−²·s⁻¹, relatieve vochtigheid: 70%).
      OPMERKING: De planten zijn 10 dagen na ontkieming klaar voor gebruik (figuur 2B).

2. Inenting van Arabidopsis en bonenplanten

OPMERKING: In deze studie hebben de stammen P. syringae pv. tomaat DC3000 en P. syringae pv. phaseolicola 1448A werden gebruikt.

1. Bereid het P. syringae inoculum.
   1. Streep de P. syringae-stam van belang uit een glycerolvoorraad van −80 °C op een LB-plaat (10 g/L trypton, 5 g/L NaCl, 5 g/L gistextract en 16 g/L bacteriologische agar, zie tabel met materialen) aangevuld met de juiste antibiotica. Incubeer bij 28 °C gedurende 40-48 uur.
      OPMERKING: Het gebruik van antibiotica wordt aanbevolen als de betreffende stam een plasmide of een genomisch resistentiegen draagt. De aanbevolen antibioticaconcentraties voor P. syringae zijn als volgt: kanamycine (15 μg/ml), gentamycine (10 μg/ml), ampicilline (300 μg/ml) (zie materiaaltabel).
   2. Schraap de bacteriële biomassa eruit en resuspensie in 5 ml van 10 mM MgCl₂. Meet de OD₆₀₀ en stel in op 0,1 door 10 mM MgCl₂ toe te voegen.
      OPMERKING: Een OD₆₀₀ van 0,1 van een P. syringae cultuur komt overeen met 5 x 10⁷ CFU·ml⁻¹.
   3. Voer seriële verdunningen uit tot 10 mM MgCl₂ om een uiteindelijke entconcentratie van 5 x 10⁵ CFU·ml⁻¹ te bereiken. Bereid 200 ml entmateriaal voor de Arabidopsis-planten en 50 ml voor de bonenplanten.
   4. Voeg vlak voor de inenting de oppervlakteactieve stof Silwett L-77 (zie materiaaltabel) toe aan een eindconcentratie van 0,02% voor boneninenting en 0,01% voor Arabidopsis. Merk op dat Silwett enigszins schadelijk is voor het Arabidopsis-weefsel.
2. Voer vacuüminfiltratie uit.
   1. Voor Arabidopsis-infiltratie plaatst u twee houten stokken die een X vormen over de pot (figuur 1E) en plaatst u de pot met de voorkant naar beneden over een petrischaal met een diameter van 14 cm met het entmateriaal van 200 ml (figuur 1F).
   2. Voor inenting van bonenbladeren brengt u het blad in een conische centrifugebuis van 50 ml met het entmateriaal (figuur 2C).
   3. Steek de in de entoplossing ondergedompelde planten in een vacuümkamer (figuur 1G en figuur 2D) en geef gedurende 30 s een puls van 500 mbar om de bladeren te infiltreren. Herhaal de vacuümpuls 2-3 keer totdat het blad volledig is geïnfiltreerd (figuur 1H en figuur 2E).
   4. Giet de overtollige entoplossing af met een stuk papier en breng de planten terug naar hun overeenkomstige groeikamer.

3. Extractie van bacteriën uit de apoplast

1. Snijd vier dagen na inenting het bovengrondse deel van de Arabidopsis-plant of het geënte blad van de bonenplant en plaats het in een spuit van 20 ml zonder naald (figuur 2G). Voor bonenbladeren rolt u het blad op zichzelf en laat u het abaxiale gezicht naar buiten, zoals weergegeven in figuur 2F.
2. Voeg voldoende volume gedestilleerd water toe om het weefsel te bedekken (meestal 10-15 ml).
3. Plaats de zuiger en verwijder met de spuit in de verticale positie met de punt naar boven gericht de overtollige lucht en luchtbellen in de spuit door zachtjes op de cilinder te tikken totdat alle lucht zich in de buurt van de punt bevindt. Schuif vervolgens de zuiger om de lucht eruit te halen. Zodra er zo min mogelijk lucht in de spuit zit, bedek je de punt van het spuitvat met paraffinefilm.
4. Druk voorzichtig op de zuiger om positieve druk te genereren totdat het weefsel donkerder wordt (figuur 1I en figuur 2H). Trek vervolgens aan de zuiger om negatieve druk te genereren (figuur 1J en figuur 2I). Herhaal deze stap 3-5 keer.
5. Verwijder de paraffinefilm en de zuiger en vang de vloeistof op die de met apoplast geëxtraheerde bacteriën bevat, zoals in figuur 2J.

4. Eencellige analyse van de apoplast-geëxtraheerde bacteriën

1. Visualiseer door confocale microscopie volgens de onderstaande stappen.
   1. Bereid een 1,5% agarose-oplossing in gedestilleerd water. Eenmaal gesmolten, voeg je voldoende volume toe om de ruimte tussen twee naast elkaar geplaatste microscopiedia's te vullen en plaats je er nog een dia bovenop (figuur 3). Laat ze 15 minuten drogen en verwijder voorzichtig de schuif die op de bovenkant is geplaatst. Snijd met een mesje de agarose pad vlak voor gebruik in stukjes van 5 mm x 5 mm.
   2. Centrifugeer parallel 1 ml van de apoplast-geëxtraheerde bacteriën bij 12.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur, verwijder het supernatant voorzichtig met behulp van een pipet en resuspensie de pellet in 20 μL water om de cellen te concentreren. Plaats een druppel van 2 μL van de geconcentreerde cellen op een dekplaat van 0,17 mm en bedek de druppel met een stuk van 5 mm x 5 mm van het agarosekussen dat eerder in stap 1 is verkregen, zoals weergegeven in figuur 3.
   3. Visualiseer het bacteriepreparaat onder de confocale microscoop (zie materiaaltabel). Om groen-fluorescerende bacteriën te identificeren, gebruikt u de excitatielaser bij 488 nm en een emissiefilter van 500 nm tot 550 nm. Om alle bacteriën te identificeren, gebruikt u het heldere veld en voegt u beide velden samen.
   4. Verwerk de confocale beelden met Fiji (zie Materiaaltabel). Gebruik hiervoor de MicrobeJ-plug-in om de contouren van de bacteriële cel te identificeren en de fluorescentie-intensiteit binnenin te meten.
      OPMERKING: Beeldacquisitie van geïsoleerde bacteriën (niet geclusterd) wordt aanbevolen voor deze analyse.
2. Voer analyse uit met behulp van flowcytometrie.
   1. Neem een aliquot van de apoplast-geëxtraheerde bacteriesuspensies om te analyseren met behulp van de flow-cytometer. Verwerf 100.000 evenementen.
   2. Om onderscheid te maken tussen bacteriën en plantenresten, analyseert u de apoplast die is geëxtraheerd uit een niet-geënte plant en vergelijkt u de dot plot met de forward scatter (FSC) celgrootte versus side scatter (SSC) celgrootte met die van de apoplast-geëxtraheerde bacteriële suspensie. Om niet-fluorescerende bacteriën te identificeren, gebruikt u de apoplasten die zijn geëxtraheerd uit de planten die zijn ingeënt met niet-fluorescerende isogene bacteriën en vergelijkt u hun fluorescerende emissies.

Resultaten

De expressie van het type III secretiesysteem is essentieel voor de bacteriegroei in de plant. De tijdige expressie van T3SS-genen wordt bereikt door ingewikkelde regulatie, met als middelpunt de extracytoplasmatische functie (ECF) sigmafactor HrpL, de belangrijkste activator van de expressie van T3SS-gerelateerde genen¹¹. Een analyse van de expressie van hrpL werd eerder uitgevoerd met behulp van een chromosoom-gelokaliseerde transcriptionele fusie naar een downstream promotorloos gf...

Discussie

De hier gepresenteerde methode beschrijft een niet-invasieve procedure die de infiltratie van bacteriën in het bladweefsel van planten mogelijk maakt, waardoor de snelle inenting van grote volumes mogelijk is en tegelijkertijd weefselverstoring wordt geminimaliseerd. Een van de kenmerken van het P. syringae-soortencomplex is het vermogen om te overleven en zich te vermenigvuldigen in de plantenapoplast en op het plantoppervlak als epifyt¹⁴. De mogelijkheid dat de bacteriën die volgens het...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.17 mm coverslip			Geen speciale vereisten
1.6 x 1.6 mm metal mesh	Buzifu		Fiberglas zeef
10 cm diameter potten			Geen speciale vereisten
140 mm Petri schotels			Geen speciale vereisten
20 mL spuit			Geen speciale vereisten
50 mL conische buisjes	Sarstedt
Agarose	Merk
Ampicilline natrium	GoldBio
Bacteriologische agar	Roko
Confocale microscoop Stellaris	Leica Microsystems
FACSVerse celanalyzer	BD Biosciences
Fiji software
Gentamicilline sulfaat	Duchefa	G-0124
Kanamycin monosulfaat	Phytotechnology	K378
MgCl2	Merk
NaCl	Merk
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging
Plantensubstraat			Geen speciale vereisten
Silwet L-77	Cromton Europe Ltd
Tandenstokers			Geen speciale vereisten
Tryptone	Merk
Pincet			Geen speciale vereisten
Vacuumkamer 25 cm diameter	Kartell	554
Vacuumpomp	GAST	DOA-P504-BN
Vermiculiet			Geen speciale vereisten
Gist Extract	Merk