Methodenartikel

Gebruik van minimaal invasieve methoden om het brandstofverbruik en het circadiane ritme bij oudere volwassenen te beoordelen

1.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64628

⸱

5 januari 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Aging, University of Florida, 2Department of Clinical and Health Psychology, College of Public Health and Health Professions, University of Florida, 3Department of Health Outcomes and Bioinformatics, University of Florida

In dit artikel

Samenvatting

Een nieuw en minimaal invasief protocol wordt gepresenteerd om de synergetische impact van brandstofgebruik en circadiane ritmes op ouder wordende personen te evalueren, waarbij gebruik wordt gemaakt van perifere mononucleaire bloedcellen.

Samenvatting

Veroudering wordt geassocieerd met meerdere fysiologische veranderingen die synergetisch en onafhankelijk bijdragen aan lichamelijke invaliditeit en het risico op chronische ziekten. Hoewel de etiologie van leeftijdsgebonden fysieke invaliditeit complex en multifactorieel is, lijkt de achteruitgang van de mitochondriale functie samen te vallen met de progressie van functionele achteruitgang bij veel oudere volwassenen. De reden waarom de mitochondriale functie afneemt bij het ouder worden blijft ongrijpbaar, maar opkomende wetenschap geeft aan dat zowel het brandstofmetabolisme als het circadiane ritme de mitochondriale functie kunnen beïnvloeden.

Recente studies hebben aangetoond dat circadiane ritmes verstoord raken bij het ouder worden en dat verstoorde circadiane ritmes pathologische gevolgen hebben die de mitochondriale functie beïnvloeden en overlappen met veel leeftijdsgebonden chronische ziekten. De huidige kwantitatieve methoden voor directe beoordeling van de mitochondriale functie zijn invasief en vereisen doorgaans een spierbiopsie, wat problemen kan opleveren bij de werving van deelnemers en de therapietrouw van de studie, gezien de waargenomen niveaus van mogelijke pijn en risico's. Zo werd een innovatief en relatief niet-invasief protocol aangepast om veranderingen in de mitochondriale functie op cellulair niveau en circadiane patronen bij oudere volwassenen te beoordelen. In het bijzonder wordt een real-time metabole fluxanalysator gebruikt om de mitochondriale bio-energetische functie van witte bloedcellen te beoordelen bij de beschikbaarheid van differentieel substraat.

De expressie van circadiane klokgenen in witte bloedcellen om te correleren met de mitochondriale bio-energetica en circadiane ritme-uitkomsten worden ook geanalyseerd. Er wordt aangenomen dat deze innovatieve methodologische benaderingen toekomstige klinische onderzoeken zullen helpen door minimaal invasieve methoden te bieden voor het bestuderen van mitochondriale substraatvoorkeur en circadiane ritmes bij oudere volwassenen.

Inleiding

Vooruitgang in de afgelopen eeuw heeft geleid tot een toename van de levensverwachting en de populatie van ouder wordende volwassenen. Kijkend naar de toekomst, zal het percentage volwassenen van 65 jaar en ouder naar verwachting met 5% toenemen tussen 2020 en 2050 in de Verenigde Staten1. Deze toename van de levensverwachting impliceert geen toename van de gezondheidsspanne - de levensperiode die gepaard gaat met zelfstandig functioneren. De realiteit is dat veroudering gepaard gaat met talloze biologische veranderingen die het cellulaire metabolisme en de fysiologie beïnvloeden, waardoor het cognitief en fysiek functioneren geleidelijk afneemt 2,3. Naarmate de levensverwachting van de mens blijft stijgen, is er een grotere behoefte om het functionele vermogen en de onafhankelijkheid op de leeftijd van4 jaar te behouden.

Het is al lang bekend dat de achteruitgang van het lichamelijk functioneren en de zelfstandigheid met de leeftijd multifactorieel is, hoewel het vaak wordt geassocieerd met het ontstaan van chronische ziekten en acute uitlokkende gebeurtenissen5. Omgekeerd is aangetoond dat deze achteruitgang in fysieke prestaties en spierkenmerken geassocieerd is met de ontwikkeling van invaliditeit op leeftijd zonder duidelijk verband met een enkele ziekte6. Met de moeilijkheden om de exacte etiologie van chronische ziekten en lichamelijke handicaps te kennen, wordt aangenomen dat stoornissen in de mitochondriale functie samenvallen met het ontstaan en de progressie van chronische ziekten en verlies van lichamelijk functioneren bij oudere volwassenen 7,8.

De mitochondriën leveren het grootste deel van het adenosinetrifosfaat (ATP), dat nodig is voor veel cellulaire processen9. Sterk oxidatieve weefsels zijn afhankelijk van mitochondriën voor een adequate energieproductie; bij veroudering nemen de oxidatieve capaciteit en de mitochondriale ATP-synthese af. Deze afname is gedeeltelijk te wijten aan oxidatieve schade aan mitochondriaal DNA (mtDNA), wat resulteert in een toenemende accumulatie van mtDNA-mutaties en deleties10. De accumulatie van mtDNA-mutaties en deleties veroorzaakt een afname van de vorming van functionele eiwitten in de elektronentransportketen, waardoor cellen minder goed in staat zijn om ATP te produceren. De leeftijdsgebonden achteruitgang van de mitochondriale functie is het meest opvallend in sterk oxidatieve weefsels, zoals het hart en de skeletspier11. Studies hebben aangetoond dat de mitochondriën van de gastrocnemius-spier in oudere rattenmonsters een vermindering van ongeveer 50% in ATP-productie en -inhoud vertonen in vergelijking met jongere monsters12. Bovendien is aangetoond dat de capaciteit van mitochondriale ATP-productie in de menselijke skeletspier met ongeveer 8% afneemt per decennium van het leven13. Deze bevindingen suggereren dat leeftijdsgebonden achteruitgang van de mitochondriale functie kan bijdragen aan een verminderde energieproductie in organismen.

Een belangrijke regulator van mitochondriale activiteit wordt verondersteld peroxisoomproliferator-geactiveerde receptor γ (PPARγ) coactivator-1 (PGC-1α)14 te zijn. Verslechtering van de PGC-1α-activiteit of een afname van de overvloed ervan leidt tot verminderde mitochondriale oxidatieve activiteit en bijgevolg tot verminderde energieproductie. Bovendien kan een afname van de mitochondriale kwaliteit de kwaliteit van de skeletspieren beïnvloeden en vervolgens leiden tot de ontwikkeling of verergering van sarcopenie, dynapenie en afname van de functionele capaciteit15,16. Bewijs voor de leeftijdsgebonden gelijktijdige achteruitgang van de mitochondriale functie en de kwaliteit van de skeletspieren suggereert een verband tussen mitochondriale stoornissen en de pathogenese van functionele achteruitgang17. Onlangs is dit bevestigd bij functionele thuiswonende oudere volwassenen, wat aantoont dat verlagingen van het metabolisme van de mitochondriën van de skeletspieren een afname van de mobiliteit in deze populatie voorspellen18. Hoewel het exacte mechanisme dat leidt tot mitochondriale achteruitgang met de leeftijd onduidelijk is, heeft recent bewijs een wederkerige wisselwerking tussen de circadiane klok en de mitochondriale functie benadrukt, met gevolgen voor het gebruik van mitochondriale brandstof en biogenese19.

Brandstofverbruik
De mitochondriale functie lijkt te worden beïnvloed door het brandstofmetabolisme en het type brandstof dat op cellulair niveau in skeletspierweefsel wordt gebruikt11. Tijdens perioden van brandstofuitputting, met name koolhydraatuitputting bij mensen, verandert de brandstofvoorkeur voor (mitochondriale) energieproductie. Bij lage glucosespiegels verschuift de brandstofvoorkeur van glucose naar vetzuren en van zuur afgeleide ketonlichamen. Deze metabolische omschakeling wordt gekenmerkt door de opregulatie van het lipidenmetabolisme in de adipocyten, gevolgd door een verhoogde afgifte van ketonen in het bloed4. De verschuiving in brandstofgebruik van glucose naar ketonen met een ketogeen dieet lijkt een gunstig effect te hebben op de productie van mitochondriale reactieve zuurstofsoorten, antioxidantafweer, ATP-synthese en biogenese20.

De metabolische omschakeling van koolhydraat- naar lipidenmetabolisme vindt plaats in perioden van lage beschikbaarheid van voedingsstoffen in het milieu en wanneer de glycogeenvoorraden zijn uitgeput. Wanneer deze omschakeling in gang wordt gezet, worden opgeslagen triglyceriden afgebroken tot glycerol, een substraat voor gluconeogenese, en vrije vetzuren, die naar de lever worden getransporteerd om via β-oxidatie te worden geoxideerd tot acetylco-enzym A (acetyl-CoA). Ketonlichamen worden gesynthetiseerd, voornamelijk in de lever, door een tweestaps condensatie van drie acetyl-CoA-moleculen tot β-hydroxy-β-methylglutaryl-CoA, die vervolgens verder worden verwerkt tot ketonlichamen, waaronder acetoacetaat en 3-βeta-hydroxybutyraat21. Deze ketonlichamen worden gedistribueerd naar weefsels door het hele lichaam, waarbij de hoogste consumptie plaatsvindt in het hart, de hersenen en de skeletspieren21. Bij het ouder worden wordt de oxidatie van mitochondriale vetzuren aangetast, waardoor de metabolische schakelaar22 wordt beïnvloed. Er is gesuggereerd dat stoornissen in het gebruik van mitochondriale brandstof leiden tot verdere mitochondriale disfunctie, wat op zijn beurt bijdraagt aan ouderdomsziekten en functionele achteruitgang23.

Veranderingen in het mitochondriale zuurstofverbruik van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) zijn bestudeerd om de patronen te beoordelen die verband houden met disfunctie en vascularisatie. Hartman et al. voerden een studie uit die tot doel had de correlatie tussen zuurstofverbruik en divers gemedieerde dilatatie te bepalen, wat een verband bleek te suggereren tussen mitochondriale disfunctie en disfunctie van vasculaire gladde spiercellen24. Wat andere organen betreft, zijn PBMC's gecorreleerd met een hogere cognitieve en hersenfunctie, zoals bepaald door respirometrie25. PBMC bio-energetica en ademhalingscapaciteit kunnen dus dienen als potentiële biomarkers voor het beoordelen van de functionele capaciteit van organen of weefsels door het hele lichaam.

Circadiaans ritme
Een andere belangrijke factor die de gezondheid van de mitochondriën beïnvloedt, is het circadiane ritme. Circadiane ritmes zijn ~24 uur oscillaties in gedrag en fysiologie die optreden bij afwezigheid van omgevingssignalen26. Deze ritmes werken op een voorspellende manier om de homeostase van het systeem en het weefsel te ondersteunen. Het mechanisme dat ten grondslag ligt aan circadiane ritmes is een transcriptie-translatie feedbacklus die de circadiane klok27 wordt genoemd. In de afgelopen 15 jaar is aangetoond dat het circadiane klokmechanisme in vrijwel alle cellen in het hele lichaam voorkomt28. Naast het bijhouden van de tijd, draagt het moleculaire klokmechanisme ook bij aan een dagelijks programma van genexpressie, aangeduid als circadiane klokoutput29. De klokoutputgenen zijn uniek voor elk weefseltype en zijn functioneel geassocieerd met routes die belangrijk zijn voor celmetabolisme, autofagie, herstel en homeostase. Recent bewijs heeft aangetoond dat de mitochondriale gezondheid afhankelijk is van de circadiane klokfunctie en de mitochondriale functie beïnvloedt, waaronder mitochondriale biogenese, brandstofgebruik en mitofagie30.

Opkomend bewijs in zowel preklinische als klinische studies heeft aangetoond dat er tijdens het ouder worden verstoringen zijn in het circadiane ritme31. Deze omvatten verstoringen in de normale slaap- en waakcycli, een verminderde amplitude in het ritme van de kerntemperatuur van het lichaam en een vertraagd vermogen om zich aan te passen aan verschuivingen in fase31. Eén studie daagde bijvoorbeeld het circadiane systeem van volwassen en oude (20+ maanden) muizen uit door het lichtschema met 6 uur te verschuiven. Het bleek dat de oude muizen er langer over deden om hun activiteitenpatroon opnieuw mee te voeren naar het nieuwe lichtschema32. In overeenstemming met de veranderingen in circadiaans gedrag, bleek uit analyse van de weefselklokken dat zowel de centrale als de perifere weefselklokken aangetast waren in het ouder wordende cohort.

Meer recentelijk hebben verschillende groepen transcriptomische analyse uitgevoerd van de circadiane klok en klokoutput in verschillende weefsels op de leeftijd van33 jaar. De resultaten van deze studies benadrukken dat er sprake is van grootschalige herprogrammering van de circadiane klokoutput met de leeftijd. Dit betekent dat, hoewel de kernklok een timingfunctie behoudt, de genen die gericht zijn op dagelijkse expressie grotendeels verschillend zijn. Twee studies hebben bijvoorbeeld elke 4 uur gedurende 24 uur spierbiopten van menselijke proefpersonen verzameld, waarbij de resultaten bepalen dat de piek en het dal van de klokgenexpressie worden omgekeerd tussen nachtelijke knaagdieren en dagactieve mensen 34,35,36. Dit geeft aan dat wanneer klokgenexpressie uitsluitend wordt vergeleken op basis van actieve versus rustfase (en niet licht versus donker), de patronen van klokgenexpressie in de spieren vrijwel hetzelfde zijn tussen soorten. Er wordt gesuggereerd dat deze leeftijdsgebonden verandering in klokoutput resulteert in stoornissen in de regulatie van routes die de bekende kenmerken van veroudering omvatten, zoals mitochondriale functie, DNA-schade en -herstel, en autofagie37.

Grondgedachte van de studie
Het verband tussen de mitochondriale functie en de achteruitgang van de fysieke functie is goed ingeburgerd. De onderliggende oorzaak van mitochondriale disfunctie blijft echter een onderwerp van discussie. Recent onderzoek suggereert dat het gebruik van cellulaire brandstof en circadiane ritmes een rol kunnen spelen in dit proces. Traditionele methoden voor het evalueren van de mitochondriale functie, zoals het meten van het mitochondriale zuurstofverbruik in een spierbiopsiemonster, worden vaak als pijnlijk en invasief ervaren, wat deelname kan ontmoedigen, vooral bij populaties met een lage spiermassa, zoals kwetsbare en sarcopene volwassenen38.

Gezien deze beperkingen is er behoefte aan een minder invasieve methode voor het beoordelen van veranderingen in het gebruik van cellulaire brandstof en het circadiane ritme bij oudere volwassenen. Deze studie heeft tot doel een nieuw, minimaal invasief protocol te evalueren dat kan worden gebruikt om het brandstofmetabolisme en het circadiane ritme in deze populatie te beoordelen. De resultaten van deze studie zullen bijdragen aan een beter begrip van leeftijdsgerelateerde veranderingen en de reactie op medische of gedragsinterventies, en als model dienen voor toekomstige studies op dit gebied.

Protocol

Procedures waarbij menselijke deelnemers betrokken zijn, zijn goedgekeurd door de ethische commissie voor onderzoek (Florida Ethics Policy 1.0104) en de Institutional Review Board van de Universiteit van Florida.

1. Mitochondriale functie

  1. Isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's)
    1. Verzamel PBMC's met behulp van speciale bloedafnamebuisjes van 8 ml (16 mm x 125 mm; met 0,1 M natriumcitraatanticoagulans of natriumheparine-anticoagulans) (zie materiaaltabel).
      OPMERKING: De bloedafnamebuisjes bevatten bloedscheidingsmedia die zijn samengesteld uit een thixotrope polyestergel en een gradiëntmedium (zie materiaaltabel) om de scheiding van witte bloedcellen te verbeteren.
    2. Verwerk de 8 ml celvoorbereidingsbuisjes binnen 2 uur na afname om haalbare resultaten te verkrijgen.
    3. Meng de bloedafnamebuisjes nadat u ze met bloed hebt gevuld (door zachte inversie of op een mixer) en bewaar ze maximaal 2 uur op kamertemperatuur (RT).
    4. Centrifugeer de bloedafnamebuisjes in een passende uitzwenkbare rotor bij 2.000 × g gedurende 15 minuten (of gelijk aan 30.000 G-min; niet meer dan 2.000 × g) bij RT.
      OPMERKING: Deze buizen zijn groter dan een gewone centrifugebuis van 15 ml; Daarom moet er extra aandacht worden besteed aan het gebruik van de juiste rotor.
    5. Zuig ~80% van de plasmalaag op en gooi deze weg in een container voor biologisch gevaarlijk afval, en verzamel de cellaag uit de bloedafnamebuis (met behulp van een transferpipet) in een centrifugebuis van 15 ml.
      OPMERKING: Bij gebruik van een tube van 15 ml, voeg dan 7 ml cellaag toe en vul tot 14 ml met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). De verhouding tussen cellen en PBS moet 1:1 zijn. Gebruik indien nodig meerdere tubes. Meng voorzichtig door om te keren.
    6. Centrifugeer in een uitzwenkbare rotor bij 900 × g gedurende 5 minuten (of gelijk aan 4.500 G-min) bij RT.
    7. Zonder de celpellet te verstoren, zuigt u de PBS-oplossing op en gooit u deze weg in een container voor biologisch gevaarlijk afval.
    8. Resuspendeer de celpellet in 1 ml basaal medium (BM; zie materiaaltabel) door voorzichtig te trituleren. Voeg de BM toe tot een totaal van 10 ml en meng voorzichtig door om te keren. Voer een celtelling uit.
    9. Centrifugeer de celsuspensie in een uitzwenkbare rotor bij 900 × g gedurende 5 minuten bij RT.
      OPMERKING: Wanneer cellen op dezelfde dag worden gebruikt voor de bio-energetische beoordeling, gaat u verder met stap 1.1.10; Als de cellen zijn ingevroren voor opslag, gaat u verder met stap 1.1.13.
    10. Bereken het volume van het analysemedium (AM; zie materiaaltabel) voor resuspensie van de volgende celpellet om de gewenste celconcentratie te bereiken.
      OPMERKING: Bijvoorbeeld, voor een zaaidichtheid van 150.000 cellen/putje in 50 μL, is de gewenste concentratie van de celsuspensie 3 miljoen cellen/ml.
    11. Zonder de celpellet te verstoren, zuigt u het bovenstaande op en gooit u het weg in een container voor biologisch gevaarlijk afval.
    12. Resuspendeer de celpellet voorzichtig in 1 ml of minder AM. Voeg AM toe aan het totale berekende volume voor de gewenste celconcentratie. De cellen zijn nu klaar om te worden uitgezaaid in een gecoate celkweekplaat (zie Materiaaltabel).
      OPMERKING: De volgende stappen zijn voor het invriezen van de cellen voor opslag (1.1.13-1.1.16) en zijn niet van toepassing op de procedure op dezelfde dag.
    13. Om cellen in te vriezen, zuigt u het bovenstaande op zonder de celpellet te verstoren en gooit u het weg in een container voor biologisch gevaarlijk afval.
    14. Resuspendeer de cellen voorzichtig in vriesmedia (zie Tabel met materialen) in de gewenste concentratie (5-10 miljoen cellen/ml). Aliquot gewenste volumes in gelabelde cryovials.
    15. Vries de celsuspensie langzaam in met behulp van een vriescontainer (zie materiaaltabel) gedurende minimaal 4 uur of een nacht bij -80 °C.
    16. Breng de cryovials na 4 uur, of de volgende ochtend, over naar de opslag van vloeibare stikstof, waar ze zich in de dampfase moeten bevinden.
    17. Smeer de dag voor de meting de putbodems van een microplaat van een celcultuur (zie Materiaaltabel) in met cellijm (zie Materiaaltabel). Bereid de lijm voor volgens de instructies van de fabrikant, met een aanbevolen concentratie van 22,4 μg/μL, door het juiste volume van de kleefstofoplossing te verdunnen in 0,1 M natriumbicarbonaat (pH 8,0). Breng 25 μL lijm aan op elk putje van de microplaat van de celcultuur.
    18. Hevel na 20 minuten de resterende vloeistof uit elke put over en was de putjes twee keer met 200 μL steriel, gezuiverd water. Laat de plaat drogen in de bioveiligheidskast (gedurende ~2 uur).
    19. Wikkel de plaat in aluminiumfolie of plaats hem in een gesloten secundaire container en bewaar hem in de koelkast bij 4 °C.
  2. Bio-energetische beoordeling van PBMC's met thereal-time metabole fluxanalysator
    OPMERKING: Met behulp van een fluxanalysator en de multi-mode lezer (zie Tabel met materialen), een optimale zaaidichtheid van 150.000 PBMC's per putje, een uiteindelijke uncoupler carbonylcyanide-4 (trifluormethoxy) fenylhydrazon (FCCP)-concentratie van 2 μM en een uiteindelijke Hoechst 33342-concentratie van 4 μM (met een incubatietijd van ten minste 20 minuten na injectie) werden bepaald.
    1. Om sensorcartridges met hydrobooster te hydrateren, verwijdert u de sensorcartridge met de gereedschapsplaat uit de doos en plaatst u de cartridge "sensor omhoog" op de bank. Pipetteer 200 μL kalibrant (zie Materiaaltabel) in elk putje van de nutsplaat en plaats de hydrobooster stevig op de nutsplaat, gevolgd door de sensorcartridge. Inspecteer en verwijder eventuele ingesloten luchtbellen en plaats deze een nacht in een CO2 -vrije broedmachine van 37 °C.
    2. Zet de fluxanalysator aan en open vervolgens de analysesoftware (zie materiaaltabel). Stel de temperatuur in op 37 °C. Laat het instrument een nacht aan staan om de ingestelde temperatuur te stabiliseren.
      OPMERKING: De volgende programmeerstappen (1.2.4-1.2.10) kunnen de dag voor of op de dag van het experiment worden uitgevoerd
    3. Om het bestand met de testanalysesoftware (zie Materiaaltabel) te programmeren, opent u de sjabloon voor de Substrate Oxidation Stress Test. Ga naar Groepsdefinities, open het tabblad Injectiestrategieën , bewerk de Inhibitor + Sub Ox Stress Test naar Etomoxir + Sub Ox Stress Test en voeg nog twee injectiestrategieën toe: UK5099 + Sub Ox Stress Test en BTPES + Sub Ox Stress Test. Klik binnen elke injectiestrategie in het venster Injectieconditie op A voor poort A en voer de uiteindelijke concentratie van de respectieve remmer in (Etomoxir: 4 μM; UK5099: 2 μM; BTPES: 3 μM).
    4. Klik op poorten B, C en D en voer de respectievelijke eindconcentraties in (poort B: oligomycineconcentratie [1,50 μM], poort C: FCCP [2,0 μM]; poort D: Rotenon + Antimycine A [0,5 μM]). Voeg Hoechst 33342, 4 μM toe aan het venster verbindingen voor poort D.
    5. Open het tabblad Voorbehandelingen en kies voorbehandelingen, indien van toepassing. Bijvoorbeeld: Controle, Experimenteel of gebruikelijk (bijv. Basislijn en Follow-up). Voeg indien nodig beschrijvingen toe in het venster eronder.
    6. Open het tabblad Assay Media en kies in het vervolgkeuzemenu Media RPMI Medium, pH 7,4, voer het lotnummer in, het personeel dat de media voorbereidt, het tijdstip van bereiding en de supplementen die aan de media zijn toegevoegd (10 mM glucose, 2 mM glutamine, 1 mM pyruvaat; zie Materiaaltabel).
    7. Open het tabblad Celtype en voer PBMC-onderwerp-ID in als naam, PBMC als celtype, 150000 als zaaidichtheid, onderwerp-ID als bron, personeel dat de cellen heeft voorbereid, datum van voorbereiding en dag van celontdooiing, indien van toepassing.
    8. Klik op Groepen genereren, ga naar Plaatkaart en wijs de putten van de plaat met 96 putjes toe aan de respectievelijke groepen. Houd putten A1, A12, H1 en H12 aangewezen als achtergrondputten.
    9. Ga naar Protocol, vink het vakje Equilibrate aan (standaardinstelling) en voer de volgende informatie in: Basislijn: vijf meetcycli: 3 minuten mixen, 0 minuten wachten en 3 minuten meten; Media of remmer (poort A): zes meetcycli: 3 minuten mixen, 0 minuten wachten en 3 minuten meten; Oligomycine (Port B): drie meetcycli: 3 minuten mixen, 0 minuten wachten en 3 minuten meten; FCCP (poort C): drie meetcycli: 3 minuten mixen, 0 minuten wachten en 3 minuten meten; Rotenon + Antimycine A + Hoechst 33342 (Port D): drie meetcycli: 3 minuten mixen, 0 minuten wachten en 3 minuten meten.
    10. Neem op de dag van de bio-energetische beoordeling de gecoate celcultuurmicroplaat uit de koelkast en laat deze opwarmen tot RT in de bioveiligheidskast.
    11. Bereid het analysemedium (AM) voor door 97 ml voorverwarmd BM en supplementen te mengen: 1 ml pyruvaat (eindconcentratie: 1 mM), 1 ml glucose (eindconcentratie 10 mM) en 1 ml glutamine (eindconcentratie: 2 mM). Plaats de AM bij 37 °C in een CO2 -vrije broedmachine tot gebruik.
    12. Om de cellen te zaaien, voegt u 50 μL celsuspensie (vanaf 1.1.12) met 150.000 PBMC's toe aan elk putje, behalve A1, H1, A12 en H12 (toegewezen als achtergrondputjes).
      KRITIEK: De optimale zaaidichtheid is al eerder bepaald.
    13. Bedek de celplaat met het deksel en laat 60 minuten celrust bij RT in de bioveiligheidskast om de gelijkmatige verdeling van de cellen te vergemakkelijken.
      KRITIEK: Bekijk de cellen onder een microscoop om de gewenste homogene celverdeling over de put te garanderen.
    14. Schakel voor celbeeldvorming de multi-mode lezer in (zie de materiaaltabel) een paar uur voor de eerste celincubatie; wacht tot het startprotocol van de lezer is voltooid voordat u de beeldvormingssoftware opent (zie de materiaaltabel). Open de beeldvormingssoftware en stel de voorverwarmtemperatuur in op 37 °C.
    15. Om de analysereagentia te bereiden, volgt u de instructies van de testkit om de reagentia te reconstitueren, met kleine wijzigingen zoals beschreven in tabel 1.
      KRITIEK: De optimale uiteindelijke FCCP- en Hoechst33342-concentraties zijn eerder bepaald.
    16. Inspecteer na de celrust van 60 minuten de putjes met een celkweekmicroscoop en noteer eventuele visuele afwijkingen, zoals celaggregaties.
    17. Centrifugeer de celkweekplaat bij RT in een centrifuge met een uitzwenkbare rotor voor microtiters bij 60 × g gedurende 1 minuut, met minimale versnelling en minimale onderbreking; Draai de plaat om en centrifugeer opnieuw op 40 × g gedurende 1 min. Stel de acceleratie en pauze in op een minimum. Incubeer de cellen gedurende 25-30 minuten bij 37 °C in eenco-2 incubator zonder CO 2.
      OPMERKING: Wanneer celbeeldvorming wordt uitgevoerd, wordt de celplaat in plaats daarvan geïncubeerd in de voorverwarmde multi-mode lezer (zie de materiaaltabel) en wordt er een helderveldbeeld gemaakt van elk putje tijdens deze incubatieperiode (eerste celincubatie).
    18. Scan de streepjescode van de celkweekplaat met de barcodescanner (zie Materiaaltabel), selecteer Brightfield-scan starten, plaats de celkweekplaat op de platenlade en start het intrekken van de lade. Selecteer cellen die putjes bevatten om te scannen en start de scan.
    19. Laad tijdens de eerste celincubatie de poorten van de sensorcartridge met de reagentia, zoals aangegeven in tabel 1: poort (A): 20 μL AM (controles), etomoxir (remmer van het transport van vetzuren met lange ketens naar de mitochondriën), UK 5099 (2-cyaan-3-(1-fenyl-1H-indol-3-yl)-2-propeenzuur; remmer van mitochondriale pyruvaatdrager), of BPTES (Bis-2-(5-fenylacetamido-1, 3,4-thiadiazol-2-yl)ethylsulfide; remmer van glutamineomzetting in glutamaat); poort (B): 22 μL oligomycine (remmer van ATP-synthase); poort (C): 25 μl FCCP (ontkoppelaar carbonylcyanide-4 (trifluormethoxy) fenylhydrazon); poort (D): 27 μl rotenon/antimycine A/Hoechst 33342 (remmers van respectievelijk mitochondriaal complex I en III en nucleaire kleurstof). Plaats de sensorcartridge nog 5 minuten terug in de CO2 -vrije broedstoof van 37 °C.
      OPMERKING: Volg de instructies van de fabrikant voor het laden van de poort.
    20. Haal de celkweekplaat uit de incubator of plaatlezer na de eerste celincubatie en nadat de celbeeldvorming is voltooid (indien van toepassing), en voeg warme AM toe aan elk putje tot een eindvolume van 180 μL per putje. Plaats de celplaat nog 15-25 minuten bij 37 °C in een CO2 -vrije incubator (tweede celincubatie).
    21. Start de metabole test door de sensorkalibratie te starten tijdens de tweede celincubatie. Klik op Test uitvoeren wanneer de test klaar is om te worden gestart met de kalibratie van de sensorcartridge. Breng desgevraagd de sensorcartridge van de 37 °C CO2 -incubator over naar de fluxanalysatorbak en start de kalibratie. Volg de aanwijzingen van de testanalysesoftware en vervang de gebruiksplaat voor de celplaat nadat de kalibratie is voltooid.
      OPMERKING: De kalibratie duurt ongeveer 20 minuten.
    22. Volg na de metabole test de softwareprompt en verwijder de sensorcartridge en celplaat van het instrument. Verwijder de sensorcartridge van de celplaat en dek de celplaat af met het deksel.
    23. Nadat de incubatietijd van de Hoechst-kleurstof in voorbereidende experimenten is bepaald, scant u de barcode van de plaat en volgt u de aanwijzingen van de software om met de multi-mode lezer een fluorescerend beeld te krijgen van elke celbevattende put.
      OPMERKING: De beeldvormings- en analysesoftware is gekoppeld, waardoor de gegevens van het aantal cellen kunnen worden geïmporteerd in het gegevensbestand van de testanalyse voor gegevensnormalisatie naar het aantal cellen.

2. Genexpressie van de circadiane klok

OPMERKING: De expressie van klokgenen van PBMC's door deelnemers zal worden beoordeeld door RNA te isoleren met behulp van de RNA-bloedkit (zie materiaaltabel).

  1. Zuig 3 ml bloed van de deelnemer rechtstreeks in een RNA-buisje (zie materiaaltabel) met 6 ml stabiliserende reagentia. Vortex gedurende 10 s om volledig te mengen.
    OPMERKING: Als stabiliserende reagentia niet grondig worden gemengd met het bloedmonster van de deelnemer, is er een verhoogd risico op studiefouten.
  2. Breng 1,0 ml van het gestabiliseerde bloedmonster over in een buisje van 15 ml, met 5 ml erytrocytenlysisbuffer. Incubeer 10-15 minuten op ijs. Vortex de buis 2x tijdens de incubatie. Centrifugeer de buis gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 400 × g .
  3. Identificeer de pellet en giet voorzichtig het bovenstaande met gelyseerde rode bloedcellen af. Voeg 2 ml erytrocytenlysisbuffer toe (zie Materiaaltabel), suspendeer de cellen, draai kort en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 400 × g bij 4 °C.
  4. Giet het bovenstaande af en laat de tube 1-2 minuten omgekeerd op absorberend papier staan. Dep alle vloeistof rond de rand van de tube af met schoon papier voor de volgende stap.
  5. Voeg voorzichtig 600 μL RNA-lysisbuffer toe (zie Materiaaltabel). Volgens het protocol van de fabrikant β-mercaptoethanol toevoegen en de pellet opnieuw suspenderen.
  6. Pipetteer het lysaat rechtstreeks in een wegwerpbare cel-lysaathomogenisator (zie Materiaaltabel), draaikolom die in een verzamelbuis van 2 ml is geplaatst en centrifugeer gedurende 2 minuten op maximale snelheid om te homogeniseren. Gooi de spinkolom van de wegwerpcel-lysaathomogenisator weg en bewaar het gehomogeniseerde lysaat.
  7. Voeg 1 volume (600 μL) 70% ethanol toe aan het gehomogeniseerde lysaat en meng door te pipetteren. Pipetteer het monster, inclusief eventueel gevormd neerslag, voorzichtig in een nieuwe centrifugekolom in een opvangbuis van 2 ml, maar bevochtig de rand niet. Centrifugeer gedurende 15 s bij >8.000 × g.
  8. Breng de centrifugekolom (zie materiaaltabel) over in een nieuwe opvangbuis van 2 ml. Breng 700 μL strenge wasbuffer (zie Materiaaltabel) aan op de centrifugekolom en centrifugeer gedurende 15 s op >8.000 × g om te wassen. Gooi de doorstroom weg.
  9. Open voorzichtig de centrifugekolom en voeg 500 μL milde wasbuffer toe (zie Materiaaltabel). Sluit de dop en centrifugeer op volle snelheid (20.000 × g) gedurende 3 min.
  10. Breng de centrifugekolom over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en pipetteer 30-50 μl RNasevrij water rechtstreeks op het silicamembraan. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij >8.000 × g om het RNA te elueren. Herhaal nog een keer.
    OPMERKING: Het RNA kan worden bewaard bij -80 °C.
  11. Voer DNase-behandeling uit op een kolom met behulp van de RNase-vrije DNase-set (zie materiaaltabel), volgens het protocol van de fabrikant.
  12. Genereer cDNA met behulp van 500 ng totaal RNA en een real-time polymerasekettingreactie (PCR)-systeem (zie Materiaaltabel), volgens het protocol van de fabrikant. Verdun alle cDNA-monsters 1:25 in RNase-vrij water en gebruik 4 ml om kwantitatieve reverse transcriptie PCR (qRT-PCR) uit te voeren.
  13. Gebruik een methode voor het toevoegen van primers (zie materiaaltabel) om qRT-PCR te voltooien met 10 mM van elk van de primers die in tabel 2 worden weergegeven. Voltooi qRT-PCR met behulp van een real-time systeem (zie materiaaltabel).
  14. Normaliseer de mRNA-niveaus van de gekozen genen met behulp van Rpl26-mRNA-niveaus . Gebruik de 2-DDCt-methode om de relatieve kwantificering te berekenen.
  15. Om te bepalen of de expressie van een bepaald mRNA een circadiane oscillatie vertoonde, gebruikt u een LR_rhythmicity39 waarschijnlijkheidsgebaseerde test (met behulp van p≤ 0,01) voor het detecteren van circadiane ritmiek in één experimentele conditie40.

3. Plan voor gegevensanalyse

OPMERKING: Een medische inventarisatie zal worden gebruikt om deelnemers te categoriseren op basis van medicatiegebruik43.

  1. Gebruik een lineair model met gemengde effecten, waarin leeftijd, geslacht, gewicht, lengte, bloeddruk, hartslag en andere risicofactoren als covariabelen moeten worden opgenomen.
  2. Er moet een term met een willekeurig effect worden opgenomen om de correlatie tussen gegevens binnen de proefpersoon te verklaren.
  3. Voor modelaanpassing moet een achterwaartse variabele selectie met het hiërarchische principe worden geïmplementeerd.
  4. Meet vanaf het aangepaste model de veranderingen van tijdstip 1 tot tijdstip 2, gegeven alle covariabelen in het aangepaste model.

Resultaten

Het voorgestelde protocol bevat voorlopige gegevens die dienen als validatie voor de methodologie. Het protocol bevat een real-time metabole fluxanalysator om de mitochondriale functie en het cellulaire brandstofgebruik te onderzoeken, en RNA-extractie en qRT-PCR om circadiane ritmegenen te analyseren (bijv. BMAL1, CLOCK, Nfil2, Nr1d1, Dbp, Cry1, Per2).

Het zuurstofverbruik (OCR) van geïsoleerde menselijke PBMC's van vijf controledeelnemers, 10 dagen na een eerste analyse, wordt weergegeven in figuur 1. De gegevens worden gebruikt om pre- en post-waarden te vergelijken en tonen de gemiddelde waarden voor basale ademhaling, acute respons, maximale ademhaling en reservecapaciteit na injectie van een controle, etomoxir, UK5099 en BPTES. Met name figuur 1C toont een significante negatieve acute respons na de etomovir-injectie, maar er werden geen significante effecten waargenomen voor de basale ademhaling, maximale ademhaling of reservecapaciteit.

figure-results-1
Figuur 1: Zuurstofverbruik van geïsoleerde menselijke perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's). (A) Real-time zuurstofverbruik (OCR; pmol/(min∙150.000 cellen) van PBMC's geïsoleerd uit een controlepersoon, gemeten met een fluxanalysator en beoordeeld met de substraatoxidatietest. Cellen werden gezaaid met een dichtheid van 150.000 cellen/putje. De eerste injectie was media (controle) of remmer (etomoxir, UK5099 of BPTES; zie tekst voor details) en vond plaats na het meten van de basale cellulaire ademhalingsfrequentie. De acute respons op de beperking van het mitochondriaal substraat werd bepaald als het verschil in basale OCR voor en na injectie met remmers. Oligomycine, de ATP-synthaseremmer, remt de ATP-productie gekoppelde ademhaling en zorgt voor protonlekademhaling. FCCP, de ontkoppeling, induceert maximale, ontkoppelde ademhaling; rotenon en antimycine A (remmers van respectievelijk complex I en III) remmen alle behalve niet-mitochondriale ademhaling (zie tekst voor details). (B-E) Kwantificering van cellulaire ademhaling (n = 5; gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD). (B) Basale OCR vóór injectie met de remmer, (C) acute respons op de remmer (verandering in OCR ten opzichte van de basaalstand vóór injectie met de remmer), (D) maximale OCR en (E) reservecapaciteit (verschil tussen maximale OCR en basale OCR na de eerste injectie). De acute respons (C) op injectie met etomoxir zou kunnen wijzen op een grotere afhankelijkheid van OCR van vetzuren als energiesubstraat onder basale omstandigheden in vergelijking met de andere substraatgroepen, zonder een merkbaar effect op OCR tijdens een hoge energievraag (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

VerbindingAM (μL) toegevoegd aan verbindingVoorraad (μM)voorraad (μL) voor werkmateriaalAM (μL) voor werkmateriaalWerkmaterieel (μM)Werkvoorraad (μL) [port]Finale conc. (μM)
Etomoxir70016050015004020 [EEN]4
Verenigd Koninkrijk50997008050015002020 [EEN]2
TEGEN70012050015003020 [EEN]3
Oligo42015030027001522 [B]1.5
FCCP72010060024002025 [C]2
Rot/AA/H540503002700527 [D]0.5

Tabel 1: Bereiding van de reagentia voor de oxidatietest van het substraat en concentraties van voedings-, werk- en eindoplossingen. Alle reagentia maken deel uit van de celmito-stresstest of de substraatoxidatie-stresstestkits. Afkortingen: oligo = oligomycine; FCCP = ontkoppelaar carbonylcyanide-4 (trifluormethoxy) fenylhydrazon; Rot/AA/H = rotenon/antimycine A/Hoechst 33342. Etomoxir, UK5099, BTPES: remmers van respectievelijk vetzuur-, glucose- en glutamine-oxidatie.

Bmal1 zei:Vooruit – GCACGACGTTCTTTCTTCTGT
Omgekeerd – GCAGAAGCTTTTTCGATCTGCTTTT
KlokVooruit – CGTCTCAGACCCTTCCTCAAC
Achterzijde – GTAAATGCTGCCTGGGTGGA
Huilen 1Vooruit – ACTGCTATTGCCCTGTTGGT
Keerzijde – GACAGGCAAATAACGCCTGA
Per 1Vooruit – ATTCGGGTTACGAAGCTCCC
Achteruit – GGCAGCCCTTTCATCCACAT
Per2Vooruit – CATGTGCAGTGGAGCAGATTC
Achteruit – GGGGTGGTAGCGGATTTCAT
Rev-erb αVooruit – ACAGATGTCAGCAATGTCGC
Achterzijde – CGACCAAACCGAACAGCATC

Tabel 2: Circadiane klokgenprimers.

Discussie

De achteruitgang van de mitochondriale functie en de regulatie van het circadiane ritme met de leeftijd worden steeds meer gezien als factoren die bijdragen aan ouderdomsziekten. Het veranderen van circadiane ritmes door aanpassingen van levensstijl, zoals voeding en lichaamsbeweging, vertegenwoordigt een mogelijke strategie om gezond ouder worden te bevorderen en de afname van de mobiliteit die gepaard gaat met veroudering te verminderen. De huidige methoden voor het direct evalueren van de mitochondriale functie zijn echter invasief en vereisen vaak een spierbiopsie, wat uitdagingen kan opleveren bij het werven en behouden van deelnemers vanwege waargenomen pijn en risico's.

Het beoordelen van markers van circadiane en metabole gezondheid door middel van minder invasieve methoden, zoals bloedafname, zou waardevolle resultaten opleveren voor het verkennen en testen van therapeutische doelen in toekomstige studies. Deze minimaal invasieve methoden hebben het potentieel om het veld enorm vooruit te helpen door nieuwe inzichten te verschaffen in de complexe wisselwerking tussen circadiaans ritme en metabole gezondheid en hun impact op de functie. Het doel van deze studie is het evalueren van de relatie tussen het cellulaire energiemetabolisme en het circadiane ritme. In het bijzonder wordt bio-energetische fluxanalyse gebruikt om de mitochondriale functie te evalueren onder verschillende voorwaarden voor de beschikbaarheid van substraat, samen met genexpressiemonitoring van een groep circadiane genen in de witte bloedcellen van de deelnemers. Door gebruik te maken van beide takken van de analyse, bio-energetisch en genexpressie, kan een uitgebreid begrip van de relatie tussen deze twee fundamentele processen worden bereikt.

De statistische analyse van deze tijdreeksgegevens vanuit een circadiaans perspectief biedt inzicht in de sterkte, het bereik en de timing van de circadiane ritmes. Concluderend kan worden gesteld dat de integratie van genexpressieanalyse, cellulaire bio-energetica en metabolische maatregelen op organismeniveau een nieuwe en innovatieve benadering vormt die licht zal werpen op de wisselwerking tussen energiemetabolisme en circadiane ritmes bij mensen.

In een pilotstudie ontdekten we een acute respons in de OCR van PBMC's op de beperking van het vetzuurgebruik (na injectie van etomoxir, een remmer van carnitine palmitoyltransferase 1a). Deze bevinding suggereert dat er in PBMC's van deze specifieke groep deelnemers een afhankelijkheid kan zijn van vetzuren als energiesubstraat tijdens basale ademhaling. De maximale ademhaling werd echter niet beïnvloed, wat suggereert dat alternatieve energiebronnen, zoals glucose en glutamine, het verminderde gebruik van vetzuren tijdens een hoge energievraag kunnen compenseren. Toekomstige studies moeten onderzoeken of a) de bio-energetica van PBMC's een afspiegeling is van de energetica van het hele lichaam en b) of interventies zoals tijdgebonden eten de voorkeuren van energiesubstraten kunnen beïnvloeden.

Er zijn verschillende cruciale stappen met betrekking tot de fluxanalyse van PBMC's. Ten eerste, voordat experimentele monsters worden beoordeeld, moet de celzaaidichtheid (cellen per putje) worden geoptimaliseerd door ervoor te zorgen dat er een continue uniforme verdeling van cellen is in elk putje en over elke plaat, de uiteindelijke FCCP-concentratie moet worden geoptimaliseerd door concentratietests uit te voeren met de concentraties 0, 0,125, 0,25, 0,5, 1,0 en 2,0 μM, en, indien van toepassing, moet de Hoechst 33342-kleuring worden geoptimaliseerd door de instructies van de fabrikant te volgen. Ten tweede is de normalisatie van de metabolische gegevens naar cellulaire parameters van cruciaal belang voor de vergelijkbaarheid van de gegevens tussen experimenten. In het huidige protocol wordt het celgetal beschreven na afloop van de fluxanalysatortest met behulp van Hoechst 33342-gekleurde cellen en een celbeeldvormingsapparaat. Als er geen geschikt apparaat beschikbaar is, kunnen alternatieve normalisatiemethoden worden toegepast, zoals het totale cellulaire eiwit of het nucleaire DNA-gehalte per putje. Er is een opgemerkte wijziging die binnen het protocol kan worden gebruikt in vergelijking met de voorgestelde wijzigingen. In het bijzonder kan het protocol worden voltooid met behulp van een individuele testkit voor elk van de drie remmers, vergeleken met alleen de twee kits die hier worden voorgesteld (zie materiaaltabel).

Het gebruik van PBMC's als surrogaat om de wisselwerking tussen energiemetabolisme en circadiane ritmes bij oudere volwassenen te bestuderen, wordt beperkt door de veronderstelling dat hun respons op de behandeling de respons in andere weefsels en organen nauwkeurig kan weerspiegelen. Hoewel deze benadering nieuw en minimaal invasief is, is het belangrijk om te erkennen dat verschillende weefsels en organen, zoals de hersenen, lever en skeletspieren, onder verschillende omstandigheden anders kunnen reageren. Een preklinische studie toonde aan dat de genexpressie van de klok veranderde bij gevoede en nuchtere muizen, wat leidde tot de gedeeltelijke opregulatie van BMAL1-doelwitgenen in lever- en spierweefsel, maar de downregulatie van andere41. Deze perifere weefsels en organen zijn zeer representatief voor metabolische processen en kunnen worden beïnvloed door omgevingsfactoren die van invloed zijn op de genexpressiemechanismen van de klok42. Verder onderzoek is nodig om de relatie tussen perifere weefsels, organen en de centrale circadiane klok volledig te begrijpen.

Een andere beperking is dat deelnemers niet worden gediskwalificeerd voor het nemen van een recept, wat beperkingen kan opleveren voor statistische analyse. Om deze beperking tegen te gaan, zal in toekomstig onderzoek een medische inventarisatie worden gebruikt, die is gevalideerd bij populaties van oudere volwassenen die medicijnen gebruiken43. Deelnemers worden gecategoriseerd op basis van de aanbevolen medicijnen die zijn vastgelegd in de gegevensbeoordelingssectie van het protocol. Er zijn in totaal drie categorieën, in termen van medicijnen waarvan is aangetoond dat ze 1) functionele achteruitgang versnellen, 2) functionele achteruitgang vertragen en 3) de skeletspierfunctie beïnvloeden.

Ten slotte vertoont de mitochondriale oxidatieve capaciteit van de menselijke skeletspieren een dag-nachtritme, met een piek tussen 18.00 uur en 23.00 uur en afnemend tussen 08.00 uur en 11.00 uur44. Het is nog niet duidelijk of dit geldt voor het mitochondriale oxidatieve vermogen van PBMC's. Voorlopige gegevens suggereren echter dat PBMC's en mitochondriaal metabolisme verwant zijn45. Aangezien de informatie over spierbiopten en de veranderingen in PBMC's niet zo duidelijk is, moet voorzichtigheid worden betracht bij het analyseren van de resultaten. Gezien deze beperking is het belangrijk om deze informatie in gedachten te houden bij het evalueren en ontwikkelen van een protocol, omdat het waardevolle context en inzichten kan bieden die kunnen helpen bij het waarborgen van de validiteit en effectiviteit van het protocol.

Voor zover wij weten, zijn er geen eerdere studies die de patronen van brandstofgebruik of circadiane ritmes hebben beoordeeld door middel van de methoden die in dit project worden voorgesteld. Ons doel is om de responsiviteit van markers van mitochondriaal brandstofgebruik en circadiane gezondheid op veranderingen te onderzoeken. Deze studie presenteert een minimaal invasieve methode voor het meten van een zeer gevoelige biomarker, die als alternatief kan dienen in toekomstige interventionele studies waar spierbiopsie niet haalbaar is.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd gefinancierd door het Older American's Independence Center (NIH/NIA P30AG028740), met hulp van het Clinical and Translational Science Institute (NIH/NCRR UL1TR000064).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agilent Technologies Cell Imaging Agilent TechnologiesCell image software
Agilent/Seahorse Wave desktop programAgilent Technologies5994-0039ENSoftware used to analyse data from the celluar analyser and stress test assay
Agilent/Seahorse XFe96 Flux AnalyzerAgilent TechnologiesS7800BReal-time cellular flux analyzer; flux analyser 
Bar Code ReaderAgilent TechnologiesG2615-90007
Seahorse Wave Desktop SoftwareAgilent technologiesData acquisition software; assay analysis; wave program 
Seahorse XF 1.0 M Glucose solutionAgilent Technologies103577-100Supplement to basal medium to make assay medium
Seahorse XF 100 mM Pyruvate solutionAgilent Technologies103578-100Supplement to basal medium to make assay medium
Seahorse XF 200 mM Glutamine solutionAgilent Technologies103579-100Supplement to basal medium to make assay medium
Seahorse XF Cell Mito Stress TestAgilent Technologies103015-100Mitochondrial bioenergetic function assay
Seahorse XF Mito Fuel Flex Test Agilent Technologies103260-100Mitochondrial bioenergetic function assay
Seahorse XF RPMI MediumAgilent Technologies103576-100Basal medium for PBMCs
Seahorse XFe96 FluxPak miniAgilent Technologies102601-100Sensor cartridges and cell culture microplates
Cytation 1 Cell Imaging Multi-Mode Reader Agilent/BioTekMultimode reader to image cells
CPT Sodium Heparin Tube, 16 x 125 mm x 8.0 mLBecton Dickinson362753Blood collection tubes for isolation of peripheral blood mononuclear cells
CellTak Cell and Tissue AdhesiveCorning354240Cell adherent to coat cell culture microplate
Phosphate Buffered Saline Corning21-040-CVBuffer to wash blood cells
Ficoll Paque PlusCytivaGE17-1440-02Gradient medium
Lunar Prodigy DXA scannerGeneral ElectricEN 60601-2-7 5.1Whole body lean mass and fat/lean tissue mass ratio
Freezing container, Nalgene Mr. FrostyMilliporeSigmaC1562Freezing container used to slow-freeze cell suspension
Buffer EL.Qiagen79217Erythrocyte lysis buffer
Buffer RLTQiagen79216RNA lysis buffer
Buffer RPEQiagen1018013Mild washing buffer
Buffer RW1 Qiagen1053394Stringent washing buffer
QIAamp DNA Micro KitQiagen56304DNA preps: QIAamp MinElute Columns, Proteinase K, Carrier RNA, Buffers, Collection Tubes (2 ml)
QIAamp RNA Blood Mini KitQiagen52304RNA blood kit; Used to isolate RNA
QIAshredderQiagen79656disposable cell-lysate homogenizers
RNase-Free DNase SetQiagen79254Used to perform DNA digest
2-Mercaptoethanol (Reagent)Thermo Fisher ScientificMFCD00004890
2-mL collection tubes, 100 countThermo Fisher ScientificAM12480
Fast SYBR Green Master MixThermo Fisher Scientific4385612Primers are added to this and used to carry out qRT-PCR 
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mLThermo Fisher Scientific69715Used to hold RNA purification filter during RNA purification
Narrow p1000 pipette tipsThermo Fisher Scientific02-707-402
QuantStudio 3 Real-Time PCR System, MiniAmp Plus Thermal Cycler, and 96-Well Plates PackageThermo Fisher ScientificA40393
Tempus Blood RNA TubeThermo Fisher Scientific4342792RNA Tube
Tempus Spin RNA Isolation kitThermo Fisher Scientific4380204RNA extraction and isolation

Referenties

  1. UN Department of Economic and Social Affairs. Population Division 2019, World Population Prospects. UN Department of Economic and Social Affairs. , (2019).
  2. Anton, S., Leeuwenburgh, C. Fasting or caloric restriction for healthy aging. Experimental Gerontology. 48 (10), 1003-1005 (2013).
  3. Dziechciaż, M., Filip, R. Biological psychological and social determinants of old age: Bio-psycho-social aspects of human aging. Annals of Agricultural and Environmental Medicine. 21 (4), 835-838 (2014).
  4. Anton, S. D., et al. Flipping the metabolic switch: understanding and applying the health benefits of fasting. Obesity. 26 (2), 254-268 (2018).
  5. Fried, L. P., Guralnik, J. M. Disability in older adults: evidence regarding significance, etiology, and risk. Journal of the American Geriatrics Society. 45 (1), 92-100 (1997).
  6. Manini, T. Development of physical disability in older adults. Current Aging Science. 4 (3), 184-191 (2011).
  7. Chung, H. Y., et al. Molecular inflammation: underpinnings of aging and age-related diseases. Ageing Research Reviews. 8 (1), 18-30 (2009).
  8. Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The mitochondrial basis of aging. Molecular Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
  9. Tarasov, A. I., Griffiths, E. J., Rutter, G. A. Regulation of ATP production by mitochondrial Ca2. Cell Calcium. 52 (1), 28-35 (2012).
  10. Chistiakov, D. A., Sobenin, I. A., Revin, V. V., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Mitochondrial aging and age-related dysfunction of mitochondria. Biomed Research International. 2014, 238463(2014).
  11. Boengler, K., Kosiol, M., Mayr, M., Schulz, R., Rohrbach, S. Mitochondria and ageing: role in heart, skeletal muscle and adipose tissue. Journal of Cachexia, Sarcopenia, and Muscle. 8 (3), 349-369 (2017).
  12. Drew, B., et al. Effects of aging and caloric restriction on mitochondrial energy production in gastrocnemius muscle and heart. American Journal of Physiology Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 284 (2), R474-R480 (2003).
  13. Short, K. R., et al. Decline in skeletal muscle mitochondrial function with aging in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (15), 5618-5623 (2005).
  14. Musci, R. V., Hamilton, K. L., Miller, B. F. Targeting mitochondrial function and proteostasis to mitigate dynapenia. European Journal of Applied Physiology. 118 (1), 1-9 (2018).
  15. Picca, A., et al. Targeting mitochondrial quality control for treating sarcopenia: lessons from physical exercise. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 23 (2), 153-160 (2019).
  16. Fernandez-Marcos, P. J., Auwerx, J. Regulation of PGC-1α, a nodal regulator of mitochondrial biogenesis. The American Journal of Clinical Nutrition. 93 (4), 884-890 (2011).
  17. Kim, Y., Triolo, M., Hood, D. A. Impact of aging and exercise on mitochondrial quality control in skeletal muscle. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 3165396(2017).
  18. Wang, H., Hiatt, W. R., Barstow, T. J., Brass, E. P. Relationships between muscle mitochondrial DNA content, mitochondrial enzyme activity and oxidative capacity in man: alterations with disease. European Journal of Applied Physiology and Occupational Physiology. 80 (1), 22-27 (1999).
  19. Tian, Q., et al. Muscle mitochondrial energetics predicts mobility decline in well-functioning older adults: The baltimore longitudinal study of aging. Aging Cell. 21 (2), e13552(2022).
  20. Sardon Puig, L., Valera-Alberni, M., Cantó, C., Pillon, N. J. Circadian rhythms and mitochondria: connecting the dots. Frontiers in Genetics. 9, 452(2018).
  21. Gano, L. B., Patel, M., Rho, J. M. Ketogenic diets, mitochondria, and neurological diseases. Journal of Lipid Research. 55 (11), 2211-2228 (2014).
  22. Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure. Cell Metabolism. 17 (4), 491-506 (2013).
  23. Lesnefsky, E. J., Chen, Q., Hoppel, C. L. Mitochondrial metabolism in aging heart. Circulation Research. 118 (10), 1593-1611 (2016).
  24. Hartman, M. L., et al. Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus. Vascular Medicine. 19 (1), 67-74 (2014).
  25. Mahapatra, G., et al. Blood-based bioenergetic profiling is related to differences in brain morphology in African Americans with Type 2 diabetes. Clinical Science. 132 (23), 2509-2518 (2018).
  26. Moore-Ede, M. C. Physiology of the circadian timing system: predictive versus reactive homeostasis. The American Journal of Physiology. 250 (5), R737-R752 (1986).
  27. Young, M. W. Life's 24-hour clock: molecular control of circadian rhythms in animal cells. Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 601-606 (2000).
  28. Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (15), 5339-5346 (2004).
  29. Zhang, R., Lahens, N. F., Ballance, H. I., Hughes, M. E., Hogenesch, J. B. A circadian gene expression atlas in mammals: implications for biology and medicine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16219-16224 (2014).
  30. de Goede, P., Wefers, J., Brombacher, E. C., Schrauwen, P., Kalsbeek, A. Circadian rhythms in mitochondrial respiration. Journal of Molecular Endocrinology. 60 (3), R115-R130 (2018).
  31. Hood, S., Amir, S. The aging clock: circadian rhythms and later life. The Journal of Clinical Investigation. 127 (2), 437-446 (2017).
  32. Sellix, M. T., et al. Aging differentially affects the re-entrainment response of central and peripheral circadian oscillators. The Journal of Neuroscience. 32 (46), 16193-16202 (2012).
  33. Sato, S., et al. Circadian reprogramming in the liver identifies metabolic pathways of aging. Cell. 170 (4), 664-677 (2017).
  34. Lundell, L. S., et al. et al. feeding alters lipid and amino acid metabolite rhythmicity without perturbing clock gene expression. Nature Communications. 11 (1), 4643(2020).
  35. Perrin, L., et al. Transcriptomic analyses reveal rhythmic and CLOCK-driven pathways in human skeletal muscle. eLife. 7, e34114(2018).
  36. Gutierrez-Monreal, M. A., Harmsen, J. -F., Schrauwen, P., Esser, K. A. Ticking for metabolic health: the skeletal-muscle clocks. Obesity. 28, S46-S54 (2020).
  37. Wolff, C. A., et al. Defining the age-dependent and tissue-specific circadian transcriptome in male mice. bioRxiv. 42 (1), 111982(2023).
  38. Wilson, D., Breen, L., Lord, J. M., Sapey, E. The challenges of muscle biopsy in a community based geriatric population. BMC Research Notes. 11 (1), 830(2018).
  39. Ding, H., et al. Likelihood-based tests for detecting circadian rhythmicity and differential circadian patterns in transcriptomic applications. Briefings in Bioinformatics. 22 (6), 224(2021).
  40. Ding, Z., Lamb, T. M., Boukhris, A., Porter, R., Bell-Pedersen, D. Circadian clock control of translation initiation factor eIF2α activity requires eIF2γ-dependent recruitment of rhythmic PPP-1 phosphatase in Neurospora crassa. mBio. 12 (3), e00871(2021).
  41. Di Francesco, A., Di Germanio, C., Bernier, M., de Cabo, R. A time to fast. Science. 362 (6416), 770-775 (2018).
  42. Kalfalah, F., et al. Crosstalk of clock gene expression and autophagy in aging. Aging. 8 (9), 1876-1895 (2016).
  43. Psaty, B. M., et al. Assessing the use of medications in the elderly: methods and initial experience in the cardiovascular health study. Journal of Clinical Epidemiology. 45 (6), 683-692 (1992).
  44. van Moorsel, D., et al. Demonstration of a day-night rhythm in human skeletal muscle oxidative capacity. Molecular Metabolism. 5 (8), 635-645 (2016).
  45. Janssen, J. J. E., et al. Extracellular flux analyses reveal differences in mitochondrial PBMC metabolism between high-fit and low-fit females. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 322 (2), E141-E153 (2022).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Mitochondri le functiemetabolische fluxanalysewitte bloedcellenbio energetische functiecircadiane klokgenensubstraatvoorkeur
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.