Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Driedimensionale kweek van gevasculariseerd thermogeen vetweefsel uit microvasculaire fragmenten

2.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64650

⸱

3 februari 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, 2Department of Biomedical Engineering and Chemical Engineering, University of Texas at San Antonio, 3Institute of Regenerative Medicine, University of Texas at San Antonio

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol dat het gebruik van microvasculaire fragmenten geïsoleerd uit knaagdier- of menselijk vetweefsel schetst als een eenvoudige benadering om functioneel, gevasculariseerd beige vetweefsel te engineeren.

Samenvatting

Engineering thermogeen vetweefsel (bijv. Beige of bruine vetweefsels) is onderzocht als een potentiële therapie voor metabole ziekten of voor het ontwerp van gepersonaliseerde microtissues voor gezondheidsscreening en medicijntests. De huidige strategieën zijn vaak vrij complex en slagen er niet in om de meercellige en functionele eigenschappen van thermogeen vetweefsel volledig weer te geven. Microvasculaire fragmenten, kleine intacte microvessels bestaande uit arteriol, venulen en haarvaten geïsoleerd uit vetweefsel, dienen als een enkele autologe bron van cellen die vascularisatie en vetweefselvorming mogelijk maken. Dit artikel beschrijft methoden voor het optimaliseren van kweekomstandigheden om het genereren van driedimensionale, gevasculariseerde en functionele thermogene vetweefsels uit microvasculaire fragmenten mogelijk te maken, inclusief protocollen voor het isoleren van microvasculaire fragmenten uit vetweefsel en kweekomstandigheden. Daarnaast worden best practices besproken, evenals technieken voor het karakteriseren van de gemanipuleerde weefsels, en monsterresultaten van zowel knaagdier als menselijke microvasculaire fragmenten worden verstrekt. Deze aanpak heeft het potentieel om te worden gebruikt voor het begrijpen en ontwikkelen van behandelingen voor obesitas en metabole ziekten.

Inleiding

Het doel van dit protocol is om een aanpak te beschrijven voor het ontwikkelen van gevasculariseerd beige vetweefsel uit een enkele, potentieel autologe bron, microvasculair fragment (MVF). Van bruine en beige vetweefsels is aangetoond dat ze gunstige eigenschappen vertonen die verband houden met metabole regulatie; Het kleine volume van deze vetweefseldepots bij volwassenen beperkt echter de potentiële impact op het systemische metabolisme, met name bij zieke aandoeningen zoals obesitas of diabetes type 2 1,2,3,4,5,6,7. Er is aanzienlijke belangstelling voor bruin / beige vet als een therapeutisch doelwit voor het voorkomen van de schadelijke metabole effecten in verband met obesitas en de comorbiditeiten ervan 8,9,10,11,12.

MVF's zijn vaatstructuren die direct kunnen worden geïsoleerd uit vetweefsel, gekweekt en gedurende langere tijd in een driedimensionale configuratie kunnen worden gehouden13,14,15. Eerder werk van onze groep, en anderen, zijn begonnen met het exploiteren van de meercellige en multipotente capaciteit van MVF's, met name als het gaat om de vorming van vetweefsel16,17,18. Als een opbouw van dit werk hebben we onlangs aangetoond dat MVF's afgeleid van knaagdiermodellen van gezonde en type 2 diabetes19 en van menselijke proefpersonen (volwassenen ouder dan 50 jaar)20 cellen bevatten die kunnen worden geïnduceerd om thermogeen of beige vetweefsel te vormen.

Hierin is een innovatieve aanpak van waaruit een enkele bron MVF wordt gebruikt, niet alleen in staat om beige vetweefsel te creëren, maar ook de bijbehorende en kritische vasculaire component21. Het gebruik van deze techniek kan van grote waarde zijn voor studies die op zoek zijn naar een eenvoudige weefselmanipulatiebenadering voor de vorming van thermogene vetweefsels. In tegenstelling tot andere methoden die gericht zijn op het engineeren van beige vetweefsel 22,23,24,25,26,27,28, vereist het proces dat in deze studie wordt beschreven niet het gebruik van meerdere celtypen of complexe inductieregimes. Gevasculariseerde beige en witte vetmodellen kunnen worden gemaakt met MVF's afkomstig van knaagdieren en menselijke bronnen, wat een groot vertaalpotentieel aantoont. Het eindproduct van dit protocol is een beige thermogeen vetweefsel met een structuur en metabole functie vergelijkbaar met bruin vetweefsel. Over het algemeen presenteert dit protocol het idee dat een gemakkelijk toegankelijke en mogelijk autologe bron MVF een waardevolle therapeutische interventie en hulpmiddel kan zijn voor het bestuderen van metabole stoornissen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de Dierenwelzijnswet en de Uitvoeringsverordening Dierenwelzijn conform de uitgangspunten van de Handreiking Verzorging en Gebruik Proefdieren. Alle dierprocedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Texas in San Antonio.

OPMERKING: Voor de hieronder beschreven stappen worden mannelijke Lewis Rats gebruikt. Kleine protocolaanpassingen moeten worden aangebracht voor een vrouwtje, evenals muis microvasculair fragment (MVF) collectie29. Voor protocollen die menselijke MVF's (h-MVF's) gebruiken, zijn de enige vereiste stappen de resuspensie van h-MVF's volgens het protocol van de fabrikant, de voorbereiding van groeimedia (1.3), de vorming van fibrinehydrogels (5) en het kweken (6). Voor een overzicht van het protocol, zie figuur 1.

figure-protocol-1
Figuur 1: Experimenteel overzicht. Uitsplitsing van zes belangrijke stappen, voorafgaand aan de analyse, voor de vorming van thermogeen vetweefsel met behulp van MVF. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Reagensbereiding

OPMERKING: Onderstaande reagentia komen overeen met één rat, gewogen en gemaakt in een biohood.

  1. Bereid runderserumalbumine (BSA) in PBS.
    1. Bereid 10 mg / ml (1,0%) BSA in PBS voor om te worden verdund voor wasstappen (1 mg / ml, 0,1%) en spijsvertering (4 mg / ml, 0,4%).
    2. Bereid verschillende concentraties BSA voor, zoals vermeld in stap 1.1.1, volgens de stappen 1.1.3-1.1.5.
    3. 10 mg/ml BSA in PBS (1% BSA in PBS)
      1. Voeg 500 mg BSA en 500 ml PBS toe aan een conische buis van 50 ml en vortex de oplossing om de BSA op te lossen.
      2. Als er overmatige bellen ontstaan, centrifugeer de oplossing dan gedurende 2 minuten op 350 x g . Filter steriliseer de oplossing met een nylon netfilter van 0,22 μm.
    4. 1 mg/ml BSA in PBS (0,1% BSA in PBS)
      1. Verdun 15 ml 10 mg/ml BSA in PBS 1:10 met PBS door 15 ml 10 mg/ml BSA in PBS toe te voegen aan 135 ml PBS in een steriele fles van 500 ml en schud de fles voorzichtig om een homogeen mengsel te garanderen.
    5. 4 mg/ml BSA in PBS (0,4% BSA in PBS)
      1. Verdun 35 ml 10 mg/ml BSA in PBS 1:2,5 met PBS door 35 ml 10 mg/ml BSA in PBS + 57,5 ml PBS toe te voegen in een steriele fles van 100 ml en schud de fles voorzichtig om een homogeen mengsel te garanderen.
  2. Bereid collagenase in BSA voor de vertering van gehakte vetkussentjes.
    1. Bereid 6 mg / ml collagenase.
      1. Weeg in een conische buis van 50 ml 72 mg collagenase (etiket "voor Epi").
      2. Weeg in drie conische buisjes van 50 ml elk 144 mg collagenase (etiket "voor Ing 1", "voor Ing 2" en "voor SubQ").
      3. Bewaar het afgewogen collagenase bij 4 °C tot gebruik.
        OPMERKING: Voeg BSA/PBS pas vlak voor de vertering toe.
      4. Voeg 12 ml 4 mg / ml BSA in PBS toe aan de buis met 72 mg collagenase.
      5. Voeg 24 ml 4 mg / ml BSA in PBS toe aan de buizen die 144 mg collagenase bevatten.
      6. Schud de buizen om een homogene oplossing te garanderen en filter steriliseer de oplossing met een nylon netfilter van 0,22 μm.
  3. Bereid groeimedia voor aangevuld met aminocapronzuur (ACA) om de geïsoleerde MVF te voeden / differentiëren.
    1. Groeimedia (GM): Supplement DMEM met 20% FBS, 1% penicilline-streptomycine (pen strepto), 0,2% mycoplasma profylactisch en 1 mg / ml ACA.
    2. Bereid witte adipogene media (WAM).
      1. WAM-inductie: Supplement DMEM / F12 met 20% FBS, 1% penstreptokokken, 0,2% mycoplasma profylactisch, 10 μg / ml insuline, 10 μm forskoline, 1 μm dexamethason en 1 mg / ml ACA.
        OPMERKING: Voeg voor h-MVF's bovendien 125 μM indomethacine toe.
      2. WAM-onderhoud: Supplement DMEM / F12 met 20% FBS, 1% penstreptokokken, 0,2% mycoplasma profylactisch, 5 μg / ml insuline en 1 mg / ml ACA.
        OPMERKING: Voor h-MVF's wijzigt u de insulineconcentratie in 10 μg/ml.
    3. Bereid beige adipogene media (BAM) voor.
      1. BAM-inductie: Supplement DMEM/F12 met 20% FBS, 1% penstreptokokken, 0,2% mycoplasmaprofylactisch, 10 μg/ml insuline, 10 μm forskoline, 1 μm dexamethason, 1 μm rosiglitazon, 20 nM 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine (T3) en 1 mg/ml ACA.
        OPMERKING: Voor h-MVF's wijzigt u de concentratie van T3 in 120 nM.
      2. BAM-onderhoud: Supplement DMEM/F12 met 20% FBS, 1% penstreptokokken, 0,2% profylactisch mycoplasma, 5 μg/ml insuline, 10 μm forskoline, 1 μm rosiglitazon, 20 nM T3 en 1 mg/ml ACA.
        OPMERKING: Voor h-MVF's wijzigt u de insulineconcentratie in 10 μg/ml en de T3-concentratie in 120 nM.
  4. Bereid trombine voor (hoeft alleen te worden gemaakt als de voorraad aliquoted oplossing niet beschikbaar is) om het stollingsmiddel te gebruiken in fibrinegels.
    1. 10 U/ml trombine in ddH2O:
      1. Resuspendie trombinepoeder met behulp van 1-5 ml ddH2O in de injectieflacon van de fabrikant en breng de resuspensie over in een bekerglas van 250 ml.
      2. Breng de oplossing op 100 ml en pipetteer de oplossing meerdere keren op en neer om een homogeen mengsel te garanderen. Aliquot de oplossing in 15 ml conische buizen (~10 ml / buis) en bewaar de aliquots in een -20 ° C vriezer.
        OPMERKING: Om te gebruiken, ontdooi de trombine bij kamertemperatuur (RT).

2. Gereedschaps-/materiaalvoorbereiding

OPMERKING: Alle instrumentatie moet vóór gebruik worden geautoclaveerd/gesteriliseerd.

  1. Epididymale/inguinale/subcutane vetisolatie (operatie uit te voeren in een bepaald operatiegebied)
    1. Zorg voor de beschikbaarheid van wegwerponderleggers, twee scharen, een hemostat (optioneel), twee tangen en vier conische buizen van 50 ml met 10-15 ml 1 mg / ml BSA (0,1%) in PBS.
  2. Microvasculaire fragmentisolatie
    1. Voor het hakken (te doen in een biohood), zorg voor de beschikbaarheid van drie ongecoate steriele 100 mm petrischalen, een paar tangen en een paar gebogen scharen.
    2. Voor vertering en isolatie (te doen in een biohood), zorg voor de beschikbaarheid van één schaar, één paar tangen, acht ongecoate steriele 100 mm petrischalen, drie ongecoate steriele 35 mm petrischalen, collagenase gewogen en bij 4 °C, vier kolven van 250 ml, één plastic houder met een gat in het midden, vier schermen van 500 μM (in 3 gesneden in afgeronde vierkanten), vier schermen van 37 μM (in 3 gesneden in afgeronde vierkanten) en 11 conische buizen van 50 ml.
  3. Fibrine resuspensie
    1. Voor fibrinehydrogels (te doen in een biohood), moet u ervoor zorgen dat fibrinogeen, trombine en groeimedia (gemaakt tijdens de bereiding van het reagens) beschikbaar zijn.

3. Vetisolatieprotocol

  1. Voorbereidende stappen
    1. Vul een bekerglas met ethanol om de chirurgische instrumenten te wassen en te ontsmetten voordat u ze gebruikt. Bereid vervolgens de tafel voor op het hanteren van de rat en zorg dat er een vacuüm klaar staat om de vacht te zuigen die tijdens de scheerstap is gegenereerd.
    2. Bereid een emmer met ijs voor waar de eerder bereide 50 ml conische buizen, elk met 10 ml 1 mg / ml BSA, zullen worden geplaatst. Label de tubes dienovereenkomstig.
      OPMERKING: Het kan nodig zijn om twee afzonderlijke conische buizen voor het liesvet te hebben, omdat twee zijden moeten worden geëxtraheerd en de hoeveelheid vet die uit dit gebied wordt verzameld, meestal het grootst is in vergelijking met epididymale en achterste subcutane.
    3. Begin met een geëuthanaseerde rat in het gedefinieerde chirurgische gebied met de vereiste chirurgische hulpmiddelen. Over het algemeen wordt CO2 gebruikt om de ratten te euthanaseren volgens IACUC-protocollen.
    4. Scheer de rat met tondeuses met behulp van tondeuses rond het interessegebied. Scheer specifiek tussen de liezen en de helft van de buik voor epididymale en inguinale vetisolatie (gebruik het kleinere scheerapparaat voor de vacht in deze regio). Scheer de hele rug om het achterste onderhuidse vet tussen de schouderbladen te krijgen (het is het beste om een groter scheerapparaat te gebruiken omdat de vacht dikker is aan de achterkant van de rat).
    5. Bereid de rat aseptisch voor door hem te besproeien met 70% ethanol. Over het algemeen wordt aanbevolen om het gebied dat twee keer wordt gesneden, schoon te maken.
  2. Isolatie van verschillende vetdepots
    1. Inguinaal (subcutaan)
      1. Til in rugligging de huid onder de penis op met een schaar. Begin de incisie met een schaar, begin in het midden en knip lateraal, vorm een "V" -vorm en loop naar de achterkant van de rat om toegang te krijgen tot het hele vetdepot. Vergeet niet om oppervlakkig te snijden, zodat het vet eronder intact is. Zorg tijdens de snijstap voor de scheiding van de huid van het vet door het onderling verbonden fasciaweefsel te snijden (figuur 2A).
      2. Zodra de fascia op de juiste manier is gesneden, moet u ervoor zorgen dat de twee zijden van het liesvet zichtbaar zijn (het liesvet strekt zich uit van de liesstreek naar de achterkant). Verwijder vervolgens het vet van de twee zijden in twee afzonderlijke conische buizen met 10 ml 1 mg / ml BSA (figuur 2B).
    2. Epididymaal (visceraal)
      1. Oogst het epididymale vet door de buikhuid door te snijden en voorzichtig door de dunne laag rond de testikels (figuur 2C).
      2. Trek met een tang voorzichtig het vetweefsel eruit en knip het uit met een schaar. Vermijd het ontleden van belangrijke zichtbare bloedvaten (als de testis en bijbal worden geoogst, verwijder ze dan tijdens de reinigingsstap in de biohood).
      3. Plaats het verwijderde vet voorzichtig in een conische buis van 50 ml met 10 ml 1 mg / ml BSA in PBS.
        OPMERKING: De verwijdering van het epididymale vet moet worden gedaan nadat het liesvet is verwijderd. Het epididymale vet is over het algemeen kleiner in volume en bevindt zich onder het liesvet, onder de buikhuid rond de testis en bijbal.
    3. Posterieure subcutane
      1. Draai de rat gevoelig (dorsale kant naar boven) en knip met een grote schaar de huid van de rug (de huid in dit gebied is dik) helemaal tot aan de hoofdhuid, waarbij je ervoor zorgt dat je niet te diep snijdt, net onder de huid (figuur 2D).
      2. Snijd de fascia die de huid met het weefsel verbindt; Het vet bevindt zich in het interscapulaire gebied. Maak een notitie om het onderhuidse vet te onderscheiden / scheiden van het bruine vet. Het bruine vet bevindt zich dichter bij de wervelkolom (figuur 2E).
      3. Isoleer en plaats het vet in de overeenkomstige 50 ml conische buis(en) met 10 ml 1 mg/ml BSA in PBS.

figure-protocol-2
Figuur 2: Isolatie van verschillende vetweefseldepots . (A) Initiële incisies die nodig zijn voor excisie van het inguinale vetweefsel. B) Locatie van het inguinale vetdepot. (C) Locatie van het epididymale vetdepot, waarbij de incisie van de buitenste huid wordt opgemerkt die nodig is voor toegang. (D) Extra incisies nodig zodra de muizen vatbaar zijn voor toegang tot extra vet. E) Plaats van de achterste onderhuidse vetopslagplaats. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Microvasculair fragment isolatie protocol

  1. Breng 50 ml conische buis(fen) met weggesneden vet van de rat in de bioschaal.
  2. Plaats het vet met behulp van een tang in een standaard petrischaal van 100 mm (met ~ 0,5 ml 1 mg / ml BSA in PBS om het weefsel gehydrateerd te houden).
  3. Reinig en verwijder alle zichtbare bloedvaten en spier / vreemd weefsel van vet.
  4. Hak het vet met een schaar gedurende ~ 10 minuten fijn (gehakt genoeg zodat het kan worden overgebracht met een pipet van 10 ml).
  5. Controleer op knobbels door ~ 0,5 ml 1 mg / ml BSA in PBS toe te voegen; Blijf hakken als dat nodig is.
  6. Breng het gehakte vet over in een steriele kolf van 250 ml met een pipet van 10 ml.
    OPMERKING: Noteer het volume met behulp van een pipet.
  7. Voeg voldoende BSA (1 mg / ml) toe, zodat het uiteindelijke volume 20 ml is.
  8. Voeg 4 mg / ml BSA in PBS toe aan collagenase (collagenase eindconcentratie: 6 mg / ml) (d.w.z. 12 ml voor de 72 mg collagenase of 24 ml voor de 144 mg collagenase).
    OPMERKING: Voeg niet toe totdat het gehakt is voltooid, omdat dit tijdgevoelig is.
  9. Schud de conische buis voorzichtig om een homogene oplossing te garanderen en filter steriliseer de oplossing met een nylon netfilter van 0,22 μm.
  10. Voor het epididymale vet, verteren gedurende ~ 8-10 minuten; voor het inguinale en achterste onderhuidse vet, verteren gedurende ~ 15-20 minuten in een waterbad van 37 ° C, waarbij de kolf in een cirkelvormige beweging wordt geschud (stop op het moment dat het vet komt waar er nog maar een paar klonten over zijn).
  11. Breng het verteerde vet over in een conische buis van 50 ml (er moet ~ 30 ml / buis zijn) en label de buis als "verteerd vet".
  12. Draai de buis op 400 x g gedurende 4 minuten; na het spinnen moet de pellet rood zijn (figuur 3A).
  13. Plaats tijdens het centrifugeren het steriele 37 μM-scherm en het 500 μM-scherm in een steriele petrischaal met 5 ml 1 mg/ml BSA in PBS om voor gebruik voor te weken.
  14. Na de spin decanteert u het supernatant in een conische buis van 50 ml met het label "afval". Voer de decantatie voorzichtig uit om het oppervlakkige vet te verwijderen en de pellet gemaakt van MVF's niet te verstoren.
  15. Voeg 10 ml 1 mg/ml BSA in PBS toe aan de buis met de pellet ("verteerd vet"). Triturate (pipet op en neer) van de pellet 2x.
  16. Vermijd te ruw te zijn op de pellet om de fragmenten niet te verstoren.
  17. Plaats het 500 μM scherm in een nieuwe petrischaal boven de plastic schermhouder (figuur 3B).
  18. Pipetteer 10 ml uit de buis van de "verteerde pellet" over een scherm van 500 μM met behulp van concentrische cirkels (figuur 3C).
  19. Was het filter met een extra 5 ml van 1 mg / ml BSA in PBS. De gewenste cellen filteren door in de petrischaal; gooi daarom het 500 μM-scherm weg, maar bewaar de gefilterde vloeistof in de petrischaal.
  20. Plaats het 37 μM scherm in een nieuwe petrischaal boven de plastic schermhouder.
  21. Vervang de pipet om eventuele klonten te verwijderen voordat u het 37 μM-scherm gebruikt.
  22. Pipetteer de vloeistof die wordt verkregen uit de eerste filtratie over het 37 μM-scherm met behulp van concentrische cirkels.
  23. Was het filter met een extra 5 ml van 1 mg / ml BSA in PBS. De gewenste cellen blijven in het filter, gooien daarom de gefilterde vloeistof weg, maar slaan het 37 μM-scherm op.
  24. Schuif het scherm van 37 μM in een nieuwe petrischaal met 5 ml 1 mg/ml BSA in PBS.
  25. Schud de schaal door hem tegen een conische houder te tikken om de fragmenten los te maken. Schud niet te krachtig, omdat de vloeistof / cellen uit de petrischaal kunnen morsen.
  26. Spoel het filter af met een extra 5 ml 1 mg / ml BSA in PBS. De gewenste cellen blijven in vloeibare oplossing in de petrischaal. Bewaar het 37 μM-scherm en het losgeraakte fragment met vloeistof in de petrischaal voor de volgende stappen.
  27. Breng het BSA + fragment bevattende vloeistof over in een steriele conische buis van 50 ml.
  28. Herhaal het spoelen van het 37 μM-scherm nog een paar keer (elke keer met ~ 5 ml 1 mg / ml BSA in PBS) en voeg toe aan de conische buis. Herhaal dit totdat het totale verzamelde volume ~15-20 ml is. Uiteindelijk worden de gewenste cellen verzameld uit de vloeibare oplossing in de petrischaal en in een conische buis geplaatst; gooi op dit punt het scherm van 37 μM na de laatste spoeling weg, maar bewaar de losgekomen fragmenten met vloeistof in de conische buis van 50 ml.
  29. Knip het uiteinde van een 200 μL pipetpunt af met een schaar. Schud voorzichtig de buis van 50 ml, verwijder twee monsters van 20 μl en doe ze in een schone petrischaal van 35 mm.
  30. Tel het aantal fragmenten in elk monster in de petrischaal om het totale aantal geïsoleerde MVF's te verkrijgen.
    Totaal aantal fragmenten = figure-protocol-3
  31. Draai het resterende losgemaakte fragment met vloeistof gedurende 4 minuten in een conische buis van 50 ml op 400 x g om de MVF te verzamelen.

figure-protocol-4
Figuur 3: Isolatie van MVF's. (A) Navertering van het vetweefsel, weergave van de scheiding van MVF's die pellet en supernatant bevatten na een spin-down. (B) Indeling van benodigdheden voor filtratie en beknelling van MVF's. (C) Illustratie van de concentrische cirkelmethode voor filtratie-/wasstappen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Vorming van fibrine hydrogels

  1. Voorbeeld berekeningen:
    OPMERKING: Hieronder staan de berekeningen voor MVF's gezaaid bij ~ 15.000-20.000 MVF / ml en de fibrinogeen: trombinegelverhouding bij 2: 5, met fibrinogeen gebruikt bij een concentratie van 20 mg / ml.
    1. Voor het maken van vijf 250 μL gels is een totaal volume van 1.250 μL nodig. Houd altijd rekening met pipetteerfouten, maak daarom genoeg voor 1,5 ml gels.
      1. Bereken het benodigde volume fibrinogeen als volgt:
        figure-protocol-5, X1 = 428,57 μL fibrinogeen
      2. Bereken het benodigde trombinevolume als volgt:
        figure-protocol-6, X2 = 1.071,43 μL trombine
      3. Maak voor het vereiste volume van 428,57 μl 500 μl fibrinogeen als volgt:
        20 mg/ml * 0,5 ml = 10 mg fibrinogeen. Resuspendie dit in 500 μL DMEM
      4. Om elke gel te verkrijgen, berekent u het volume van fibrinogeen en trombine als volgt:
        1. Fibrinogeen:
          figure-protocol-7, X1 = 71,43 μL fibrinogeen (in DMEM) + MVF
        2. Trombine:
          figure-protocol-8, X2 = 178,57 μL trombine
  2. MVF fibrine gel gieten
    1. Decanteer het grootste deel van de vloeistof in het gesponnen fragment in de 50 ml conische buis. Gebruik een pipet om het kleine volume vloeistof te verwijderen dat op de rand van de conische buis vangt.
    2. Voeg trombine toe aan putjes waar gels worden gemaakt (figuur 4A).
    3. Knip het uiteinde van een pipetpunt van 200 μL en resuspensie de MVF's voorzichtig met fibrinogeen om een einddichtheid van ~ 15.000-20.000 MVF / ml eenmaal in de gel te verkrijgen.
    4. Knip het uiteinde van een pipetpunt van 200 μL en pipet MVF+Fibrinogeen voorzichtig in de trombineoplossing. Pipetteer snel op en neer om een homogeen mengsel te garanderen. Herhaal dit totdat alle gels zijn gemaakt (figuur 4B).
    5. Plaats de putplaat(en) gedurende ~15 minuten in een incubator (37 °C, 5% CO2) om gel-crosslinking mogelijk te maken (figuur 4C).
    6. Voeg 100-150 μL groeimedia toe aan elke put.

figure-protocol-9
Figuur 4: Vorming van MVF-fibrinegels . (A) Een 5/7-delig trombinemengsel wordt in de overeenkomstige put gepipetteerd. (B) Vervolgens wordt met een geknipte pipetpunt (om MVF's niet te verstoren) een 2/7-delig fibrinogeen+MVF-mengsel in de put gepipetteerd en voorzichtig gemengd. (C) Ten slotte worden alle voltooide gels bij 37 °C in een incubator geplaatst, zodat hydrogel volledig kan stollen voordat de media erop worden geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Kweekomstandigheden van MVF's

  1. Voor het kweken van niet-gevasculariseerd wit en beige vetweefsel (+ GM Control), gebruikt u de tijdlijnen19 in figuur 5.
  2. Voor het kweken van gevasculariseerd wit en beige vetweefsel (+ GM Control), gebruik de tijdlijnen19 weergegeven in figuur 6.
  3. Hydrogels moeten in een couveuse (37 °C, 5% CO2) worden bewaard voor de duur van de kweek voor het onderzoek, waarbij de media om de dag worden vervangen. Voor fixatie en behandeling van monsters voor analyse, zie eerder gepubliceerde werken16,19,20.

figure-protocol-10
Figuur 5: Timing voor niet-gevasculariseerde vetweefselvorming. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Acosta et al.19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-11
Figuur 6: Timing voor de vorming van gevasculariseerd vetweefsel. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Acosta et al.19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Er zijn een paar belangrijke fenotypische morfologische kenmerken van beige / bruin vetweefsel: het is multiloculair / bevat kleine lipidedruppeltjes, bezit een groot aantal mitochondriën (de reden voor zijn karakteristieke "bruinachtige" uiterlijk in vivo), heeft dienovereenkomstig een hoog zuurstofverbruik / mitochondriale bio-energetica, is sterk gevasculariseerd, heeft een verhoogde lipolyse / insuline-gestimuleerde glucose-opname, en, het meest berucht, drukt hoge niveaus van ontkoppelingseiwit 1 (UCP1) ui...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het gebied van bruin / beige vetweefseltechnologie is grotendeels onvolwassen 22,23,24,25,26,27,28, waarbij het grootste deel van de vetmodellen wordt ontwikkeld voor wit vetweefsel 8,22,31. Gemanip...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd in afwezigheid van commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Dankbetuigingen

Dr. Acosta wordt ondersteund door de National Institutes of Health subsidies CA148724 en TL1TR002647. Dr. Gonzalez Porras wordt ondersteund door het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases van de National Institutes of Health, onder awardnummer F32-0DK122754. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (5SC1DK122578) en de Universiteit van Texas in San Antonio Department of Biomedical Engineering. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. Figuren zijn deels gemaakt met Biorender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Aminocaproic AcidSigma AldrichA2504-100GToegevoegd in DMEM bij de concentratie van 1 mg/mL
Blunt-Tipped ScissorsFisher scientific12-000-172Sterilisatie in autoclaaf
Bovin Serum Albumin (BSA)Millipore126575-10GMVerdund in PBS tot 4 mg/mL en 1 mg/mL
Collagenase Type 1Fisher scientificNC9633623Verdund tot 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestie van gehakte vet
DexamethasonThermo ScientificAC230302500Verdund in ethanol tot een 2 mg/ml stamconcentratie
Disposable onderlagenFisher scientific23-666-062Voor vloeistofabsorptie tijdens chirurgie
Dissectie schaarFisher scientific08-951-5Sterilisatie in autoclaaf
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM)Fisher scientific11885092
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12)Sigma AldrichD8062
Fetaal bovien serum Fisher scientific16140089Toegevoegd in DMEM tot 20% v/v.
Fibrinogeen Sigma AldrichF8630-25GGelooid in DMEM bij de concentratie van 20 mg/mL, Eiwit gevonden in bloedplasma en hoofdcomponent van hydrogel
Flacon, 250 mLFisher scientificFB500250Maakt digestie van vet mogelijk met een groot oppervlak
PincetFisher scientific50-264-21Sterilisatie in autoclaaf, Voor het hanteren van weefsel en filters
ForskolinSigma AldrichF6886Verdund in ethanol tot een 10 mM stamconcentratie
Human MVFAdvanced Solutions Life Scienes, LLChttps://www.advancedsolutions.com/microvesselsHuman MVFs (hMVFs) geïsoleerd van drie verschillende patiënten (52-, 54- en 56-jarige vrouwen) werden gebruikt in het huidige onderzoek. 
Indomethacine Sigma AldrichI7378Verdund in ethanol tot een 12.5 mM stamconcentratie
Insulin van varkens pancreasSigma AldrichI5523Verdund in 0.01 N HCl tot een 5 mg/ml stamconcentratie
MycoZapFisher scientificNC9023832Toegevoegd in DMEM tot 0.2% w/v, Mycoplasma Profylactisch 
Pennycilin/Streptomycine (10.000 U/mL)Fisher scientific15140122Toegevoegd in DMEM tot 1% v/v.
Petrischalen, polystyreen (100 mm x 15 mm).Fisher scientific3510293 voor verwijdering van bloedvaten en gehakt, 8 (deksel) voor het voorweeksen van schermen & 8 (schaal) voor gebruik bij het filteren met 500 of 37 µM schermen
Petrischalen, polystyreen (35 mm x 10 mm).Fisher scientific50-202-036Voor het tellen van fragmenten
Fosfaatbufferoplossing (PBS)Fisher scientific14-190-250Verdund tot 1x met steriele gedeïoniseerd water.
Rattenschaartjes (Andwin Mini Arco Pet Trimmer)Fisher scientificNC0854141
RosiglitazoneFisher scientificR0106200MGVerdund in DMSO tot een 10 mM stamconcentratie
SchaarFine Science Tools14059-111 voor initiële incisie, 1 voor epididymale incisie, 1 voor het klikken van de punt
Scherm  37 µM Carolina Biological Supply Company652222RGesneden in 3" afgeronde vierkanten en gesteriliseerd in ethyleenoxide, Fragmentopsluiting en verwijdering van zeer kleine fragmenten/enkele cellen en puin
Scherm 500 µM Carolina Biological Supply Company652222FGesneden in 3" afgeronde vierkanten en gesteriliseerd in ethyleenoxide, Verwijdert grotere fragmenten/puin
Gekartelde hemostaatFisher scientific12-000-171Sterilisatie in autoclaaf, Voor het klemmen van de huid vóór incisie
Steriflip Filter 0.22 μm MilliporeSE1M179M6
TrombizineFisher scientific6051601KUVerdund in gedeioniseerd water tot 10 U/mL, Gebruikt als stollingsagent om fibrinogeen om te zetten in fibrine
Schildklierhormoon (T3)Sigma AldrichT2877Verdund in 1N NaOH tot een 0.02 mM stamconcentratie
Zucker diabetic fatty (ZDF) ratten - zwaarlijvig (FA/FA) of mager (FA/+) mannelijk Charles Riverhttps://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611
https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611		Verkregen van Charles River (Wilmington, MA). Ratten werden verkregen op 4 weken oud en gevoerd met Purina 5008 tot euthanasie (15-19 weken oud). Glucosewaarden (bloed uit de laterale safene ader) waren hoger dan 300 mg/dL bij alle FA/FA ratten die in het onderzoek werden gebruikt. Alle dieren werden gehuisvest in een temperatuurgecontroleerde omgeving met een 12-uurs licht-donkercyclus en ad libitum gevoerd.

Referenties

  1. Cohen, P., Spiegelman, B. M. Brown and beige fat: molecular parts of a thermogenic machine. Diabetes. 64 (7), 2346-2351 (2015).
  2. Liu, X., et al. Brown adipose tissue transplantation reverses obesity in Ob/Ob mice. Endocrinology. 156 (7), 2461-2469 (2015).
  3. Tharp, K. M., Stahl, A. Bioengineering beige adipose tissue therapeutics. Frontiers in Endocrinology. 6, 164(2015).
  4. Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Molecular Metabolism. 5 (5), 352-365 (2016).
  5. Kim, S. H., Plutzky, J. Brown fat and browning for the treatment of obesity and related metabolic disorders. Diabetes & Metabolism Journal. 40 (1), 12-21 (2016).
  6. Lizcano, F., Vargas, D. Biology of beige adipocyte and possible therapy for type 2 diabetes and obesity. International Journal of Endocrinology. 2016, 9542061(2016).
  7. Mulya, A., Kirwan, J. P. Brown and beige adipose tissue: therapy for obesity and its comorbidities. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 45 (3), 605-621 (2016).
  8. Murphy, C. S., Liaw, L., Reagan, M. R. In vitro tissue-engineered adipose constructs for modeling disease. BMC Biomedical Engineering. 1, 27(2019).
  9. Srivastava, S., Veech, R. L. Brown and brite: The fat soldiers in the anti-obesity fight. Frontiers in Physiology. 10, 38(2019).
  10. Samuelson, I., Vidal-Puig, A. Studying brown adipose tissue in a human in vitro context. Frontiers in Endocrinology. 11, 629(2020).
  11. Wang, C. -H., et al. CRISPR-engineered human brown-like adipocytes prevent diet-induced obesity and ameliorate metabolic syndrome in mice. Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).
  12. Kaisanlahti, A., Glumoff, T. Browning of white fat: agents and implications for beige adipose tissue to type 2 diabetes. Journal of Physiology and Biochemistry. 75 (1), 1-10 (2019).
  13. Sato, N., et al. Development of capillary networks from rat microvascular fragments in vitro: the role of myofibroblastic cells. Microvascular Research. 33 (2), 194-210 (1987).
  14. Laschke, M. W., Später, T., Menger, M. D. Microvascular fragments: More than just natural vascularization units. Trends in Biotechnology. 39 (1), 24-33 (2021).
  15. Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 32 (7), 409-419 (1996).
  16. Acosta, F. M., Stojkova, K., Brey, E. M., Rathbone, C. R. A straightforward approach to engineer vascularized adipose tissue using microvascular fragments. Tissue Engineering. Part A. 26 (15-16), 905-914 (2020).
  17. Acosta, F. M., et al. Adipogenic differentiation alters properties of vascularized tissue-engineered skeletal muscle. Tissue Engineering. Part A. 28 (1-2), 54-68 (2021).
  18. Strobel, H. A., Gerton, T., Hoying, J. B. Vascularized adipocyte organoid model using isolated human microvessel fragments. Biofabrication. 13 (3), 035022(2021).
  19. Acosta, F. M., et al. Engineering functional vascularized beige adipose tissue from microvascular fragments of models of healthy and type II diabetes conditions. Journal of Tissue Engineering. 13, 20417314221109337(2022).
  20. Gonzalez Porras, M. A., Stojkova, K., Acosta, F. M., Rathbone, C. R., Brey, E. M. Engineering human beige adipose tissue. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 906395(2022).
  21. Herold, J., Kalucka, J. Angiogenesis in adipose tissue: The interplay between adipose and endothelial cells. Frontiers in Physiology. 11, 1861(2021).
  22. McCarthy, M., et al. Fat-On-A-Chip models for research and discovery in obesity and its metabolic comorbidities. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (6), 586-595 (2020).
  23. Klingelhutz, A. J., et al. Scaffold-free generation of uniform adipose spheroids for metabolism research and drug discovery. Scientific Reports. 8 (1), 523(2018).
  24. Yang, J. P., et al. Metabolically active three-dimensional brown adipose tissue engineered from white adipose-derived stem cells. Tissue Engineering. Part A. 23 (7-8), 253-262 (2017).
  25. Vaicik, M. K., et al. Hydrogel-based engineering of beige adipose tissue. Journal of Materials Chemistry B. 3 (40), 7903-7911 (2015).
  26. Tharp, K. M., Stahl, A. Bioengineering beige adipose tissue therapeutics. Frontiers in Endocrinology. 6, 164(2015).
  27. Tharp, K. M., et al. Matrix-assisted transplantation of functional beige adipose tissue. Diabetes. 64 (11), 3713-3724 (2015).
  28. Harms, M. J., et al. Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes. Cell Reports. 27 (1), 213-225 (2019).
  29. Frueh, F. S., Später, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of murine adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for tissue engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721(2017).
  30. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: Function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
  31. Unser, A. M., Tian, Y., Xie, Y. Opportunities and challenges in three-dimensional brown adipogenesis of stem cells. Biotechnology Advances. 33, 962-979 (2015).
  32. Dani, V., Yao, X., Dani, C. Transplantation of fat tissues and iPSC-derived energy expenditure adipocytes to counteract obesity-driven metabolic disorders: Current strategies and future perspectives. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 23 (1), 103-110 (2022).
  33. Xu, X., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for dental pulp regeneration. Journal of Endodontics. 47 (7), 1092-1100 (2021).
  34. McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. Journal of Surgical Research. 192 (1), 214-222 (2014).
  35. Gealekman, O., et al. Depot-specific differences and insufficient subcutaneous adipose tissue angiogenesis in human obesity. Circulation. 123 (2), 186-194 (2011).
  36. Altalhi, W., Hatkar, R., Hoying, J. B., Aghazadeh, Y., Nunes, S. S. Type I diabetes delays perfusion and engraftment of 3D constructs by impinging on angiogenesis; which can be rescued by hepatocyte growth factor supplementation. Cellular and Molecular Bioengineering. 12 (5), 443-454 (2019).
  37. Altalhi, W., Sun, X., Sivak, J. M., Husain, M., Nunes, S. S. Diabetes impairs arterio-venous specification in engineered vascular tissues in a perivascular cell recruitment-dependent manner. Biomaterials. 119, 23-32 (2017).
  38. Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. European Cells & Materials. 28, 287-298 (2014).
  39. Später, T., et al. Vascularization of microvascular fragment isolates from visceral and subcutaneous adipose tissue of mice. Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 19 (1), 161-175 (2021).
  40. Später, T., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from male and female fat donors exhibit a comparable vascularization capacity. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 777687(2021).
  41. Laschke, M. W., Menger, M. D. The simpler, the better: tissue vascularization using the body's own resources. Trends in Biotechnology. 40 (3), 281-290 (2022).
  42. Yang, F., Cohen, R. N., Brey, E. M. Optimization of co-culture conditions for a human vascularized adipose tissue model. Bioengineering. 7 (3), 114(2020).
  43. Pilkington, A. -C., Paz, H. A., Wankhade, U. D. Beige adipose tissue identification and marker specificity-Overview. Frontiers in Endocrinology. 12, 599134(2021).
  44. Chiou, G., et al. Scaffold architecture and matrix strain modulate mesenchymal cell and microvascular growth and development in a time dependent manner. Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (5), 507-526 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Gevasculariseerd vetweefselweefseltechniek van vetweefselbeige vetweefselcollagenase verteringconfocale microscopieadipocytendifferentiatiezuurstofconsumptiesnelheid
Driedimensionale kweek van gevasculariseerd thermogeen vetweefsel uit microvasculaire fragmenten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.