Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Modellering van oraal-oesofageaal plaveiselcelcarcinoom in 3D-organoïden

4.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64676

⸱

23 december 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University, 2Organoid and Cell Culture Core, Columbia University Digestive and Liver Diseases Research Center, Columbia University, 3Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, Columbia University, 4Histopathology Facility, Fox Chase Cancer Center, 5Division of Digestive and Liver Diseases, Department of Medicine, Columbia University, 6Department of Genetics and Development, Columbia University, 7Section of Oral, Diagnostic and Rehabilitation Sciences, College of Dental Medicine, Columbia University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de belangrijkste stappen voor het genereren en karakteriseren van muriene orale-oesofageale 3D-organoïden die normale, preneoplastische en plaveiselcelcarcinoomlaesies vertegenwoordigen die worden geïnduceerd via chemische carcinogenese.

Samenvatting

Oesofageaal plaveiselcelcarcinoom (ESCC) komt wereldwijd voor, goed voor 90% van alle gevallen van slokdarmkanker per jaar, en is het dodelijkste van alle menselijke plaveiselcelcarcinomen. Ondanks recente vooruitgang bij het definiëren van de moleculaire veranderingen die gepaard gaan met ESCC-initiatie en -ontwikkeling, blijft de prognose van de patiënt slecht. De functionele annotatie van deze moleculaire veranderingen is de noodzakelijke volgende stap en vereist modellen die zowel de moleculaire kenmerken van ESCC vastleggen als gemakkelijk en goedkoop kunnen worden gemanipuleerd voor functionele annotatie. Muizen behandeld met de tabaksrook mimetisch 4-nitroquinoline 1-oxide (4NQO) vormen voorspelbaar ESCC en slokdarmpreneoplasie. Van belang is dat 4NQO-laesies ook voorkomen in de mondholte, meestal in de tong, evenals de voormaag, die allemaal het gestratificeerde plaveiselepitheel delen. Deze muizen kunnen echter niet eenvoudig worden gemanipuleerd voor het testen van functionele hypothesen, omdat het genereren van isogene muismodellen tijd- en middelenintensief is. Hierin overwinnen we deze beperking door eencellige driedimensionale (3D) organoïden te genereren van muizen die zijn behandeld met 4NQO om murine ESCC of preneoplastische cellen ex vivo te karakteriseren. Deze organoïden vangen de opvallende kenmerken van ESCC en slokdarmpreneoplasie, kunnen goedkoop en snel worden gebruikt om isogene modellen te vormen en kunnen worden gebruikt voor syngenetische transplantatie-experimenten. We demonstreren hoe 3D-organoïden te genereren uit normaal, preneoplastisch en SCC-muizenslokdarmweefsel en deze organoïden te onderhouden en te cryopreserveren. De toepassingen van deze veelzijdige organoïden zijn breed en omvatten het gebruik van genetisch gemanipuleerde muizen en verdere karakterisering door flowcytometrie of immunohistochemie, het genereren van isogene organoïde lijnen met behulp van CRISPR-technologieën en medicijnscreening of syngenetische transplantatie. Wij zijn van mening dat de wijdverbreide toepassing van de in dit protocol gedemonstreerde technieken de vooruitgang op dit gebied ter bestrijding van de zware last van het ESCC zal versnellen.

Inleiding

Oesofageaal plaveiselcelcarcinoom (ESCC) is het dodelijkste van de menselijke plaveiselcelcarcinomen, vanwege de late diagnose, therapieresistentie en metastase 1,2. ESCC ontstaat uit het gelaagde plaveiselepitheel, dat het luminale oppervlak van de slokdarm bekleedt. Het plaveiselepitheel bestaat uit proliferatieve basale cellen en gedifferentieerde cellen binnen de suprabasale cellaag. Onder fysiologische omstandigheden drukken basale cellen markers uit zoals p63, Sox2 en cytokeratine K5 en K14, terwijl gedifferentieerde cellen K4, K13 en IVL tot expressie brengen. Basale cellen zelf zijn heterogeen en omvatten vermeende stamcellen gedefinieerd door markers zoals K153 en CD734. Bij homeostase ondergaan basale cellen post-mitotische terminale differentiatie binnen de suprabasale cellaag, terwijl gedifferentieerde cellen migreren en desquamateren in het lumen om epitheelvernieuwing te voltooien. ESCC doet denken aan hun cellen van oorsprong en vertoont plaveiselceldifferentiatie in verschillende mate. ESCC gaat vaak gepaard met multifocale histologische voorloperlaesies, bekend als intra-epitheliale neoplasie (IEN) of dysplasie, bestaande uit atypische basaloïde cellen. Naast epitheliale veranderingen vertoont ESCC weefselremodellering binnen het subepitheliale compartiment, waar de activering van kankergeassocieerde fibroblasten (CAF's) en de rekrutering van immuun- / ontstekingscellen plaatsvinden om de tumorbevorderende micro-omgeving te bevorderen.

De pathogenese van ESCC omvat genetische veranderingen en blootstelling aan omgevingsrisicofactoren. Belangrijke genetische laesies omvatten de inactivatie van de tumorsuppressorgenen TP53 en CDKN2A (p16INK4A) en de activering van de CCND1 (cycline D1) en EGFR-oncogenen, die culmineren in een verminderde celcycluscontrolepuntfunctie, afwijkende proliferatie en overleving onder genotoxische stress gerelateerd aan blootstelling aan kankerverwekkende stoffen in het milieu. Inderdaad, genetische veranderingen werken nauw samen met gedrags- en omgevingsrisicofactoren, meestal tabaks- en alcoholgebruik. Tabaksrook bevat kankerverwekkende stoffen voor de mens, zoals aceetaldehyde, dat ook de belangrijkste metaboliet van alcohol is. Aceetaldehyde induceert DNA-adducten en interstreng DNA-crosslinks, wat leidt tot DNA-schade en de accumulatie van DNA-mutaties en chromosomale instabiliteit. Gezien overmatige mitogene stimuli en afwijkende proliferatie door oncogenactivering, wordt de kwaadaardige transformatie van slokdarmepitheelcellen vergemakkelijkt door mechanismen om genotoxische stress het hoofd te bieden, waaronder de activering van antioxidanten, autofagie en epitheliale-mesenchymale overgang (EMT). Interessant is dat deze cytoprotectieve functies vaak worden geactiveerd in ESCC-kankerstamcellen (CSC's) die worden gekenmerkt door hoge CD44 (CD44H) expressie en de mogelijkheden hebben van tumorinitiatie, invasie, metastase en therapieresistentie 5,6,7.

ESCC is gemodelleerd in celkweek en in knaagdiermodellen 8,9. In de afgelopen drie decennia zijn robuuste genetisch gemanipuleerde muismodellen van ESCC ontwikkeld. Deze omvatten CCND1 en EGFR transgene muizen 10,11 en p53 en p120Ctn knock-out muizen 12,13. Enkelvoudige genetische veranderingen resulteren echter meestal niet in een snel optredende ESCC. Deze uitdaging is overwonnen met het gebruik van slokdarmcarcinogenen die de menselijke genetische laesies in ESCC14 goed samenvatten. Bijvoorbeeld, 4-nitroquinoline-1-oxide (4NQO) versnelt ESCC ontwikkeling in CCND1 transgene muizen15. In de afgelopen jaren zijn vermeende slokdarmepitheelstamcellen, voorlopercellen en hun respectieve lotgevallen onderzocht in cellijn-traceerbare muismodellen 3,4. Bovendien zijn deze cellijn-traceerbare muizen gebruikt om de cellen van oorsprong van ESCC te onderzoeken en hoe dergelijke cellen aanleiding geven tot CD44H CSC's via conventionele histologie en op omics gebaseerde moleculaire karakterisering7.

Een opkomend gebied gerelateerd aan deze muismodellen is de nieuwe toepassing van celkweektechnieken om levende ESCC- en voorlopercellen te analyseren in een driedimensionaal (3D) organoïde systeem waarin de architectuur van de oorspronkelijke weefsels ex vivo 7,8,9 wordt samengevat. Deze 3D-organoïden worden snel gekweekt uit een eencellige suspensie geïsoleerd uit muizenweefsels, waaronder primaire en gemetastaseerde tumoren (bijv. Lymfeklier-, long- en leverlaesies). De cellen zijn ingebed in keldermembraanextract (BME) en gevoed met een goed gedefinieerd serumvrij celkweekmedium. De 3D-organoïden groeien binnen 7-10 dagen en de resulterende bolvormige structuren zijn vatbaar voor subcultuur, cryopreservatie en testen voor het analyseren van een verscheidenheid aan cellulaire eigenschappen en functies, waaronder CSC-markers, EMT, autofagie, proliferatie, differentiatie en apoptotische celdood.

Deze methoden kunnen breed worden toegepast op 3D-organoïde culturen die zijn vastgesteld uit elk gestratificeerd plaveiselepitheelweefsel, zoals het hoofd- en nekslijmvlies (mondholte, tong, keelholte en strottenhoofd) en zelfs de voormaag. Het hoofd- en nekslijmvlies zijn aaneengesloten met de slokdarm en de twee weefsels delen een vergelijkbare weefselorganisatie, functie en vatbaarheid voor ziekten. Zowel hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) als ESCC delen genetische laesies en leefstijlgerelateerde omgevingsrisicofactoren zoals blootstelling aan tabak en alcohol. Om deze gelijkenis te onderstrepen, ontwikkelen muizen die zijn behandeld met de tabaksrook mimetische 4NQO gemakkelijk zowel HNSCC als ESCC. Gezien het gemak waarmee de hieronder beschreven protocollen kunnen worden toegepast op het modelleren van HNSCC, nemen we specifieke instructies op voor het vaststellen van 3D-organoïde culturen uit deze laesies.

Hierin bieden we gedetailleerde protocollen voor het genereren van murine oesofageale 3D-organoïden (MEO's) die normale, preneoplastische en ESCC-laesies vertegenwoordigen die zich ontwikkelen bij muizen die zijn behandeld met 4NQO. Verschillende muizenstammen kunnen worden gebruikt, waaronder veel voorkomende laboratoriumstammen zoals C57BL / 6 en cellijn-traceerbare en andere genetisch gemanipuleerde derivaten. We benadrukken de belangrijkste stappen, waaronder de isolatie van normaal of ziek muizenoesofageaal epitheel, de bereiding van eencellige suspensies, de teelt en monitoring van de groeiende 3D-organoïden, subcultuur, cryopreservatie en de verwerking voor latere analyses, inclusief morfologie en andere toepassingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De muizenexperimenten werden gepland en uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften en onder dierprotocol #AABB1502, beoordeeld en goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van Columbia University. De muizen werden gehuisvest in een goede dierenverzorgingsfaciliteit die de humane behandeling van muizen garandeert en passende veterinaire zorg voor de muizen en laboratoriumveiligheidstraining voor het laboratoriumpersoneel biedt.

1. Behandeling van muizen met 4NQO om slokdarm-IEN- en ESCC-laesies te induceren (tijdsoverweging: tot 28 weken)

OPMERKING: Om MEO's te genereren die neoplastische slokdarmlaesies vertegenwoordigen, worden de muizen onderworpen aan 4NQO-gemedieerde chemische carcinogenese zoals eerder beschreven door Tang et al.14. Normale/niet-neoplastische MEO's worden gegenereerd uit onbehandelde muizen.

  1. Muizen
    1. Huisvest vier tot vijf muizen per kooi en laat ze minstens 1 week wennen aan de dierfaciliteit voordat ze aan een experiment beginnen. Om de kans te verkleinen dat leeftijdsgerelateerde aandoeningen resulteren in voortijdige beëindiging van het volledige 28 weken durende experiment, begint u met muizen van 8 weken oud tot 16 weken oud.
      OPMERKING: C57BL/6 muizen met een gewicht van ongeveer 20-30 g werden gebruikt in dit protocol. Voor kortere experimenten kunnen oudere muizen worden gebruikt. Mannelijke of vrouwelijke muizen zijn acceptabel. Controlemuizen (geen behandeling, zie rubriek 1.3.1) moeten qua leeftijd en geslacht op elkaar worden afgestemd.
  2. Bereiding van drinkwater dat 4NQO bevat
    1. Bereid 1 mg/ml 4NQO stockoplossing in ethyleenpropyleenglycol (materiaaltabel). Los 100 mg 4NQO op in 100 ml 99,9% ethyleenpropyleenglycol in een glazen bekerglas van 500 ml bedekt met afdichtingsfilm. Meng grondig bij kamertemperatuur (RT) met behulp van een magneetroerder bij 800 rpm gedurende 30 min. Bewaren bij 4 °C.
    2. Voeg 900 ml geautoclaveerd gedeïoniseerd water toe aan 100 ml 1 mg/ml 4NQO-stamoplossing en meng door inversie in een 2 L plastic maatcilinder bedekt met afdichtingsfolie. Een volume van 1 L van 100 μg/ml 4NQO in 10% ethyleenpropyleenglycol zal twee muizenkooien bedienen die zijn uitgerust met een drinkfles van 500 ml.
      LET OP: Van belang is dat 4NQO een synthetisch chemisch carcinogeen is dat kanker kan veroorzaken. Hanteer met nitrilhandschoenen en een laboratoriumjas met lange mouwen en draag schoenen met gesloten teen. Denk aan goede oogbescherming, gezichtsbescherming en hoofdbedekking. Voor afvalverwijdering moet 4NQO in een geëtiketteerde container worden geplaatst in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor het beheer van gevaarlijk afval door milieugezondheid en -veiligheid.
  3. Behandeling met 4NQO en monitoring
    1. Bevestig de drinkfles en dien 4NQO via het drinkwater ad libitum toe aan de muizen gedurende 16 weken. Gebruik 10% (w/v) propyleenglycol als een medium (geen behandeling) controle.
      OPMERKING: Kortere duur van 4NQO-behandeling kan worden gebruikt om IEN te induceren.
    2. Vul het water eenmaal per week bij.
    3. Weeg elke muis wekelijks af door deze in een plastic container op een laboratoriumbalans te plaatsen.
    4. Begin aan het einde van de 4NQO-behandelingsperiode van 16 weken met het regelmatig geven van drinkwater aan de muizen tijdens de post-4NQO-observatieperiode gedurende maximaal 12 weken (figuur 1).
    5. Controleer de muizen dagelijks op tekenen van nood (bijv. Verminderde mobiliteit, gebogen habitus en teruggetrokken gedrag), dysfagie en uitdroging. Evalueer de muizen bovendien wekelijks op veranderingen in lichaamsgewicht of voedsel- en vloeistofinname. Als het lichaamsgewicht met meer dan 10% daalt ten opzichte van het oorspronkelijke lichaamsgewicht, voed de muizen dan met een vloeibaar voedingssupplement.
      OPMERKING: Een verlies van lichaamsgewicht ongevoelig voor vloeibare voedingssupplementen kan indicatief zijn voor ESCC, en muizen die meer dan 20% van hun lichaamsgewicht verliezen, moeten worden geëuthanaseerd. Belangrijk is dat MEO's kunnen worden gegenereerd uit voortijdig geëuthanaseerde muizen. Merk op dat C57BL/6-muizen zonder genetische modificaties doorgaans geen tekenen van morbiditeit vertonen of zichtbare ESCC-laesies hebben tot het einde van de post-4NQO-observatieperiode.
  4. Voorbereiding van dieren
    1. Euthanaseer de muizen in een CO 2-kamer gevuld met CO2 met een stroomsnelheid die 30% -70% van het kamervolume per minuut verplaatst. Bevestig de dood door cervicale dislocatie.
    2. Pin de ledematen en neus van de muis in rugligging vast aan het dissectieplatform met behulp van naalden van 21 G.
    3. Desinfecteer het ventrale oppervlak van de muis met 70% ethanol.
  5. Dissectie (tijdsoverweging: 0,5 uur)
    1. Open de huid door in de midabdominale vacht en huid te knijpen om ervoor te zorgen dat deze wordt bevrijd van de ingewanden eronder. Gebruik de chirurgische schaar om een craniocaudale, ventrale middellijnincisie te maken van de onderbuik naar de kin.
    2. Begin bij de middellijnincisie en gebruik een chirurgische schaar om radiale sneden te maken die zich uitstrekken tot de ledematen aan beide zijden van de muis. Flay de huid flapt open.
    3. Om de cervicale luchtpijp bloot te leggen, gebruikt u de ontleedschaar om de speekselklieren op de middellijn te verdelen. De luchtpijp ligt diep in de klieren.
    4. Om de thoracale luchtpijp bloot te leggen, verwijdert u het borstbeen.
      1. Knijp en til het peritoneum voorzichtig op met een tang en gebruik een schaar om het peritoneum craniocaudaal en lateraal langs de ribbenkast te verdelen.
      2. Trek de lever voorzichtig terug van het caudale oppervlak van het diafragma en gebruik een schaar om een kleine incisie in het diafragma te maken bij de sternale inkeping, met name aan het dorsale oppervlak van het xiphoid-proces. Hierdoor komen de long en het hart vrij van het viscerale borstvlies.
      3. Scheid de ribbenkast van de thoracale inhoud. Steek een schaar in de incisie in het middenrif en ontleed craniaal naar de cervicale gordel. Houd tijdens deze dissectie nauw aan het dorsale oppervlak van het borstbeen om schade aan de organen eronder te voorkomen. Zorg ervoor dat het vlak van dissectie zich buiten de luchtpijp bevindt.
      4. Knip de ribben aan weerszijden van het borstbeen met een schaar en verwijder het borstbeen. Zorg ervoor dat de thoracale inhoud wordt blootgesteld.
    5. Stel de buikslokdarm bloot. Til de maag voorzichtig anterieur op door het antrum met een tang vast te houden. Ontleed de milt, alvleesklier en mesenterium van de maag en slokdarm met een schaar.
    6. Stel de thoracale slokdarm bloot (figuur 2).
      1. Til de luchtpijp voorzichtig onmiddellijk caudaal op naar het schildklierkraakbeen en ontleed de slokdarm van de dorsale zijde van de luchtpijp met behulp van een irisschaar.
      2. Verdeel de luchtpijp bij het schildklierkraakbeen met een irisschaar.
      3. Pel de luchtpijp van de rest van de slokdarm via zorgvuldige dissectie in caudale richting.
      4. Verwijder de longen, het hart en de thymus massaal met de luchtpijp. Zorg ervoor dat u schade aan de slokdarm voorkomt bij het ontleden en verdelen van de aorta en vena cava.
    7. Verdeel de maag bij de pylorus met een schaar.
    8. Scheid de slokdarm van de wervel door het antrum met een tang vast te houden en craniaal te ontleden.
    9. Verdeel de slokdarm ter hoogte van het schildklierkraakbeen en oogst de slokdarm en maag massaal (figuur 3).
    10. Scheid de maag en de slokdarm door de slokdarm bij de cardia te verdelen (figuur 4, bovenpaneel, rode lijn).
    11. Ontleed elke fascia op het buitenoppervlak van de slokdarm. Om een monster te reserveren voor histologie (optioneel), verwijdert u de helft van de slokdarm en splitst u in de lengterichting met een schaar. Plaats de resterende intacte slokdarm in koude PBS op ijs.
    12. Open de maag langs de grotere kromming en was voldoende met PBS. Scheid de voormaag en was met koude PBS. Plaats de voormaag in koude PBS op ijs.
    13. Om de tong te oogsten, verwijdert u de naald van 21 G op de neus en trekt u de tong eruit met een pincet. Snijd de tong zo lang mogelijk. Plaats de tong in koude PBS op ijs.

2. Oprichting van muriene oesofageale organoïde (MEO) cultuur

OPMERKING: Dit protocol kan ook worden gebruikt om een murine tong organoïde cultuur vast te stellen met de toevoeging van een stap waarin het tongweefsel wordt gehakt vóór trypsinisatie. Zie de opmerking in stap 2.2.3.

  1. Bereiding van reagentia
    OPMERKING: Een lijst van reagentia is te vinden in de materiaaltabel. Bereid en bewaar de voorraadoplossingen volgens de instructies van de fabrikant, tenzij anders aangegeven.
    1. Zorg ervoor dat de aliquots voor eenmalig gebruik van de keldermembraanmatrix (BME) die in dit protocol worden gebruikt, worden opgeslagen bij −20 °C tot de dag van gebruik, vervolgens worden ontdooid op ijs of bij 2-8 °C en te allen tijde op ijs worden bewaard wanneer ze niet in gebruik zijn.
    2. Los 250 mg soja-trypsineremmer (soa) op in 1.000 ml PBS (250 mg / ml voorraadconcentratie) en filtersteriliseer het (0,22 μm). Doseer 50 ml aliquots in conische buizen en bewaar gedurende maximaal 6 maanden bij 4 °C.
    3. Bereid het muis organoïde medium (MOM): Supplement geavanceerde DMEM / F12 met 1 mM N-acetyl-L-cysteïne (NAC), 2% R-Spondin en Noggin geconditioneerd medium (RN CM), 1x N-2 supplement, 1x B-27 supplement, 10 mM HEPES, 1x antibioticum-antimycoticum, 1x GlutaMAX supplement en 100 ng / ml muis epidermale groeifactor (mEGF). Bereid de MOM 500 ml per keer, verdeel het in aliquots van 50 ml en bewaar bij 2-8 °C totdat het klaar is voor gebruik. Voeg vlak voor gebruik 0,5 μg/ml amfotericine B en 10 μM Y-27632 toe.
    4. Verwarm de MOM, 0,25% trypsine en soja-trypsineremmer (soa) voor gebruik voor op 37 °C in een water- of kralenbad.
  2. Isolatie van keratinocyten uit het ontleedde muizenweefsel (tijdsoverweging: 2 uur)
    1. Breng het slokdarmweefsel over in 500 μL dispase in PBS (2,5-5 eenheden totaal) en incubeer in een thermomixer gedurende 10 minuten bij 37 °C en 800 tpm.
    2. Breng het weefsel over in een kweekschaal en verwijder voorzichtig de spierlaag uit het epitheel met een tang (figuur 4).
      OPMERKING: Deze stap kan ook worden uitgevoerd door een ervaren onderzoekervoorafgaand aan incubatie met dispase.
    3. Breng het epitheel over in een microcentrifugebuis met 500 μL 0,25% trypsine en incubeer gedurende 10 minuten in een thermomixer bij 37 °C en 800 tpm.
      OPMERKING: Als het uitgangsmateriaal tongweefsel is, gehakt het weefsel dan met een steriel scalpel in kleinere stukjes, ongeveer 1-2 mm2 groot, voordat u de trypsine toevoegt.
    4. Centrifugeer kort gedurende 5-10 s op 2.000 x g om het weefsel te pelleteren. Bereid een conische buis van 50 ml voor met een celzeef van 100 μm. Breng de weefsel/celsuspensie met een brede boringspunt met cirkelvormige bewegingen door de zeef.
    5. Voeg 3 ml soa toe door de zeef, gebruik cirkelvormige bewegingen om te wassen.
    6. Schrob de zeef met de basis van een 1 ml tuberculinspuitzuiger om de cellen erdoorheen te duwen.
    7. Was de zeef 3-5 keer met 3 ml PBS en schrob de zeef met de basis van de spuit tussen de wasbeurten door.
    8. Centrifugeer de buis op 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om de cellen te pelleteren.
    9. Verwijder het supernatant en laat 1 ml oplossing in de buis achter.
    10. Resuspendeer de pellet in de resterende 1 ml en breng de celsuspensie door een 70 μm celzeef over in een nieuwe conische buis van 50 ml.
    11. Centrifugeer de buis op 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om de cellen te pelleteren.
    12. Resuspendeerde de pellet in 100 μL MOM; Pas het volume indien nodig aan. Voer een geautomatiseerd celgetal uit door trypan blue uit te sluiten.
  3. Zaaien van de initiële celsuspensie (tijdsoverweging: <1 uur)
    1. Verwarm een celkweekplaat met 24 putten in een incubator van 37 °C.
    2. Plaat 5.000 levensvatbare cellen in 75% (v/v) BME/MOM met 50 μL totaal volume per put. Maximaliseer het aantal putjes en bereid voldoende cellen voor in BME voor één extra put volgens de onderstaande voorbeeldberekeningen.
      OPMERKING: Cryopreserveer overtollige cellen in het cryopreservatiemedium (10% DMSO in FBS) bij een maximale concentratie van 1 x 106 cellen / ml. Bewaar de cryovialen een nacht in een vriesbak bij −80 °C. Breng ze over naar vloeibare stikstof in de dampfase voor langdurige opslag.
    3. Bereid in een microcentrifugebuis eerst een geschikte celverdunning in MOM voor en voeg vervolgens BME toe met behulp van een brede boringspunt vlak voor het plateren.
    4. Voeg met behulp van een 200 μL brede boringstip langzaam een druppel van 50 μL toe aan het midden van de put, waarbij contact tussen de punt en de bodem of zijkanten van de put wordt vermeden (figuur 5). Zorg ervoor dat u niet te veel kracht gebruikt om de vloeistof uit de punt te verdrijven, anders zal de koepel plat worden.
    5. Laat de BME 30 minuten stollen in een 37 °C, 5% CO2, 95% relatieve vochtigheid (RH) incubator.
    6. Voeg voorzichtig 500 μL MOM per put toe, aangevuld met 0,5 μg/ml amfotericine B en 10 μM Y-27632.
      OPMERKING: Voeg amfotericine toe aan alle MOM gedurende de initiële primaire cultuur. Voeg Y-27632 alleen toe op de dag van passeren (dag 0) voor alle passages.
    7. Verander de MOM op dag 3-4 en daarna elke 2-3 dagen totdat ze klaar zijn om over te gaan.
    8. Op dag 7-10, beeld de organoïden en meet de organoïde vormingssnelheid (OFR) door het aantal gevormde organoïden te delen door het aantal cellen dat aanvankelijk is gezaaid.
      Voorbeeld berekeningen:
      figure-protocol-1
  4. Passaging en cryopreservatie van muriene oesofageale organoïden (MEO's) (tijdsoverweging: <1,5 uur)
    1. Ontdooi en houd de BME op ijs. Verwarm MOM, 0,05% trypsine en soa voor gebruik tot 37 °C in een water- of kralenbad. Verwarm een celkweekplaat met 24 putten in een incubator van 37 °C.
    2. Gebruik een micropipetpunt met brede boring en verzamel de organoïden in de BME-koepel samen met het supernatant. Verstoor de BME door op en neer te pipetteren.
      OPMERKING: Combineer de putjes met identieke monsters in een enkele microcentrifugebuis.
    3. Centrifugeer kort gedurende 10-15 s op 2.000 x g om de organoïden te pelleteren. Verwijder het supernatant en gooi het weg.
    4. Maak de pellet voorzichtig los en resuspensie van de pellet in 500 μL van 0,05% trypsine.
    5. Incubeer de buis(sen) in een thermomixer bij 37 °C en 800 tpm gedurende 10 min.
    6. Inactiveer de trypsine met 600 μL soa.
    7. Centrifugeer de buis op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de cellen te pelleteren.
    8. Verwijder het supernatant en gooi het weg. Resuspendeerde de celkorrel in 100 μL MOM. Voer een geautomatiseerd celgetal uit door trypan blue uit te sluiten.
      OPMERKING: Het volume kan indien nodig worden aangepast.
    9. Plaat 2.000-5.000 levensvatbare cellen in 75% (v/v) BME/MOM met 50 μL totaal volume per put. Maximaliseer het aantal putjes dat is verguld en bereid voldoende cellen voor in BME voor één extra put volgens de eerder genoemde voorbeeldberekeningen.
      OPMERKING: Cryopreserveer overtollige cellen in het cryopreservatiemedium (10% DMSO in FBS) bij een maximale concentratie van 1 x 106 cellen / ml. Bewaar de cryovialen een nacht in een vriesbak bij −80 °C. Breng ze over naar vloeibare stikstof in de dampfase voor langdurige opslag.
    10. Bereid in een microcentrifugebuis eerst een geschikte celverdunning in MOM voor en voeg vervolgens BME toe met behulp van een brede boringspunt vlak voor het plateren.
    11. Voeg met behulp van een 200 μL brede boringstip langzaam een druppel van 50 μL toe aan het midden van de put, waarbij contact tussen de punt en de bodem of zijkanten van de put wordt vermeden. Zorg ervoor dat u niet te veel kracht gebruikt om de vloeistof uit de punt te verdrijven, anders zal de koepel plat worden.
    12. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten in een 37 °C, 5% CO 2,95% RH incubator.
    13. Voeg voorzichtig 500 μL MOM per put toe, aangevuld met 10 μM Y-27632.
      OPMERKING: Voeg Y-27632 alleen toe op de dag van overlijden (dag 0). Het is niet nodig om het toe te voegen tijdens de mediawijzigingen. Het toevoegen van amfotericine B is niet langer nodig.
    14. Verander de MOM op dag 3-4 en daarna elke 2-3 dagen totdat ze klaar zijn om over te gaan.
    15. Op dag 7-10, beeld de organoïden en meet de OFR.
  5. Ontdooien en herstel van de muriene oesofageale organoïden (MEO's) (tijdsoverweging: <1 uur)
    1. Ontdooi en houd de BME op ijs. Verwarm een celkweekplaat met 24 putten in een incubator van 37 °C.
    2. Bereid 10 ml koude of RT MOM of PBS in een conische buis van 15 ml.
    3. Ontdooi een cryoviaal in een waterbad of kralenbad van 37 °C gedurende ongeveer 30 s tot 1 minuut of totdat er een kleine ijskorrel overblijft.
    4. Breng met een voorbevochtigde pipetpunt de celsuspensie langzaam druppelsgewijs over naar de buis met MOM of PBS.
    5. Centrifugeer de buis gedurende 300 x g en 4 °C gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren.
    6. Verwijder het supernatant en gooi het weg. Resuspendeerde de celkorrel in 100 μL MOM; Pas het volume indien nodig aan. Voer een geautomatiseerd celgetal uit door trypan blue uit te sluiten.
    7. Plaat 5.000-10.000 levensvatbare cellen in 75% (v/v) BME/MOM met 50 μL totaal volume per put. Maximaliseer het aantal putjes en bereid voldoende cellen in BME voor op één extra put volgens eerder genoemde voorbeeldberekeningen.
    8. Ga verder met de resterende stappen van het protocol voor het passeren en cryopreservatie van muizenoesofageale organoïden (MEO) (zie stap 2.4.11).

3. Bereiding van organoïden voor paraffine-inbedding (tijdsoverweging: <1 uur [plus 1,5 uur voor reagensbereiding])

  1. Verzamel met behulp van een micropipetpunt met brede boring drie putjes per microcentrifugebuis. Verzamel de organoïden in de BME-koepel samen met het supernatant. Verstoor de BME door op en neer te pipetteren.
  2. Centrifugeer kort gedurende 10-15 s op 2.000 x g om de organoïden te pelleteren. Verwijder het supernatant en gooi het weg.
  3. Maak de pellet voorzichtig los en resuspensie van de pellet in 300 μL 4% paraformaldehyde (PFA).
  4. Fixeer de organoïden een nacht op 4 °C.
  5. Centrifugeer kort gedurende 10-15 s op 2.000 x g om de organoïden te pelleteren. Verwijder en gooi zoveel mogelijk PFA weg.
  6. Maak de pellet voorzichtig los en resuspensie de pellet in 500 μL PBS.
    OPMERKING: Vaste organoïden kunnen tot 2 weken bij 4 °C worden bewaard voordat u doorgaat naar de volgende stap.
  7. Bereid een voorraad agargel van 50 ml (2% agar plus 2,5% gelatine).
    OPMERKING: Bereid de agargelbouillon van tevoren voor, vanwege de incubatietijd, gevolgd door het uitvoeren van de autoclaafcyclus.
    1. Resuspendeer 1 g Bacto-agar en 1,25 g gelatine in 50 ml water in een autoclaveerbaar glazen bekerglas van 150 ml.
    2. Draai de suspensie en laat hem 30-60 minuten zitten bij RT.
    3. Autoclaaf gedurende 20 min bij 121 °C.
    4. Laat iets afkoelen en doseer 5 ml aliquots in conische buisjes van 15 ml.
    5. Maximaal 6 maanden bewaren bij RT.
  8. Bereid een inbeddingsoppervlak voor door een microcentrifugebuisrek om te keren en het oppervlak te bedekken met een vel afdichtingsfolie. Etiket met de bijbehorende organoïde ID('s).
  9. Centrifugeer de buis op 300 x g gedurende 5 minuten om de organoïden te pelleteren. Verwijder het supernatant en gooi het weg.
  10. Maak ondertussen de agargel vloeibaar door een conische buis van 15 ml met de agargel in een glazen bekerglas van 150 ml met 100 ml water te plaatsen en gedurende 1-2 minuten op de hoogste vermogensstand te microwaving of totdat het water begint te koken en de agargel zich in een vloeibare toestand bevindt.
    LET OP: Maak de dop van de conische buis met de agargel los voordat u deze in de magnetron zet.
  11. Dompel de microcentrifugebuis met de organoïde pellet gedeeltelijk onder in het warme water zonder water in de microcentrifugebuis te brengen.
  12. Bedek de organoïde pellet voorzichtig door 50 μL agar aan de zijkant van de buis toe te voegen.
  13. Zonder de pellet te verstoren (niet resuspend, houd de pellet intact), breng de pellet in de agargeldruppel over naar de afdichtingsfilm op het inbeddingsoppervlak.
  14. Herhaal stap 3.12 en stap 3.13 met nog eens 50 μL vloeibare agargel om eventuele resterende organoïde pellets te verzamelen en voorzichtig toe te voegen aan dezelfde geldruppel.
  15. Incubeer de druppel met de organoïde pellet gedurende 45 minuten bij 4 °C.
  16. Breng met behulp van een tang de druppel met de organoïde pellet voorzichtig over naar een gelabelde pathologiecassette.
  17. Bewaar de cassette in 70% ethanol bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.
  18. Ga verder met het inbedden van paraffine via routinematige histologische verwerking om paraffineblokken te bereiden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol beschrijft het proces van het genereren van murine oesofageale organoïden (MEO's) uit normaal slokdarmweefsel of ESCC-tumorweefsel van 4NQO-behandelde muizen volgens een specifiek behandelingsregime bestaande uit 16 weken 4NQO toegediend in drinkwater, gevolgd door een observatieperiode van 10 weken tot 12 weken (figuur 1). De muizen worden vervolgens geëuthanaseerd voor de dissectie van de tong of het slokdarmweefsel (figuur 2 en

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er zijn verschillende kritieke stappen en overwegingen voor het genereren en analyseren van MEO's in de hier beschreven protocollen. Om reproduceerbaarheid en striktheid in MEO-experimenten te garanderen, zijn biologische en technische replicaties beide belangrijk. Voor biologische replicaties zijn twee tot drie onafhankelijke muizen met ESCC over het algemeen voldoende per experimentele conditie. Het juiste aantal biologische replicaties kan echter variëren, afhankelijk van de parameters die in individuele onderzoeken m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Dankbetuigingen

We danken de Shared Resources (Flow Cytometry, Molecular Pathology, and Confocal &Specialized Microscopy) van het Herbert Irving Comprehensive Cancer Center aan de Columbia University voor technische ondersteuning. We danken Drs. Alan Diehl, Adam J. Bass en Kwok-Kin Wong (NCI P01 Mechanisms of Esophageal Carcinogenesis) en leden van de Rustgi en Nakagawa laboratoria voor nuttige discussies. Deze studie werd ondersteund door de volgende NIH-beurzen: P01CA098101 (H.N. en A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02

(J.G.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. en H.N.), en P30CA013696 (A.K.R.). H.N. en C.L. zijn ontvangers van de Columbia University Herbert Irving Comprehensive Cancer Center Multi-PI Pilot Award. H.N. is een ontvanger van de Fanconi Anemia Research Fund Award. F.M.H. is de ontvanger van de Mark Foundation for Cancer Research Award (20-60-51-MOME) en een American Association for Cancer Research Award. J.G. is de ontvanger van de American Gastroenterological Association (AGA) award.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.05% trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25-300-120
0.25% trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25-200-114
0.4% Trypan BlueThermo Fisher ScientificT10282
1 mL tuberculin syringe without needleBD309659
1.5 mL microcentrifuge tubeThermo Fisher Scientific05-408-129
100 µm cell strainerThermo Fisher Scientific22363549
15 mL conical tubesThermo Fisher Scientific14-959-53A
200 µL wide bore micropipette tipsThermo Fisher Scientific212361A
21 G needlesBD305167
24 well plateThermo Fisher Scientific12-556-006
4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO)Tokyo Chemical IndustryNO250
50 mL conical tubesThermo Fisher Scientific12-565-270
6 well plateThermo Fisher Scientific12556004
70 µm cell strainerThermo Fisher Scientific22363548
99.9% ethylene propylene glycolSK picglobal
Advanced DMEM/F12Thermo Fisher Scientific12634028
Amphotericin BGibco, Thermo Fisher Scientific15290018Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL
Antibiotic-AntimycoticThermo Fisher Scientific15240062Stock concentration 100x, final concentration 1x
B-27 supplementThermo Fisher Scientific17504044Stock concentration 50x, final concentration 1x
Bacto agarBD214010
CO2 incubator, e.g.Heracell 150iThermo Fisher Scientific51026406or equivalent
Countess II FL Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificAMQAX1000or equivalent
CryovialsThermo Fisher Scientific03-337-7D
DietGel 76AClear H2O72-07-5022
Dimethyl sulfoxide (DMSO)MilliporeSigmaD4540
DispaseCorning354235Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL
Dissecting scissorsVWR25870-002
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific14190250Stock concentration 1x
Fetal bovine serum (FBS)HyCloneSH30071.03
ForcepsVWR82027-386
Freezing containerCorning432002or equivalent
GelatinThermo Fisher ScientificG7-500
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Stock concentration 100x, final concentration 1x
HEPESThermo Fisher Scientific15630080Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM
Hot plate/stirrerCorningPC-420Dor equivalent
Lab Armor bead bath (or water bath)VWR89409-222or equivalent
Laboratory balanceOhaus71142841or equivalent
Matrigel basement membrane extract (BME)Corning354234
Microcentrifuge MinispinEppendorf22620100or equivalent
Microcentrifuge tube rackSouthern Labware0061
N-2 supplementThermo Fisher Scientific17502048Stock concentration 100x, final concentration 1x
N-acetylcysteine (NAC)Sigma-AldrichA9165Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM
Parafilm M wrapThermo Fisher ScientificS37440
Paraformaldehyde (PFA)MilliporeSigma158127-500G
Pathology cassetteThermo Fisher Scientific22-272416
Phase-contrast microscopeNikonor equivalent
Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF)Peprotech315-09-1mgStock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL
RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM)N/AN/AAvailable through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2%
Sorval ST 16R centrifugeThermo Fisher Scientific75004380or equivalent
Soybean trypsin inhibitor (STI)MilliporeSigmaT9128Stock concentration 250 µg/mL
ThermoMixer CThermo Fisher Scientific14-285-562 PMor equivalent
Y-27632Selleck ChemicalsS1049Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM

Referenties

  1. Rustgi, A. K., El-Serag, H. B. Esophageal carcinoma. The New England Journal of Medicine. 371 (26), 2499-2509 (2014).
  2. Dotto, G. P., Rustgi, A. K. Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics. Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).
  3. Giroux, V., et al. Long-lived keratin 15+ esophageal progenitor cells contribute to homeostasis and regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2378-2391 (2017).
  4. DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Reports. 9 (2), 701-711 (2014).
  5. Kinugasa, H., et al. Mitochondrial SOD2 regulates epithelial-mesenchymal transition and cell populations defined by differential CD44 expression. Oncogene. 34 (41), 5229-5239 (2015).
  6. Whelan, K. A., et al. Autophagy supports generation of cells with high CD44 expression via modulation of oxidative stress and Parkin-mediated mitochondrial clearance. Oncogene. 36 (34), 4843-4858 (2017).
  7. Natsuizaka, M., et al. Interplay between Notch1 and Notch3 promotes EMT and tumor initiation in squamous cell carcinoma. Nature Communications. 8 (1), 1758(2017).
  8. Whelan, K. A., Muir, A. B., Nakagawa, H. Esophageal 3D culture systems as modeling tools in esophageal epithelial pathobiology and personalized medicine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 461-478 (2018).
  9. Sachdeva, U. M., et al. Understanding the cellular origin and progression of esophageal cancer using esophageal organoids. Cancer Letters. 509, 39-52 (2021).
  10. Nakagawa, H., et al. The targeting of the cyclin D1 oncogene by an Epstein-Barr virus promoter in transgenic mice causes dysplasia in the tongue, esophagus and forestomach. Oncogene. 14 (10), 1185-1190 (1997).
  11. Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 278 (3), 1824-1830 (2003).
  12. Opitz, O. G., et al. A mouse model of human oral-esophageal cancer. The Journal of Clinical Investigation. 110 (6), 761-769 (2002).
  13. Stairs, D. B., et al. Deletion of p120-catenin results in a tumor microenvironment with inflammation and cancer that establishes it as a tumor suppressor gene. Cancer Cell. 19 (4), 470-483 (2011).
  14. Tang, X. -H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10, 301-313 (2004).
  15. Fong, L. Y. Y., Mancini, R., Nakagawa, H., Rustgi, A. K., Huebner, K. Combined cyclin D1 overexpression and zinc deficiency disrupts cell cycle and accelerates mouse forestomach carcinogenesis. Cancer Research. 63 (14), 4244-4252 (2003).
  16. Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440(2021).
  17. Hisha, H., et al. Establishment of a novel lingual organoid culture system: generation of organoids having mature keratinized epithelium from adult epithelial stem cells. Scientific Reports. 3, 3224(2013).
  18. Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
  19. Nguyen, N., et al. TGF-β1 alters esophageal epithelial barrier function by attenuation of claudin-7 in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunology. 11 (2), 415-426 (2018).
  20. Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes and Immunity. 15 (6), 361-369 (2014).
  21. Ruffner, M. A., et al. Toll-like receptor 2 stimulation augments esophageal barrier integrity. Allergy. 74 (12), 2449-2460 (2019).
  22. Kabir, M. F., et al. Single cell transcriptomic analysis reveals cellular diversity of murine esophageal epithelium. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
  23. Shimonosono, M., et al. Alcohol metabolism enriches squamous cell carcinoma cancer stem cells that survive oxidative stress via autophagy. Biomolecules. 11 (10), 1479(2021).
  24. Flashner, S., Yan, K. S., Nakagawa, H. 3D organoids: An untapped platform for studying host-microbiome interactions in esophageal cancers. Microorganisms. 9 (11), 2182(2021).
  25. Liu, K., et al. Sox2 cooperates with inflammation-mediated stat3 activation in the malignant transformation of foregut basal progenitor cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 304-315 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

3D-organoïdenorganoïdenkweektumoromgevingCRISPR-editinghigh-throughput screeningmuis-slokdarmweefselparaffinestortenceldissociatieorganoïdevorming
Modellering van oraal-oesofageaal plaveiselcelcarcinoom in 3D-organoïden
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.