Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Langetermijnkweek van individuele Caenorhabditis elegans op vaste media voor longitudinale fluorescentiemonitoring en aversieve interventies

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64682

⸱

2 december 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, Tucson

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om geïsoleerde individuele nematoden op vaste media te kweken voor levenslange fysiologische parametertracking en fluorescentiekwantificering. Dit kweeksysteem omvat een palmitinezuurbarrière rond putten met één worm om te voorkomen dat dieren vluchten, waardoor aversieve interventies mogelijk zijn, waaronder pathogene bacteriën en chemische stressoren.

Samenvatting

Caenorhabditis elegans worden veel gebruikt om verouderingsbiologie te bestuderen. De standaardpraktijk in C. elegans verouderingsstudies is het kweken van groepen wormen op vaste nematodengroeimedia (NGM), waardoor de efficiënte verzameling van gegevens op populatieniveau voor overleving en andere fysiologische fenotypen mogelijk is, en periodieke bemonstering van subpopulaties voor fluorescerende biomarkerkwantificering. Beperkingen van deze aanpak zijn het onvermogen om (1) individuele wormen in de loop van de tijd te volgen om leeftijdstrajecten te ontwikkelen voor fenotypes van belang en (2) fluorescerende biomarkers direct in de context van de kweekomgeving te monitoren. Alternatieve kweekbenaderingen gebruiken vloeibare cultuur of microfluïdica om individuele dieren in de loop van de tijd te volgen, in sommige gevallen inclusief fluorescentiekwantificering, met de afweging dat de kweekomgeving contextueel verschilt van vaste NGM. De WorMotel is een eerder beschreven microfabricated multi-well apparaat voor het kweken van geïsoleerde wormen op vaste NGM. Elke worm wordt bewaard in een put met vaste NGM omgeven door een gracht gevuld met kopersulfaat, een contactafweermiddel voor C. elegans, waardoor longitudinale monitoring van individuele dieren mogelijk is. We vinden kopersulfaat onvoldoende om te voorkomen dat wormen vluchten wanneer ze worden blootgesteld aan aversieve interventies die vaak voorkomen in verouderingsonderzoek, waaronder dieetbeperking, pathogene bacteriën en chemische agentia die cellulaire stress veroorzaken. De multi-well apparaten zijn ook gegoten uit polydimethylsiloxaan, dat hoge achtergrondartefacten produceert in fluorescentiebeeldvorming. Dit protocol beschrijft een nieuwe aanpak voor het kweken van geïsoleerde rondwormen op vaste NGM met behulp van in de handel verkrijgbare polystyreenmicrotrays, oorspronkelijk ontworpen voor humane leukocytenantigeenantigeen (HLA) typering, waardoor de overleving, fysiologische fenotypen en fluorescentie gedurende de levensduur kunnen worden gemeten. Een palmitinezuurbarrière voorkomt dat wormen vluchten, zelfs in de aanwezigheid van aversieve omstandigheden. Elke plaat kan tot 96 dieren kweken en past zich gemakkelijk aan verschillende omstandigheden aan, waaronder dieetbeperkingen, RNAi en chemische additieven, en is compatibel met geautomatiseerde systemen voor het verzamelen van levensduur- en activiteitsgegevens.

Inleiding

C. elegans zijn een krachtig modelorganisme voor onderzoek in de genetica, cellulaire biologie en moleculaire biologie, omdat ze gemakkelijk in het laboratorium kunnen worden gekweekt, een korte generatietijd en levensduur hebben, een hoge mate van eiwit homologie delen met zoogdieren en een transparante lichaamsstructuur hebben die in vivo visualisatie van fluorescerende eiwitten en kleurstoffen mogelijk maakt1. Als gevolg van het langdurige gebruik van C. elegans als een belangrijk modelsysteem op een reeks gebieden, waaronder ontwikkelingsbiologie en veroudering, zijn hun groei en ontwikkeling goed begrepen, is hun genoom volledig gesequenced en zijn er een groot aantal krachtige genetische hulpmiddelen gecreëerd, waaronder genoombrede RNAi-voedingsbibliotheken en duizenden mutante en transgene stammen. Historisch gezien worden C. elegans gekweekt als populaties op vaste agarnematodengroeimedia (NGM) en fenotypen worden handmatig geëvalueerd door directe observatie of door beeldvorming en downstream-analyse. Fluorescerende microscopie wordt gebruikt om een verscheidenheid aan moleculaire fenotypes vast te leggen met behulp van kleurstoffen of transgeen tot expressie gebrachte fluorescerende tags in individuele C. elegans. Fluorescerende beeldvorming omvat meestal het fixeren of verlammen van een dier op dia's met dunne agarose-pads, wat invasief en vaak dodelijk is. Het omvat ook het gebruik van chemicaliën, zoals levamisol of natriumazide, die mogelijk het moleculaire proces van belang kunnen verstoren 2,3. Samen maken deze benaderingen het mogelijk om cross-sectionele gegevens op populatieniveau te verzamelen over een breed scala aan fenotypen, maar maken ze het niet mogelijk om individuele dieren in de loop van de tijd te volgen.

In de afgelopen jaren zijn er verschillende benaderingen ontstaan om geïsoleerde C. elegans te cultiveren, waardoor onderzoekers dynamische veranderingen in fysiologische en moleculaire fenotypen van dieren in de loop van de tijd kunnen vastleggen met behulp van nieuwe beeldvormingstechnologieën. Een categorie van C. elegans cultuurbenadering is microfluïdica-apparaten, waaronder WormFarm4, de Nemalife-chip5 en de 'gedrags'-chip van Chronis et al.6, naast verschillende andere 7,8,9. Hieraan gerelateerd zijn op vloeistof gebaseerde kweekmethoden, die multi-well platen gebruiken om individuele wormen of kleine populaties in de loop van de tijd te karakteriseren10,11. Microfluïdica en microplaatsystemen bieden uitstekende kwantitatieve metingen van fenotypische reacties in C. elegans tot een enkel dier, maar de kweekomgeving vertoont een belangrijke beperking. De overgrote meerderheid van het eerdere onderzoek naar C. elegans, met name op het gebied van veroudering, is voltooid op vaste agar-gebaseerde media. Vloeibare cultuur zorgt ervoor dat C. elegans continu zwemmen en vertegenwoordigt een verschillende omgevingscontext die de onderliggende biologie kan veranderen. Dieren gekweekt in vloeibare media hebben bijvoorbeeld het vetgehalte en de genexpressie drastisch veranderd - met name voor genen die betrokken zijn bij de stressrespons - ten opzichte van dieren gekweekt op agar-gebaseerde vaste stof NGM12,13. Een alternatieve categorie van beeldvormingsmethoden voor één dier omvat polydimethylsiloxaan (PDMS) -apparaten die individuele dieren isoleren op vaste media, in een poging om de standaardomgeving die wordt ervaren door wormen gekweekt op vaste NGM in groepscultuur op petrischolen beter na te bootsen. De WorMotel is een 240-well PDMS-apparaat dat is ontworpen om individuele dieren op vaste media te kweken. Elke put is gevuld met een gemodificeerde NGM met behulp van laagsmeltende agarose in plaats van agar en bezaaid met bacterieel voedsel, waardoor een solide mediaomgeving ontstaat die vergelijkbaar is met het meest voorkomende kweeksysteem met petriplaten. De wanden van de put zijn rond, waardoor elk dier kan worden afgebeeld, ongeacht de locatie in de put (waardoor de visuele verduistering wordt vermeden die wordt veroorzaakt door een dier in de buurt van een muur in een plaat met meerdere putten). Kopersulfaat in een smalle gracht rond elke put wordt gebruikt als afschrikmiddel om dieren in hun putten te houden14,15. Een beperking van deze aanpak is dat het kopersulfaat niet effectief is in het voorkomen dat wormen vluchten wanneer aversieve omgevingsomstandigheden aanwezig zijn, waaronder dieetbeperking, pathogene bacteriën of chemicaliën die cellulaire stress veroorzaken (bijv. Paraquat).

Een tweede systeem dat vaste media gebruikt, is de Worm Corral, die een hydrogel gebruikt om een kleine afgesloten omgeving te creëren voor elke worm op een dia, waardoor langdurige monitoring van individueel geïsoleerde dieren mogelijk is16. Een belangrijke beperking is dat dieren als eieren in het milieu moeten worden verzegeld, waardoor het gebruik van steriele dieren vereist is om voortplanting te voorkomen en medicamenteuze behandelingen worden beperkt tot één enkele toepassing. Multi-dosis medicijnproeven kunnen worden bereikt in het WorMotel, hetzij door meerdere blootstellingsrondes uit te voeren voorafgaand aan het overbrengen van wormen naar het apparaat of door tijdens het experiment topisch extra geneesmiddelen aan de putten toe te voegen; In het laatste geval is de werkelijke blootstellingsdosis na het toevoegen van een extra medicijn aan een bestaande put echter moeilijk precies te kwantificeren en hangt het af van hoe snel het medicijn afbreekt. Zowel het WorMotel als de Worm Corral zijn uitstekend geschikt voor brightfield- of darkfield-beeldvorming om informatie vast te leggen met betrekking tot activiteit en dierfysiologie (bijv. Groei en ontwikkeling). Hoewel deze systemen kunnen worden gebruikt om fluorescentie te monitoren, is onze ervaring dat het PDMS dat wordt gebruikt om de andere beeldvormingstechnologieën met één worm te maken, gevoelig voor het vormen van microbubbels, het vastleggen van deeltjes en andere kleine afwijkingen die onregelmatige fluorescerende artefacten genereren die interfereren met consistente fluorescentievisualisatie en kwantificering, vooral in het emissiebereik voor GFP, de meest voorkomende fluorofoor die wordt gebruikt in C. elegans-onderzoek. Tot op heden is live fluorescentiebeeldvorming van C. elegans individuele dieren op een longitudinale manier voornamelijk afhankelijk van microfluïdica-apparaten17.

Hier beschrijven we een nieuwe methode voor het kweken van individuele C. elegans op vaste media die compatibel is met zowel aversieve interventies als directe fluorescerende beeldvorming. Deze aanpak is qua concept vergelijkbaar met andere beeldvormingstechnologieën met één worm, behalve dat de op maat gemaakte PDMS-chip wordt vervangen door in de handel verkrijgbare polystyreenmicrotrays die oorspronkelijk zijn ontwikkeld voor microcytotoxiciteitstests (ook vaak Terasaki-trays genoemd)18. Deze microtrays zijn voorzien van putten die kunnen worden gevuld met vaste media en bezaaid met bacterieel voedsel, waarbij de omgeving die dieren ervaren nauw wordt nagebootst volgens de standaard vaste NGM-cultuurmethodologie. Elke put is omgeven door een aversieve barrière van palmitinezuur in plaats van kopersulfaat. Palmitinezuur wordt vaak gebruikt om te voorkomen dat wormen vaste media ontvluchten, met behulp van standaard groepscultuur op petrischlaten in experimenten waarbij wormen worden uitgedaagd met een aversieve omgeving zoals dieetbeperking of blootstelling aan een chemische stressor. De microtrays produceren ook een minimale en consistente fluorescerende achtergrond, waardoor fluorescerende beeldvorming van dieren direct in hun kweekomgeving mogelijk is. Dit nieuwe op vaste agar gebaseerde kweeksysteem voor één dier maakt het niet alleen mogelijk om individuele dieren gedurende het hele leven te volgen en groei, ontwikkeling, activiteit en levensduur te volgen, maar is ook compatibel met directe fluorescerende microscopie. Omdat de wormen kunnen worden afgebeeld zonder verlamming of fixatie, kunnen in vivo fluorescentiebiomarkers longitudinaal worden gekwantificeerd in individuele dieren die op hun kweekmedia blijven, waardoor dynamische veranderingen gedurende de levensduur van elk dier kunnen worden waargenomen. Dit cultuursysteem is ook compatibel met de huidige generatie geautomatiseerde systemen voor het bijhouden van de levensduur en andere gezondheidsstatistieken14,19. We bieden een gedetailleerd protocol voor het kweken van individuele C. elegans in dit op microtrays gebaseerde systeem, bespreken mogelijke valkuilen en probleemoplossing en bespreken de voordelen en beperkingen ten opzichte van andere systemen, en in het bijzonder een bijgewerkt en geoptimaliseerd WorMotel-protocol15.

Elke kweekomgeving met één worm bestaat uit een microtray die in een standaard lade met één put is gemonteerd met behulp van een aangepaste 3D-geprinte adapter (figuur 1A). De putten zijn gevuld met laagsmeltende agarose-nematodengroeimedia (lmNGM), bezaaid met geconcentreerde bacteriën als voedselbron en omgeven door een palmitinezuurcoating om te voorkomen dat wormen vluchten (figuur 1B). De ruimte tussen de microtray en de wanden van de single-well plaat is gevuld met verzadigde waterkristallen om de luchtvochtigheid te handhaven (figuur 1B). Op het deksel van de tray wordt een reinigingscoating aangebracht om condensatie te voorkomen. Aan elke put wordt een enkele worm toegevoegd en de lade met één put wordt afgesloten met Parafilm om vocht te behouden en zuurstofuitwisseling mogelijk te maken. Tot zes microtrays kunnen redelijkerwijs parallel worden bereid door een enkele geoefende onderzoeker.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Recepten

OPMERKING: Bereid voorraadoplossingen voor voordat u begint met de voorbereiding van microtrayplaten.

  1. Voorraadoplossingen voor laagsmeltende agarose-nematodengroeimedia (lmNGM)
    1. Bereid 1 MK2 HPO4 door 174,18 g K2HPO4 op te lossen in 1 L steriel gedeïoniseerd water in een fles van 1 L. Autoclaaf de oplossing bij 121 °C, 15 psi, gedurende 30 minuten en bewaar deze bij kamertemperatuur (RT).
    2. Bereid 1 M KPi (pH 6,0) door 136,09 g KH2HPO4 op te lossen in 1 L steriel gedeïoniseerd water in een fles van 1 L. Titreer de oplossing met 1 M K2HPO4 om een pH van 6,0 te bereiken. Autoclaaf de oplossing bij 121 °C, 15 psig, gedurende 30 minuten en bewaar deze bij RT.
    3. Bereid 1 M CaCl 2 door 73,5 g CaCl2 op te lossen in 500 ml steriel gedeïoniseerd water in een fles van 500 ml. Autoclaaf de oplossing bij 121 °C, 15 psig, gedurende 30 min en bewaar deze bij RT
    4. Bereid 1 M MgSO 4 door 123,25 g MgSO4 op te lossen in 500 ml steriel gedeïoniseerd water in een fles van 500 ml. Autoclaaf de oplossing bij 121 °C, 15 psig, gedurende 30 minuten en bewaar deze bij RT.
    5. Bereid 3 M NaCl voor lmNGM: Combineer in een schone fles van 100 ml 100 ml ultrapuur water en 18,20 g NaCl. Autoclaaf bij 121 °C, 15 psig, gedurende 30 min.
    6. Bereid 5 mg / ml cholesterol door 2,5 g cholesterol, 275 ml 100% ethanol en 25 ml steriel gedeïoniseerd water in een amberkleurige fles van 500 ml te combineren. Autoclaaf de oplossing bij 121 °C, 15 psig, gedurende 30 minuten en bewaar deze bij RT.
    7. Bereid 50 mM fluorodeoxyuridine (FUdR) door 0,1231 g FUdR op te lossen in 10 ml steriel gedeïoniseerd water in een conische buis van 15 ml. Gebruik een spuit van 10 ml en een filter van 0,22 μm om de oplossing te steriliseren. Aliquoteer 1 ml van de oplossing elk in 10 microcentrifugebuizen en bewaar deze bij -20 °C.
    8. Bereid 50 mg/ml carbenicilline door 500 mg carbenicilline op te lossen in 10 ml steriel gedeïoniseerd water in een conische buis van 15 ml. Gebruik een spuit van 10 ml en een filter van 0,22 μm om de oplossing te steriliseren. Aliquoteer 1 ml van de oplossing elk in 10 microcentrifugebuizen en bewaar deze bij -20 °C.
    9. Bereid 1 mM isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) door 2,38 g IPTG op te lossen in 10 ml steriel gedeïoniseerd water in een conische buis van 15 ml. Gebruik een spuit van 10 ml en een filter van 0,22 μm om de oplossing te steriliseren. Aliquoteer 1 ml van de oplossing elk in 10 microcentrifugebuizen en bewaar deze bij -20 °C.
    10. Bereid 100 mg/ml ampicilline door 1 g ampicilline op te lossen in 10 ml steriel gedeïoniseerd water in een conische buis van 15 ml. Gebruik een spuit van 10 ml en een filter van 0,22 μm om de oplossing te steriliseren. Aliquot 1 ml van de 100 mg/ml ampicilline-oplossing elk in 10 microcentrifugebuizen en bewaar de buisjes bij -20 °C.
  2. Voorbereiding van nematodengroeimedia (NGM) voor algemeen onderhoud van C. elegans
    1. Om 50 platen te maken, lost u 10 g Bacto-agar, 1,5 g NaCl en 1,25 g Bacto-pepton op in 486 ml ultrapuur water in een kolf van 1 L. Steriliseer het medium door het te autoclaveren op een vloeistofcyclus bij 121 °C, 15 psig, gedurende ten minste 30 minuten.
    2. Laat het medium na de autoclaaf afkoelen tot 55 °C. Voeg vervolgens 12,5 ml 1 M KPi, 500 μl 1 M MgSO4, 500 μl 1 M CaCl2 en 500 μl 5 mg/ml cholesterol toe aan de oplossing.
    3. Giet met behulp van een steriele techniek 10 ml van het in stap 1.2.2 bereide medium in elke plaat van 60 mm (50 in totaal). Laat de platen met media minstens 30 minuten stollen. Pipetteer 300 μL van de 's nachts gekweekte bacteriecultuur op het midden van de plaat en laat de plaat op de bank liggen. Laat de cultuur drogen en dikker worden gedurende 1-2 dagen. Bewaar deze NGM-platen met bacteriën bij 4 °C.
  3. Bereiding van lmNGM-voormengsel
    1. Combineer in een erlenmeyer van 250 ml 2 g smeltarme agarose, 0,25 g pepton, 1 ml 3 M NaCl en 99 ml ultrapuur water. Autoclaaf de oplossing bij 121 °C, 15 psig, gedurende 30 min.
    2. Aliquot 10 ml lmNGM in reageerbuizen en dek af met Parafilm om verlies van vloeistof te voorkomen. Sluit de buizen af en laat ze afkoelen en stollen.
  4. Bereid 85 mM NaCl voor bacterieel voedsel: Combineer in een fles van 100 ml 515,61 mg NaCl en vul tot 100 ml met ultrapuur water. Autoclaaf bij 121 °C, 15 psig, gedurende 30 min.
  5. Bereid waterabsorberende polyacrylamidekristallen door 1 g type S superabsorberend polymeer op te lossen in 150 ml ultrapuur water in een autoclaveerbare knijpfles. Knip de punt om een voldoende doseermaat te garanderen. Autoclaaf bij 121 °C, 15 psig, gedurende 30 min, dop met tinfoil en schud om de kristallen te mengen.
  6. Bereid een reinigingsmiddeloplossing door 3 ml 100% Tween-20 te combineren met 7 ml ultrapuur water in een conische injectieflacon van 15 ml.
  7. Bereid 5 mg / ml cholesterol door 2,5 g cholesterol, 275 ml 100% EtOH en 25 ml ultrapuur water in een fles van 500 ml te combineren.
  8. Bereid palmitinezuur werkoplossing
    1. Maal 500 mg vast palmitinezuur in een vijzel en stamper en combineer het met 15 ml Tween-20 in een conische injectieflacon van 50 ml. Meng door vortexing, waarbij zoveel mogelijk van de kristallen worden opgelost.
    2. Voeg 17,5 ml 100% ethanol toe en vortex de oplossing om zoveel mogelijk palmitinezuur op te lossen.
    3. Voeg 17,5 ml ultrapuur water en vortex rigoureus toe. Verwarm de oplossing voorzichtig in een kralenbad op 80 °C totdat het palmitinezuur volledig is opgelost. Sommige palmitinezuur kan neerslaan tijdens het afkoelen.
  9. Bereid lysogene bouillon (LB) door 20 g LB-poeder te mengen in 1 L gedeïoniseerd water in een bekerglas van 1 L of groter. Aliquot 500 ml van de bouillon in twee bekers van 500 ml. Autoclaaf de bouillon bij 121 °C, 15 psig, gedurende 30 min. Bewaar de bereide bouillon bij RT.
  10. Bereiding van lysogenie bouillon (LB) agar platen
    1. Meng 10 g LB-poeder en 7,5 g Bacto-agar in 500 μL gedeïoniseerd water in een kolf van 1 L. Autoclaaf de oplossing op een vloeistofcyclus bij 121 °C, 15 psig, gedurende 30 minuten.
    2. Voeg indien gewenst optionele antibiotica (500 μL of 100 μg/ml ampicilline) toe nadat de geautoclaveerde media zijn afgekoeld tot 55 °C. Maak met behulp van een steriele techniek LB-agarplaten door 20 ml media in elke plaat van 100 mm te gieten (25 in totaal). Bewaar de borden bij 4 °C.

2. Het voorbereiden van een populatie van leeftijdsgesynchroniseerde wormen

  1. Bereid een populatie van leeftijdsgesynchroniseerde wormen voor die klaar zijn om toe te voegen aan de microtray in larvale stadium 4 (L4). Als alternatief kunnen wormen in elke levensfase worden toegevoegd (FUdR moet worden uitgesloten van de microtraymedia als wormen worden toegevoegd in een ontwikkelingsstadium eerder dan L4 om ontwikkelingsstilstand te voorkomen).
    OPMERKING: Deze stap moet 2 dagen voordat de wormen aan de microtray worden toegevoegd worden voltooid als de beoogde levensfase aan het begin van het experiment L4 is. De synchronisatietiming kan worden aangepast om de wormen de gewenste levensfase te laten bereiken.
  2. Temperatuur kan van invloed zijn op de levensduur. Gebruik voor consistente resultaten standaard NGM-platen (zie rubriek 1) om C. elegans op 20 °C te houden en breng wormen over op verse platen als ze weinig bacterieel voedsel bevatten.
  3. Gebruik van de stamplaten met veel jongvolwassen wormen een standaardbenadering om een leeftijdsgesynchroniseerde populatie te genereren, meestal20 bleken of getimede eieren leggen21.
  4. Isoleer de eieren en voeg ze toe aan een met bacteriën gevlekte NGM-plaat. Bij gebruik van wild-type C. elegans, zullen de eieren uitkomen en wormen vormen, waardoor het L4-larvale stadium in 2 dagen wordt bereikt.

3. Bereiding van bacteriecultuur

  1. De dag voor het begin van het experiment, ent u de gewenste bacteriële voedselbron. Bereid ~ 5 ml bacteriecultuur per plaat.
    OPMERKING: De bacteriële streep kan tot 1 maand van tevoren worden bereid en bij 4 °C worden bewaard voor E. coli-voedselbron.
    1. Streep bacteriën voor enkele kolonies op de LB-agarplaat van een bevroren glycerolvoorraad.
    2. Kweek de cultuur een nacht op 37 °C.
    3. Ent vloeibare LB-bouillon met een enkele kolonie per inenting.
    4. Schud bij ~250 rpm bij 37 °C gedurende 12-16 uur.

4. Palmitinezuurcoating aanbrengen op microtray

OPMERKING: Palmitinezuur dient als een aversieve barrière om het vluchten van dieren uit de individuele putten te voorkomen. De coating wordt aangebracht op het gehele bodemoppervlak van de microtray, met uitzondering van de binnenoppervlakken van de putten. Nystatine wordt toegevoegd aan het palmitinezuur om schimmelbesmetting te verminderen. Deze stap kan indien gewenst 1 dag voor de start van het experiment worden voltooid.

  1. Stel het kralenbad in op 80 °C om de tijd te geven om voor te verwarmen.
  2. Onmiddellijk voor gebruik, aliquoteer 1 ml van de palmitinezuurwerkoplossing per microtray in een afzonderlijke steriele container (meestal een conische injectieflacon van 15 ml) en voeg 4 μL van 10.000 eenheden / ml nystatine per 1 ml palmitinezuuroplossing toe vóór verhitting.
  3. Spuit binnen en buiten de microtray met ethanol (70% of meer) tot verzadiging en schud de overtollige ethanol af.
    OPMERKING: Resterende ethanol moet verdampen tijdens de behandeling in UV-crosslinking (stap 4.4).
  4. Gebruik een UV-crosslinker om de microtray te steriliseren (de volgende instructies zijn voor de UV-crosslinker die in dit onderzoek wordt gebruikt):
    1. Plaats de microtray en het deksel afzonderlijk in de UV-crosslinker (d.w.z. plaats de deksels niet op de platen, omdat UV niet in het plastic doordringt).
    2. Sluit de deur en zet de UV-crosslinker aan.
    3. Druk op Tijd, voer 20 minuten in en druk op Start.
    4. Draai na 20 minuten de plaat en het deksel om en herhaal stap 4.2.2-4.2.3.
    5. Plaats tijdens het dragen van handschoenen de deksels op de microtray om besmetting na sterilisatie te voorkomen.
  5. Meng de palmitinezuur werkoplossing grondig door vortexing en inverting.
  6. Plaats de conische injectieflacon van 15 ml met de palmitinezuurwerkoplossing in het kralenbad en laat eventuele zichtbare kristallen volledig oplossen voor gebruik.
  7. Plaats de microtray op de richel rond het kralenbad met de deksels erop gedurende ~ 2 minuten om op te warmen.
  8. Verwijder het deksel van de microtray. Voeg langzaam 200 μL palmitinezuur werkoplossing toe over de achterwand (lange zijde) van de microtray. Vervang de deksels en laat de microtray 2-3 minuten op het kralenbad zitten om de palmitinezuuroplossing over de bodem van de microtray te laten bezinken.
    OPMERKING: Hoewel de volledige bodem van de microtray pas in stap 4.10 volledig wordt gecoat, moet de oplossing zich gelijkmatig over meer dan de helft van het bodemoppervlak verspreiden. Als de palmitinezuuroplossing zich niet gelijkmatig verspreidt, schakelt u een vortex of trilmotor in de buurt van de microtray in. Dit zorgt voor een kleine hoeveelheid trillingen die kan helpen om de palmitinezuuroplossing gemakkelijker te verspreiden. Houd de deksels van de microtray op hun plaats om vervuiling te beperken.
  9. Herhaal stap 4.8.
    OPMERKING: Ongeveer de helft of meer van de bodem van de microtray moet zichtbaar bedekt zijn met het vloeibare palmitinezuur.
  10. Draai de microtray 180° en herhaal stap 4.8 en 4.9 aan de andere kant van de lade.
    OPMERKING: De bodem van de Terasaki-lade wordt pas bedekt met een dunne laag palmitinezuuroplossing nadat het volledige gecombineerde volume aan beide zijden is toegevoegd (stappen 4.9 en 4.10). Meer of minder palmitinezuurmengsel kan nodig zijn, afhankelijk van de bereiding van het mengsel, de temperatuur en andere factoren. Over het algemeen is tussen 400 en 800 μL van het palmitinezuurmengsel voldoende om de hele bodem van de microtray te bedekken. Zodra de bodem van de microtray zichtbaar bedekt is, mag er geen extra palmitinezuur worden toegevoegd, omdat dit de putten kan verontreinigen.
  11. Droog de tray in een steriele droogbox of laminaire flowkap gedurende ten minste 1 uur onbedekt. U kunt deze stap ook de dag voor het laden van de platen voltooien (sectie 5), waarbij u de microtray met het deksel erop bij RT gedurende ten minste 16 uur droogt.

5. Het laden van de microtray met laagsmeltende nematodengroeimedia (lmNGM)

OPMERKING: Deze methode gebruikt standaard NGM gemengd met laagsmeltende agarose in plaats van de gebruikelijke agar. Agar kan beginnen te gelen bij 45 °C. Bij het werken met de kleine volumes die nodig zijn om de microtrayputten te vullen, verstopt de op agar gebaseerde NGM vaak de pipetpunt en / of produceert ongelijke putoppervlakken als gevolg van snelle geleer. NGM met behulp van laagsmeltende agarose begint te gelen bij ~ 28 ° C, waardoor de gesmolten media gemakkelijk kunnen worden gepipetteerd en consequent platte putoppervlakken vormen. Bereid lmNGM voor op dezelfde dag dat de wormen op de microtray moeten worden geplaatst. Als u de microtray met lmNGM bereidt, met bacteriën zaait en de C. elegans allemaal binnen dezelfde dag laadt, zorg er dan voor dat de dieren op of in de buurt van de gewenste leeftijd zijn voordat u met deze reeks stappen begint.

  1. Plaats een pipetbak in een kralenbad van 80 °C om op te warmen.
  2. Smelt één 10 ml lmNGM-voormengsel per te bereiden microtray (stap 1.1) in de magnetron gedurende ~ 30-45 s.
    1. Plaats lmNGM voormengsel reageerbuizen in een bekerglas van 200 ml, onbedekt zodat ze niet omvallen.
    2. Na ~ 10-15 s, of wanneer het lmNGM-voormengsel net begint te borrelen, pauzeert u de magnetron, giet u het lmNGM-voormengsel in een steriele beker van 200 ml en hervat u het magnetrongebruik.
    3. Pauzeer indien nodig om te voorkomen dat het overkookt en draai om te mengen.
    4. Stop met microwaving zodra alle lmNGM is veranderd in vloeistof zonder brokken.
      OPMERKING: Een enkele aliquot van 10 ml is voldoende om in totaal 192 putjes (twee microtrays) te vullen.
  3. Bereid lmNGM door de volgende componenten in de vermelde volgorde toe te voegen aan de warme laagsmeltende agarose (volumes zijn per 10 ml agarose met lage smelt): 250 μL van 25 mM KPi (pH 6), 10 μL van 1 M CaCl2, 10 μL van 1 M MgSO4 en 10 μL van 5 mg / ml cholesterol
    1. Als de onderzoeker van plan is om volwassen dieren in de loop van de tijd te onderzoeken en reproductie moet voorkomen, voeg dan ook 10 μL van 50 mM FUdR toe.
    2. Als u een RNAi-voedingsexperiment uitvoert met behulp van de gemeenschappelijke HT115 RNAi E. coli-stam en bijbehorende RNAi-plasmiden, voeg dan ook 5 μL van 50 mg / ml carbenicilline toe (om het RNAi-plasmide te selecteren) en 12 μL van 1 mM IPTG (om expressie van het dubbelstrengs RNA uit het RNAi-plasmide te induceren).
      OPMERKING: Extra additieven kunnen worden opgenomen, afhankelijk van de selectieve antibiotica en andere chemicaliën die nodig zijn voor de gewenste voedselbron. Geneesmiddelen of chemische stressoren kunnen in dit stadium ook aan lmNGM worden toegevoegd. NGM en lmNGM bevatten dezelfde eindconcentratie NaCl, maar verschillen in de manier waarop de NaCl aan de media wordt toegevoegd. Voor NGM wordt alle NaCl toegevoegd tijdens de mediavoorbereiding (stap 1.2). Voor lmNGM wordt een deel van de NaCl toegevoegd tijdens de mediabereiding (stap 5.3) en een deel met het bacteriële voedsel (rubriek 6). De reden voor deze verandering komt voort uit het kleine mediavolume in elke microtrayput. Het toevoegen van 5 μL geconcentreerde bacteriën gesuspendeerd in LB aan een put met 20 μL media zal de voedingssamenstelling van de media aanzienlijk veranderen (door de componenten van LB met een vergelijkbaar volume toe te voegen). Om dit te voorkomen, wordt de bacterie in plaats daarvan geresuspendeerd in een oplossing van NaCl om de LB-componenten te verwijderen en osmotische stress op de bacteriën te voorkomen. De NaCl die aan de media wordt toegevoegd, wordt dienovereenkomstig gereduceerd om rekening te houden met het zout dat aan de bacteriën wordt toegevoegd.
  4. Giet lmNGM in het verwarmde pipetbassin.
  5. Met de microtray op een benchtop, pipetteer 20 μL lmNGM in elke microtray. Bedek de microtray bij het bijvullen van de pipet om verontreiniging tot een minimum te beperken.
    OPMERKING: Deze stap is eenvoudiger met een elektronische herhalende pipet.

6. De microtrayputten zaaien met bacterieel voedsel

OPMERKING: 5 μL 10x geconcentreerd voedsel uit een 's nachts geënte cultuur is voldoende om een enkele C. elegans gedurende de gehele levensduur te voeden.

  1. Breng de bacteriën over van de nachtcultuur naar een conische injectieflacon van 50 ml.
  2. Centrifugeer op ~3.500 x g gedurende 20 min.
  3. Verwijder het supernatant. Resuspendie van de bacteriecultuur in een concentratie van 10x (1/10 volume van de oorspronkelijke cultuur) met 85 mM NaCl-oplossing.
  4. Voordat u bacteriën aan de putten toevoegt, inspecteert u de microtray visueel om ervoor te zorgen dat de vaste lmNGM volledig in elke put zit. Als er lmNGM aan de zijkant van een put hangt, schraap dan het overtollige lmNGM eraf met een pipetpunt. Deze overtollige media kunnen ervoor zorgen dat het voedsel in palmitinezuur terechtkomt als het niet wordt opgeruimd.
  5. Pipetteer voorzichtig 5 μL van 10x geconcentreerde bacteriecultuur op het oppervlak van de lmNGM in elk putje. Probeer te voorkomen dat de bacteriecultuur over de zijkant van de put en in het palmitinezuur loopt, omdat dit wormen zal aantrekken om de put te verlaten.
  6. Laat de microtrays gedurende ~35 minuten drogen in een steriele droogdoos of laminaire flowkap. Controleer elke ~ 5 minuten en zorg ervoor dat u niet te droog bent. Verwijder wanneer een paar putjes zichtbaar licht nat zijn, omdat de putjes verder zullen drogen terwijl de aaltjes worden toegevoegd.

7. Elke microtray omsluiten in een plaat met één put

OPMERKING: In deze sectie wordt de microtray gemonteerd in een standaard single-well plaat met behulp van een aangepaste 3D-geprinte insert en omgeven door waterabsorberende kristallen. De single-well plaat wordt vervolgens gesloten en verzegeld met Parafilm. Dit maakt zuurstofuitwisseling mogelijk, terwijl verontreiniging wordt voorkomen en voldoende vochtigheid wordt gehandhaafd om te voorkomen dat de lmNGM uitdroogt in de loop van experimenten van meerdere weken (wormlevensduurexperimenten kunnen 6-8 weken duren als levensduurverlengende mutaties of omgevingsomstandigheden worden onderzocht). Zorg er tijdens de bereiding voor dat u de plaat bedekt wanneer er niet actief iets wordt toegevoegd om bacteriële of schimmelbesmetting te minimaliseren.

  1. Steriliseer een single-well plaat en 3D-geprinte adapter en deksel door elk in een 10% bleekoplossing te dompelen. Spoel grondig af met steriel DI-water. Veeg droog met een taakveeg.
  2. Spuit de single-well plaat en 3D-geprinte adapter en het deksel met 70% of meer ethanoloplossing en veeg schoon met een taakdoekje. Laat eventueel achtergebleven ethanol aan de lucht drogen.
    OPMERKING: UV-straling kan ook worden gebruikt na bleekmiddel en ethanol met dezelfde parameters als de microtray, zoals hierboven beschreven in stap 4.4.
  3. Plaats het steriele 3D-geprinte inzetstuk in een steriele plaat met één put.
  4. Steriliseer de buitenkant van de bereide microtray door deze te besproeien met 70% ethanol.
  5. Plaats de microtray in de 3D-geprinte adapter in de single-well plaat.
  6. Gooi het deksel van de microtray weg.
  7. Doseer royaal waterkristallen bovenop het 3D-geprinte inzetstuk tussen de buitenwand van de microtray en de binnenwand van de single-well plaat.
  8. Voeg onmiddellijk de wormen toe (rubriek 8) of sluit de microtray af om de volgende dag te gebruiken. Sluit het deksel van de lade en gebruik een enkel stuk Parafilm om alle vier de zijden te wikkelen om de microtray af te sluiten. Herhaal de afdichtingsstap met Parafilm nog twee keer voor een totaal van drie lagen.
  9. Na het verzegelen van de microtray, laat u deze maximaal 4 dagen op de bank bij RT liggen voordat u de wormen toevoegt (sectie 8).

8. Wormen toevoegen aan de microtray

OPMERKING: Eén worm kan handmatig aan elke put worden toegevoegd door dieren uit de leeftijdsgesynchroniseerde wormpopulaties (sectie 2) over te brengen met behulp van een platina pick. Breng dieren alleen over in de gewenste levensfase. Als het overdrachtsproces meer dan 1 uur duurt, kan de lmNGM in de microtrayputten uitdrogen. Het overbrengen van groepen van 10 tot 20 wormen tegelijk kan deze stap versnellen, maar het vergt enige oefening om consequent slechts één dier per put vrij te geven.

  1. Voeg één nematode per put toe zodra ze de gewenste levensfase hebben bereikt.
  2. Plaats het deksel terug over de microtray bij het plukken van wormen van de bronplaat om besmetting te minimaliseren.

9. Afwerking van de cultuuromgeving voor langdurig gebruik

OPMERKING: De onderstaande stappen worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de media en wormen in de microtray gehydrateerd blijven gedurende de duur van het experiment.

  1. Voeg ~ 40 μL van de reinigingsmiddeloplossing toe aan het deksel van een plaat met één put en gebruik een taakdoekje om het deksel gelijkmatig te bedekken. Deze coating voorkomt condensatie na verloop van tijd zodra de plaat is afgedicht. Gebruik extra taakdoekjes om de reinigingsmiddeloplossing te verspreiden totdat het zicht door het deksel niet wordt vervormd (dit duurt meestal ongeveer twee taakdoekjes).
  2. Onderzoek de waterkristallen om er zeker van te zijn dat ze beide op gelijke hoogte staan met de bovenrand van de microtray en niet overlopen. Voeg indien nodig waterkristallen toe aan of verwijder ze op de plaat.
  3. Gebruik de volgende aanpak en wikkel de tray met Parafilm (drie stuks in totaal) om ervoor te zorgen dat de Parafilm-afdichting langdurig meegaat.
    1. Rek het eerste stuk Parafilm iets uit om twee zijden van de lade te bedekken.
    2. Rek het tweede stuk Parafilm iets uit en bedek de overige zijden van de lade.
    3. Rek het laatste stuk Parafilm uit en wikkel alle vier de zijden van de lade volledig in, waarbij het eerste en tweede stuk Parafilm worden bedekt. Een goed afgesloten microtray kan ~ 2 maanden gehydrateerd blijven.
      OPMERKING: Controleer de integriteit van Parafilm elke 1-2 weken gedurende het experiment en vervang deze indien nodig.
    4. Veeg de bovenkant van de lade schoon met een taakdoekje, vochtig met 70% ethanol, om eventuele vingerafdrukken te verwijderen.
  4. Label de single-well plaat met tape. De microtray is nu klaar voor beeldvorming en langdurige opslag om wormen in de loop van de tijd te volgen. Houd de lade tussen de beeldsessies door op 20 °C. De microtray kan meerdere keren worden geopend en opnieuw worden verzegeld voor medicijndosering of andere procedures, maar moet worden geminimaliseerd om verontreiniging en vochtverlies te voorkomen.

10. Beeldvorming van individuele wormen in microtrayputten

OPMERKING: Het doel van dit protocol is om een gedetailleerde beschrijving te geven van hoe de microtraycultuuromgeving moet worden voorbereid. Eenmaal bereid en gevuld met wormen, kunnen de microtray single-worm kweekomgevingen worden gebruikt om vele fenotypen longitudinaal te monitoren met behulp van technieken die zijn vastgesteld voor standaardkweek op petrischolen. De volgende sectie bevat basisinstructies voor het meten van enkele veelvoorkomende fenotypen. Fluorescerende beeldvorming moet worden uitgevoerd in een rechtopstaande microscoop. Breking van licht door de Terasaki-lade wordt geminimaliseerd in een donkere kamer.

  1. Levensduur: Meet de levensduur door zachtjes op de zijkant of bovenkant van de plaat te tikken of een felblauw licht op de plaat te schijnen en elk dier te observeren. Scoor een dier "dood" als het niet binnen een paar seconden beweegt. Herhaal deze taak elke 1-3 dagen totdat alle wormen zijn gestorven.
    OPMERKING: De microtray-cultuuromgeving is compatibel met systemen die het verzamelen en analyseren van afbeeldingen automatiseren voor een schatting van de levensduur14,19.
  2. Standaard microscopie: Voer brightfield (of darkfield) beelden uit op individuele putjes of op de hele lade met een camera of scanner met hoge resolutie. Deze beeldvormingsgegevens kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan fenotypen, waaronder diergrootte 22,23,24, ontwikkeling 25, activiteit 14,19 en levensduur.
  3. Fluorescerende microscopie: Voer fluorescerende beeldvorming uit op enkele putten, handmatig of met een gemotoriseerd platformsysteem. De single-well trays zijn compatibel met standaard multi-well plaatadapters. Signaal-naar-ruis wordt geminimaliseerd als het apparaat in een zwartwandige doos wordt geplaatst.
    OPMERKING: Omdat de wormen worden afgebeeld terwijl ze vrij blijven om te kruipen, is dit kweeksysteem zeer geschikt voor beeldvorming met een lage resolutie om fluorescentie van het hele lichaam en ruwe weefsellokalisatie van fluoroforen vast te leggen. Hoge resolutie en hoge vergroting beeldvorming vereist meestal dat de dieren worden geïmmobiliseerd om beweging te voorkomen. Hoewel het mogelijk zou moeten zijn om een verlammend middel (bijv. natriumazide of levamisol) topisch op elke put aan te brengen en door te gaan met beeldvorming met een hogere resolutie, zou dit herhaalde metingen van dezelfde worm op latere tijdstippen uitsluiten. Het kweeksysteem, zoals beschreven, is ook niet bedoeld om omgekeerd te zijn, wat het gebruik van omgekeerde microscoopsystemen voorkomt.
    1. Als brightfield niet wordt gebruikt om de levensduur te meten en alleen fluorescentie wordt vastgelegd, meet dan de levensduur handmatig. Het blauwe licht (gebruikt voor GFP-excitatie) gedurende 5 s op de worm laten staan, zal het dier ertoe aanzetten om te bewegen. Als het dier niet binnen 5 s is verplaatst, beschouw het dier dan als dood.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De microtray-gebaseerde single-worm kweekomgeving die hier wordt beschreven, kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan fenotypen te volgen, waaronder levensduur en gezondheidsspanne, activiteit en beweging, lichaamsvorm en kruipgeometrie, en de expressie van transgeen tot expressie gebrachte fluorescerende biomarkers in individuele dieren in de loop van de tijd. Het microtray-kweeksysteem is compatibel met levensduuranalyse door middel van handmatige scoring of beeldverzameling en downstream beeldanalyse. Net als bi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier beschrijven we een nieuw kweeksysteem dat microtrays aanpast, oorspronkelijk ontwikkeld voor menselijke leukocytenantigeenweefseltyperingstests, om de isolatie en karakterisering van enkele C. elegans in de loop van de tijd mogelijk te maken in een solide mediaomgeving die contextueel vergelijkbaar is met de op agar gebaseerde NGM die de standaard is in C. elegans-onderzoek. Dit systeem is compatibel met een verscheidenheid aan interventies, waaronder dieetbeperking, exogene medicamenteuze behand...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs stellen dat ze geen belangenconflicten openbaar te maken hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door NIH R35GM133588 aan G.L.S., een NIHT32GM008659 trainingsbeurs aan L.E., een United States National Academy of Medicine Catalyst Award aan G.L.S., en het State of Arizona Technology and Research Initiative Fund beheerd door de Arizona Board of Regents.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3D-printed terasaki insertsCustom printing companyRobot_Terasaki_tray_insert_10-20
-2021.STL		FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament
AirClean systemen AC624LF verticale laminare stroom dampkapFisher Scientific36-100-4376
Bacto peptonThermo Scientific211677
CaCl2Acros organics349615000
Caenorhabditis elegans N2Caenorhabditis Genetics Center (CGC)N2Wildtype strain
CarbenicillinGoldbioC-103-25
CholesterolICN Biomedicals Inc101380
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50Standaard labratoriumvoeding voor C. elegans
EthanolMilliporeex0276-4
Fisher Vortex Genie 2Fisher ScientificG-560
FUdR Research Products InternationalF10705-1.0
Hydreringswaterkristallen M2 Polymer TechnologiesType SType S super absorberend polymeer
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)GoldBioI2481C100
K2HPO4Fisher ChemicalP288-500
KimwipesKimTech34155Task wipes
LB Broth, LennoxBD Difco240230
Leica K5 sCMOS monochroom cameraLeica Microsystems11547112
Leica M205 FCA Fluorescerende StereomicroscoopLeica Microsystems10450826
Low-melt agaroseResearch Products InternationalA20070-250.0
MgSO4 Fisher ChemicalM-8900
NaClFisher bioreagentsBP358-1
Nunc OmniTray Single-Well PlateThermo Scientific264728
NystatinSigmaN1538
Palmitic acidAcros organics129700010
PapierhanddoekenCoastwide Professional365374
Parafilm MParafilm16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400Stratagene400075UV crosslinker
Terasaki trays (Lambda)One Lambda151431
Thermolyne Dri-bathThermolyneDB28125
Tween Thermo ScientificJ20605-AP

Referenties

  1. Shaham, S. Methods in Cell Biology. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19784/ (2006).
  2. Boulin, T., et al. Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).
  3. Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress & Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).
  4. Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  5. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190(2020).
  6. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  7. Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. , Academic Press. Chapter 13 295-321 (2021).
  8. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  9. Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9 (1), 14340(2019).
  10. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496(2011).
  11. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745(2011).
  12. Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30(2017).
  13. Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562(2018).
  14. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652(2017).
  15. Turner, E., et al. Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
  16. Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
  17. Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. Light-microscopy methods in C. elegans research. Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).
  18. Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
  19. Freitas, S. Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. , Available from: https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628 (2021).
  20. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).
  21. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152(2009).
  22. Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape. PloS One. 8 (2), 57142(2013).
  23. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-17 (2013).
  24. Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), Taylor & Francis. 982437(2014).
  25. Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).
  26. Peters, M. J., et al. The transcriptional landscape of age in human peripheral blood. Nature Communications. 6 (1), 8570(2015).
  27. Sutphin, G. L., et al. Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity. Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).
  28. Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. Automation of C. elegans lifespan measurement. Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Kweek op vaste mediaindividuele wormtrackinglevensduurmetingpalmitinezuurbarri refluorescente biomarkersgezondheidsduuranalysegeautomatiseerde beeldvorming
Langetermijnkweek van individuele Caenorhabditis elegans op vaste media voor longitudinale fluorescentiemonitoring en aversieve interventies
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.