Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Co-fermentatie van Marsdenia tenacissima met Ganoderma lucidum en anti-longkanker Effect van de fermentatieproducten

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64687

⸱

16 december 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Minzu University of China, 2Ministry of Education, Key Laboratory of Ethnomedicine (Minzu University of China)

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol om een systematisch en uitgebreid co-fermentatiesysteem op te zetten om biotransformatieproducten te produceren die rijk zijn aan scherpe saponinen met behulp van Marsdenia tenacissima (Roxb.) Wight et Arn. (MT) als fermentatiemedium voor Ganoderma lucidum. Dit zal dienen als methodologische referentie voor de ontwikkeling van andere etnische drugs.

Samenvatting

Marsdenia tenacissima (Roxb.) Wight et Arn. (MT), als een traditioneel Chinees en Dai-kruidengeneesmiddel, heeft ontstekingsremmende, antibacteriële en antitumorale eigenschappen. De meeste van de belangrijkste werkzame stoffen zijn echter aglyconen, zoals tenacigenine A en tenacigenine B. Aangezien de biologische beschikbaarheid van MT laag is en de medicinale actieve componenten moeilijk te synthetiseren zijn, wordt het voornamelijk bestudeerd door biotransformatie. Deze studie heeft tot doel biotransformatieproducten te produceren die rijk zijn aan scherpe saponinen door MT te gebruiken als fermentatiemedium voor Ganoderma lucidum (G. lucidum).

Door de voorlopige screening van drie medicinale schimmels werd gevonden dat G. lucidum en Ophiocordyceps sinensis (O. sinensis) over het algemeen kunnen groeien in het medium voor MT; Daarom werd de werkzaamheid van de fermentatie van de twee soorten schimmels gescreend met behulp van een muismodel van longkanker. Uiteindelijk werd de co-fermentatie van G. lucidum en MT geselecteerd voor verder onderzoek. Niet-target metabolomics-analyse werd uitgevoerd op de producten van MT met G. lucidum co-fermentatie. We identificeerden 12 specifieke saponinen van MT uit de fermentatieproducten en verkregen een monomere verbinding, tenacigenine A, uit fermentatieproducten.

Het grootste deel van de tenacigenine vertoonde een significante opwaartse trend, via de niveaus van tenacigenine A en tenacigenine B. De resultaten toonden aan dat de werkzaamheid van MT verbeterde na fermentatie door G. lucidum. Bovendien was de biotransformatie van C21 steroïde glycosiden in MT de centrale reactie in dit fermentatieproces. Samenvattend heeft deze studie een systematisch en uitgebreid co-fermentatiesysteem en farmacodynamische evaluatiemethode voor MT vastgesteld, die niet alleen het volledige gebruik van effectieve werkzame stoffen in MT verbeterde, maar ook een methodologische referentie bood voor de ontwikkeling van andere etnische geneesmiddelen.

Inleiding

Longkanker behoort tot de categorie "longkarbonkel" in de traditionele Chinese geneeskunde. De pathogenese van longkarbonkel is een zwakte van de gezonde "Qi" van patiënten, onbalans van Yin en Yang, toxines en stagnatie in de longen, wat leidt tot longdisfunctie, bloedblokkade en vochtverlies in de longen. Langdurige bloedstasis en sputumtoxines in de longen vormen dus een longmassa1. Daarom is het versterken van de Qi en het elimineren van pathogene factoren het basisprincipe van de behandeling van longkanker. De methoden voor het voeden van Yin om Yin en Yang in evenwicht te brengen, het opruimen van warmte, het ontgiften en verspreiden van stagnatie, het aanvullen van Qi en het voeden van Yin, en het opruimen van slijm, worden gebruikt om de vorming van longkarbonkels te behandelen en te voorkomen2.

Marsdenia tenacissima (MT) is een geneeskrachtige plant die behoort tot de familie Asclepiadaceae (Marsdenia ssp.), ook bekend als Wuguteng. Het heeft de effecten van het opruimen van warmte en ontgifting, het verlichten van hoest en astma en heeft antitumorale eigenschappen3. Xiaoaiping-injectie, een preparaat gemaakt van een enkel kruid van MT, wordt veel gebruikt in klinieken en vertoont een goed therapeutisch antikankereffect4. Met de bevolkingstoename is de vraag naar MT echter sterk toegenomen. Dienovereenkomstig is de aanvoer van wilde MT-bronnen onvoldoende en is de kwaliteit van gekweekte medicinale materialen ongelijk. Er zijn problemen zoals slechte kwaliteit van kruidenmaterialen, onstabiel gehalte aan ingrediënten en lage biologische beschikbaarheid, die de ontwikkeling van MT ernstig bedreigen. Van deze bioactieve stoffen zijn saponinen uit MT uitvoerig onderzocht. Er zijn meer dan 100 saponinen uit MT geïdentificeerd; ze kunnen worden onderverdeeld in twee hoofdtypen: (1) C21 steroïde glycosiden in MT, waaronder tenacissoside A-P, marsdenoside A-M, tenacigenoside A-L en tenacigenine A-D. (2) Pentacyclische triterpenen, zoals oleanolzuur en ursolzuur. Veel studies hebben aangetoond dat de antikankeractiviteit van petroleumetherextracten hoger is dan de zeer polaire moleculen van MT. Daarom is het voordelig om het belangrijkste polysacharide van saponinen uit MT om te zetten in een andere kleine aglycon van MT met een hogere biologische beschikbaarheid en bioactiviteiten5.

Biotransformatie, ook bekend als biokatalyse, verwijst naar de fysiologische en biochemische reacties van de transformatie of structurele modificatie van exogene substraten door gebruik te maken van verwante enzymen in biologische systemen6. Het is zuiniger, veiliger, regionaal selectiever en stereoselectiever dan traditionele chemische synthese en kan sommige bioactieve stoffen produceren die moeilijk te bereiden zijn met conventionele synthetische chemie 7,8. Daarom is de ontwikkeling van traditionele Chinese geneeskunde en natuurlijke medicijnen essentieel bij het bevorderen van de modernisering en internationalisering van de traditionele Chinese geneeskunde.

Het co-fermentatiesysteem van MT is tot stand gekomen met behulp van biotransformatie. De oorspronkelijke medicinale materialen werden getransformeerd door microbiële enzymsystemen. Aan de ene kant werd het extract van MT gebruikt als substraat om de fermentatiecultuur van schimmels op deze manier te produceren. Tegelijkertijd verkortte schimmelfermentatie de kweekcyclus van bacteriën, verlaagde het de productiekosten en verbeterde het de productie-efficiëntie9. Aan de andere kant is de verhoogde precipitatie van actieve componenten door schimmelfermentatie gunstig, waardoor chemische componenten en een verbeterde werkzaamheid worden geproduceerd10. Het gebruik van vloeibare tweerichtingsfermentatietechnologie is nuttig om de actieve ingrediënten van medicinale materialen te beschermen, de werkzaamheid te verbeteren, medicijnbronnen te sparen en kan een betere effectiviteit produceren door technieken te bieden voor de structurele modificatie van actieve ingrediënten van kruidenmaterialen. Het is van groot belang om het moderniseringsniveau van de traditionele Chinese geneeskunde te verbeteren.

In deze studie werden G. lucidum, O. sinensis en Inonotus obliquus (I. obliquus) geselecteerd als de fermentatiemicro-organismen in het vroege stadium na het literatuuronderzoek, en werden de stammen voorlopig gescreend. Vervolgens werden de uiteindelijke fermentatiestammen bepaald door de werkzaamheid van de gescreende stammen te onderzoeken via het tumormuismodel. Ten slotte werden de primaire metabolieten en secundaire metabolieten van de fermentatieproducten systematisch geanalyseerd en geëvalueerd door LC-MS, en we verkregen een monomere verbinding, tenacigenine A, uit fermentatieproducten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd volgens de aanbevelingen van het Experimental Animal Center van Minzu University (nr. ECMUC2019008AA). Het protocol werd goedgekeurd door het Ethical Committee voor proefdieren van de Minzu University. MT werd verzameld in Kunming, in de provincie Yunnan.

1. Voorbereiding op het onderzoek

  1. Extract MT met heet water (100 °C; MT/water = 1/10, m/v) gedurende 30 minuten en vang het MT-extractieresidu op als testmateriaal.
  2. Onderhoud de LLC-longkankercellijn van muizen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum, 100 E/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine in een bevochtigde atmosfeer bij 37 °C onder 5% CO2.
  3. Bewaar de C57BL/6J-muizen, 6-8 weken oud en 19 ± 2 g wegend, in een milieugecontroleerde ruimte met een licht/donkercyclus van 12 uur/12 uur en met onbeperkte toegang tot voedsel en water. Desinfecteer ze regelmatig.

2. Voorlopige screening van stammen

  1. Inoculeer drie schimmelstammen met behulp van steriele technieken tot vast medium van aardappeldextrose-agar (PDA) en kweek ze in het donker bij 28 °C. Nadat de vaat volledig bedekt is met schimmels, bewaar je ze bij 4 °C.
  2. Inoculeer de in de vaste PDA-drager bewaarde stammen in de zaadoplossing van de schudkolf van de eerste fase en kweek ze bij 28 °C en schud ze gedurende 4-5 dagen bij 120 omw/min. Inoculeer de schimmelvloeistof van de eerste fase in de schudkolf met de secundaire schimmelvloeistof in een volumeverhouding van 1:20 in een schudder met constante temperatuur gedurende 4-5 dagen.
  3. Verdun de MT met water tot 100 mg/L (MT/water) en voeg de oplossing toe aan agar om een vast medium te vormen. Inoculeer 1 ml van de secundaire schimmelvloeistof van elk van de drie stammen in de vaste cultuur die alleen MT bevat, en verdeel vervolgens in G. lucidum-MT, I. obliquus-MT en O. sinensis-MT cultuursystemen. Plaats deze kweeksystemen op 28 °C zonder te schudden in het donker.
  4. Observeer na enige tijd de groei van de stammen in de bovenstaande drie kweeksystemen en selecteer de soorten die alleen met MT kunnen groeien voor verdere screening.

3. Herscreening van stamselectie

OPMERKING: Na voorlopige screening konden alleen G. lucidum en O. sinensis normaal groeien op een vast medium dat MT bevat. Om het systeem met een goed antitumoreffect verder te selecteren, werd de antitumorwerkzaamheid getest in een getransplanteerd tumormuismodel.

  1. Inoculeer G. lucidum en O. sinensis op een vloeibaar medium dat alleen MT-MT met G. lucidum co-fermentatie (MGF) en MT met O. sinensis co-fermentatie (MOF) bevat, en fermenteer gedurende 10 dagen bij 28 °C met schudden bij 180 rpm.
  2. Filtreer na de fermentatie het mycelium door gaas en droog het. Extract met 80% ethanol 3 x 12 uur.
  3. Controleer de antitumoractiviteit van het gefermenteerde en ongefermenteerde MT bij LLC-tumorceldragende C57BL/6J-muizen.
    1. Injecteer subcutaan LLC-cellen (1,0 × 106 cellen in 0,2 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) per muis) in de rechterflank van mannelijke C57BL/6J-muizen (behalve in de controlegroep).
    2. Om de succesvolle opstelling van het model te bevestigen, raakt u de tumorknobbeltjes aan en controleert u of ze ~5 mm groot zijn. Groepeer de tumordragende muizen (n = 10 per groep) willekeurig in de modelgroep, MGF-groep, MOF-groep, MT-groep en cisplatinegroep (positieve controle). Dien zoutoplossing toe aan de controlegroep (geen tumorcellen) en de modelgroep. Offer de muizen na 14 dagen behandeling en verzamel het tumorweefsel.

4. Analyse van de chemische samenstelling van fermentatieproducten

OPMERKING: Na verificatie van de werkzaamheid van fermentatie, werd G. lucidum geselecteerd als fermentatiestam in deze studie. We voerden metabolomics-analyse van MGF uit door middel van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS)11.

  1. Extraheer 10 mg MT, G. lucidum en MT met G. lucidum co-fermentatie (MGF) met 500 μL methanol: H2O (7:3), schud 1 minuut bij 4 °C, sonicaat gedurende 30 minuten en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 1.200 × g. Verzamel de supernatanten, filtreer ze door een polyvinylideenfluoridemembraan van 0,22 μm en injecteer ze in de vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie-opstelling (LC-MS/MS).
    OPMERKING: Ultra-performance vloeistofchromatografie (UPLC)-gescheiden metabolieten en een kwaliteitscontrole (QC) monsterbibliotheek werden geconstrueerd met behulp van massaspectrometrie met hoge resolutie (zie materiaaltabel).
  2. Gebruik de volgende UPLC-voorwaarden: een C18-kolom (100 mm x 2,1 mm; 8 μm), mobiele fase A-0,1% (v/v) mierenzuur in ultrapuur water, mobiele fase B-acetonitril. Stel het gradiënt-elutieprofiel in op 0 min 5% B; 2 min 5% B; 14 min 98% B; 17 min 98% B; 17.1 min 5% B; 20 min 5% bij een debiet van 0,3 ml/min.
  3. Detecteer en identificeer de metabolieten door middel van massaspectrometrie met hoge resolutie. Stel de kolomtemperatuur in op 40 °C, de temperatuur van de automatische injector op 4 °C en het injectievolume op 2 μL. Houd de volgende MS-voorwaarden aan: de spanning van de elektrospray-ionenbron: +5.500/-4.500 V; de druk van het gordijngas, ionenbron 1 en ionenbron 2: respectievelijk 35, 60 en 60 psi; de temperatuur van de ionenbron: 600 °C; het depolymerisatiepotentieel: ± 100 V.
  4. Bereid de kwaliteitscontrolemonsters (QC's) voor door gelijke hoeveelheden MT-, GL- en MGF-extracten te mengen en noem de drie replicaten respectievelijk QC 1-3. Verwerk en detecteer kwaliteitscontrole- en analysemonsters door dezelfde stappen te volgen. Voeg een QC-monster toe voor elke drie monsters om de herhaalbaarheid van detectie en analyse te onderzoeken.

5. Extractie en isolatie van fermentatieproducten

  1. Los het fermentatie-extract uit de fermentatiebouillon op in gedestilleerd water en roer goed door.
    OPMERKING: Hier werd 2 kg fermentatie-extract verkregen uit 40 L fermentatiebouillon.
  2. Elueer uit sectie 4 10%, 30%, 50%, 70% en 95% ethanolfracties met behulp van een macroporeuze adsorptieharskolom en verzamel de fracties.
    OPMERKING: Hier werd 10,72 g van de 95% ethanolfractie, 34,72 g van de 70% ethanolfractie, 61,57 g van de 50% ethanolfractie en 79,7 g van de 30% ethanolfractie verkregen.
  3. Op basis van de polariteit van de fracties, elueert u de 70% ethanolfractie met behulp van silicagelkolomchromatografie met ethylacetaat: methanol-elutie en verzamelt u de fracties.
    OPMERKING: Hier werden Fr. 1-Fr. 7 verzameld.
  4. Voer Sephadex LH-20 kolomchromatografie uit om de fracties verder te zuiveren (hier Fr. 3 en Fr. 4), gevolgd door semi-preparatieve scheiding van de vloeibare fase na zuivering met 1,0 g van elke fractie.
    OPMERKING: Door gebruik te maken van semi-preparatieve vloeistofchromatografie en silicagelkolomchromatografie, hebben we de 95% ethanolfractie geïsoleerd en gezuiverd.
  5. Voer microspectroscopie en nucleaire magnetische resonantiespectroscopie uit en vergelijk de structuur van de verbinding(en) met structuren uit databases voor 600M en 700M en bepaal de vlakke structuur van de verbinding(en).
    OPMERKING: Hier werd een hybride massaspectrometer gebruikt om het molecuulgewicht van het mengsel te bepalen. We hebben de structuur van één verbinding geïdentificeerd (zie aanvullende figuur S1).

6. Statistische analyses

  1. Herhaal alle fermentatie-experimenten zes keer. Beoordeel statistische significantie met behulp van de t-toets van de student. Druk alle gegevens uit als het gemiddelde ± SD, herhaal alle experimenten in drievoud en stel p < 0,05 in voor statistische significantie (*0,01 ≤ p ≤ 0,05, **0,001 ≤ p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001).
  2. Gebruik SCIEX OS-software om metabolieten te identificeren, voornamelijk op basis van massafouten, retentietijd, isotopenovereenkomst, MS/MS-bibliotheekzuiverheidsscore en computationele molecuulformule. Gebruik de volgende parameters voor bibliotheekinstellingen: massafout < 5 ppm, isotopenverhoudingsverschil < 20 en bibliotheekscore > 50.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Voorlopige screeningsresultaten van stammen
Om schimmels te onderzoeken die in staat zijn om samen met MT te fermenteren, hebben we drie schimmels geselecteerd: G. lucidum, I. obliquus en O. sinensis. Eerst werden de stammen geactiveerd: G. lucidum, I. obliquus en O. sinensis werden geïnoculeerd in het PDA-medium, zoals weergegeven in figuur 1A-C;

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Na experimenten met stamscreening ontdekten we dat niet alle medicinale schimmels normaal kunnen overleven op kruidenmateriaal. Zonder extra medium hangt het voortbestaan van medicinale schimmels af van de afbraak van de componenten in medicinale materialen via hun eigen enzymen om de benodigde koolstof- en stikstofbronnen te synthetiseren. Hieruit kan worden afgeleid dat I. obliquus mogelijk geen enzymen bevat die saponinen van MT kunnen afbreken. Voor G. lucidum en

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die van invloed zouden kunnen zijn geweest op het werk dat in dit artikel wordt gerapporteerd.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (81973977). De MT-monsters werden geïdentificeerd door professor Tongxiang-Liu en bewaard in de School of Pharmacy, Minzu University of China.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AcetonitrileTonguang Fine Chemicals Company, Beijing, China20200923
AgarSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd., USANO.20080107
AutoclaafBinJiang Medical Co., Ltd., Jiangyin, ChinaLS-50LD
constant shaking incubatorZhicheng Inc. Alle rechten voorbehouden., Shanghai, ChinaZWY-100D
Ganoderma lucidumBeNa Culture Collection, Beijing, China31732
Inonotus obliquusBeNa Culture Collection, Beijing, China117822
LLC Muis longkankercelNational Infrastructure of Cell Line Resource, Beijing, ChinaPUMC000673
Mannelijke C57BL/6J muizenVital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaNo.110011210107024684
MethanolTonguang Fine Chemicals Company, Beijing, China20210723
Ophiocordyceps sinensisBeNa Culture Collection, Beijing, China118371
Poly tetra fluorethyleenJinteng Experiment Equipment Co., Ltd., Tianjin, ChinaNo.997
QTRAP 5500 LC/MSAB Sciex Pte. Ltd., USACV20231711
RotorverdamperBUCHI Co., Ltd., Shanghai, ChinaR-300
SpuitZhiyu Medical Instrument Co., Ltd., Jinagsu, ChinaV500111
Ultra-schone werkbankBOXUN Medica Biological Instrument Co., Ltd., Shanghai, ChinaSW-CJ-LFD

Referenties

  1. Jansen, B. J., Liang, H., Ye, J. International Conference on Cognitive Based Information Processing and Applications (CIPA 2021). 85, Springer Nature. (2021).
  2. WANG, J., et al. Literature-based research on common syndromes of cough variant asthma). Chinese General Practice. , (2022).
  3. Meng, H., et al. Influence of different substrate and plant growth regulators on rooting of cutting of Marsdenia tenacissima. Journal of Yunnan Agricultural University. 29 (4), 540-543 (2014).
  4. Xing, W., Chen, B., Mi, H., Wu, Y. Textual research of Wuguteng. Zhong yao cai=Zhongyaocai=. Journal of Chinese Medicinal Materials. 26 (7), 524-526 (2003).
  5. Yin, C. Investigation of Polyoxypregnane Compounds Isolated from Marsdenia Tenacissima for the Anti-Cancer Activity and Circumvention of Multidrug Resistance. The Chinese University of Hong Kong. , Hong Kong. Doctoral Dissertation (2019).
  6. Singer, A. C., Crowley, D. E., Thompson, I. P. Secondary plant metabolites in phytoremediation and biotransformation). Trends in Biotechnology. 21 (3), 123-130 (2003).
  7. Bianchini, L. F., et al. Microbial biotransformation to obtain new antifungals. Frontiers in Microbiology. 6, 1433(2015).
  8. Pimentel, M. R., Molina, G., Dionísio, A. P., Maróstica Junior, M. R., Pastore, G. M. The use of endophytes to obtain bioactive compounds and their application in biotransformation process. Biotechnology Research International. 2011, 576286(2011).
  9. Hsu, B. Y., Lu, T. J., Chen, C. H., Wang, S. J., Hwang, L. S. Biotransformation of ginsenoside Rd in the ginseng extraction residue by fermentation with lingzhi (Ganoderma lucidum). Food Chemistry. 141 (4), 4186-4193 (2013).
  10. Wang, D., et al. Biotransformation of gentiopicroside by asexual mycelia of Cordyceps sinensis. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 17 (11), 3195-3197 (2007).
  11. Li, R., et al. Nontargeted metabolomics study and pharmacodynamic evaluation of bidirectional fermentation for Ganoderma lucidum with Marsdenia tenacissima. Frontiers in Pharmacology. , 4590(2022).
  12. Zhang, H., et al. Five new C21 steroidal glycosides from the stems of Marsdenia tenacissima. Steroids. 75 (2), 176-183 (2010).
  13. Deng, J., Liao, Z., Chen, D. Marsdenosides A-H, polyoxypregnane glycosides from Marsdenia tenacissima. Phytochemistry. 66 (9), 1040-1051 (2005).
  14. Xia, Z. -H., et al. Pregnane glycosides from the stems of Marsdenia tenacissima. Journal of Asian Natural Products Research. 6 (2), 79-85 (2004).
  15. Deng, J., Liao, Z., Chen, D. Three new polyoxypregnane glycosides from Marsdenia tenacissima. Helvetica Chimica Acta. 88 (10), 2675-2682 (2006).
  16. Hu, Y., et al. Mechanism of Marsdenia tenacissima extract promoting apoptosis of lung cancer by regulating Ca2+/CaM/CaMK signaling. Journal of Ethnopharmacology. 251, 112535(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

BiotransformatieproductenStero deglycosidenTenacigenine ASaponineverrijkingNon target MetabolomicsFarmacodynamische Evaluatie

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.